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1、大连理工大学 环境与生命学院细胞骨架的观察细胞骨架的观察大连理工大学 环境与生命学院生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室1.1.实验目的实验目的 熟悉免疫化学方法的原理及操作步骤。熟悉免疫化学方法的原理及操作步骤。掌握掌握考马斯亮蓝掌握掌握考马斯亮蓝R250R250染色法及观察细染色法及观察细胞内微丝的方法。胞内微丝的方法。掌握用间接免疫荧光法显示细胞内微管的掌握用间接免疫荧光法显示细胞内微管的方法。方法。大连理工大学 环境与生命学院生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室2. 2. 实验原理实验原理2.1 2
2、.1 免疫组织化学技术免疫组织化学技术 2.2 2.2 细胞骨架的观察细胞骨架的观察 大连理工大学 环境与生命学院生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室2.1 2.1 免疫组织化学技术免疫组织化学技术 免疫组织化学免疫组织化学免疫组织化学免疫组织化学( ( ( (ImmunochistochemistryImmunochistochemistryImmunochistochemistryImmunochistochemistry) ) ) ) 是利用免疫学抗原抗体反应是利用免疫学抗原抗体反应是利用免疫学抗原抗体反应是利用免疫学抗原抗体反应的原理，用带显
3、色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体的原理，用带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体的原理，用带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体的原理，用带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对组织细胞内特定抗原进行定性、定位反应和组织化学的呈色反应，对组织细胞内特定抗原进行定性、定位反应和组织化学的呈色反应，对组织细胞内特定抗原进行定性、定位反应和组织化学的呈色反应，对组织细胞内特定抗原进行定性、定位和定量研究的一项新技术，又称免疫细胞化学和定量研究的一项新技术，又称免疫细胞化学和定量研究的一项新技术，又称免疫细胞化学和定量研究的一
4、项新技术，又称免疫细胞化学( ( ( (immunocytochemistryimmunocytochemistryimmunocytochemistryimmunocytochemistry) ) ) )。 免疫组织化学技术具有特异性强、灵敏度高、定位准确和简便快速等免疫组织化学技术具有特异性强、灵敏度高、定位准确和简便快速等免疫组织化学技术具有特异性强、灵敏度高、定位准确和简便快速等免疫组织化学技术具有特异性强、灵敏度高、定位准确和简便快速等优点，又能够同形态、功能及代谢等研究结合起来，用以研究其它技优点，又能够同形态、功能及代谢等研究结合起来，用以研究其它技优点，又能够同形态、功能及代谢
5、等研究结合起来，用以研究其它技优点，又能够同形态、功能及代谢等研究结合起来，用以研究其它技术（如化学、生化、免疫及生理等）难以深入的领域。术（如化学、生化、免疫及生理等）难以深入的领域。术（如化学、生化、免疫及生理等）难以深入的领域。术（如化学、生化、免疫及生理等）难以深入的领域。 大连理工大学 环境与生命学院生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室免疫组织化学的过程免疫组织化学的过程 （1 1 1 1）抗原的提取与纯化；）抗原的提取与纯化；）抗原的提取与纯化；）抗原的提取与纯化； （2 2 2 2）免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体）免疫动物或
6、细胞融合，制备特异性抗体以及抗体）免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体）免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体 的纯化；的纯化；的纯化；的纯化； （3 3 3 3）将显色剂与抗体结合形成标记抗体；）将显色剂与抗体结合形成标记抗体；）将显色剂与抗体结合形成标记抗体；）将显色剂与抗体结合形成标记抗体； （4 4 4 4）标本的制备；）标本的制备；）标本的制备；）标本的制备； （5 5 5 5）免疫细胞化学反应以及呈色反应；）免疫细胞化学反应以及呈色反应；）免疫细胞化学反应以及呈色反应；）免疫细胞化学反应以及呈色反应； （6 6 6 6）观察结果。）观察结果。）观察结果。）观察结果。 大连
7、理工大学 环境与生命学院生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室免疫荧光法免疫荧光法 免疫荧光法分为直接法和间接法。免疫荧光法分为直接法和间接法。免疫荧光法分为直接法和间接法。免疫荧光法分为直接法和间接法。 直接法：直接法：直接法：直接法：将荧光素（最常用异硫氰酸荧光素、将荧光素（最常用异硫氰酸荧光素、将荧光素（最常用异硫氰酸荧光素、将荧光素（最常用异硫氰酸荧光素、FITCFITCFITCFITC）标记）标记）标记）标记在特异性抗体上，使其直接与细胞上相应抗原结合，在荧在特异性抗体上，使其直接与细胞上相应抗原结合，在荧在特异性抗体上，使其直接与细胞上相应
8、抗原结合，在荧在特异性抗体上，使其直接与细胞上相应抗原结合，在荧光显微镜下观察即可鉴定未知抗原。光显微镜下观察即可鉴定未知抗原。光显微镜下观察即可鉴定未知抗原。光显微镜下观察即可鉴定未知抗原。 间接法：间接法：间接法：间接法：将荧光素标记在第二抗体上，待一抗与细胞抗原将荧光素标记在第二抗体上，待一抗与细胞抗原将荧光素标记在第二抗体上，待一抗与细胞抗原将荧光素标记在第二抗体上，待一抗与细胞抗原结合后，再用标记了的二抗与一抗相接，从而显示未知抗结合后，再用标记了的二抗与一抗相接，从而显示未知抗结合后，再用标记了的二抗与一抗相接，从而显示未知抗结合后，再用标记了的二抗与一抗相接，从而显示未知抗原。间
9、接免疫荧光法中具有原。间接免疫荧光法中具有原。间接免疫荧光法中具有原。间接免疫荧光法中具有2 2 2 2对抗原、抗体系统。对抗原、抗体系统。对抗原、抗体系统。对抗原、抗体系统。大连理工大学 环境与生命学院生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室大连理工大学 环境与生命学院生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室2.2 2.2 细胞骨架的观察细胞骨架的观察 细胞骨架细胞骨架细胞骨架细胞骨架(cytoskeleton)(cytoskeleton)(cytoskeleton)(cytoskeleton)是真核细胞细胞质中
10、错综复杂的是真核细胞细胞质中错综复杂的是真核细胞细胞质中错综复杂的是真核细胞细胞质中错综复杂的蛋白质纤维网络，按纤维直径、组成成分和组装结构的不蛋白质纤维网络，按纤维直径、组成成分和组装结构的不蛋白质纤维网络，按纤维直径、组成成分和组装结构的不蛋白质纤维网络，按纤维直径、组成成分和组装结构的不同分为同分为同分为同分为微丝微丝微丝微丝(microfilaments(microfilaments(microfilaments(microfilaments，MFMFMFMF，5 5 5 57nm)7nm)7nm)7nm)、微管、微管、微管、微管(microtubule(microtubule(mic
11、rotubule(microtubule，MFMFMFMF，2020202025nm)25nm)25nm)25nm)和中等纤维和中等纤维和中等纤维和中等纤维(intermediate (intermediate (intermediate (intermediate filamentsfilamentsfilamentsfilaments，IFIFIFIF，8 8 8 811nm)11nm)11nm)11nm)。 目前观察细胞骨架的手段主要有电镜、间接免疫荧光技术、目前观察细胞骨架的手段主要有电镜、间接免疫荧光技术、目前观察细胞骨架的手段主要有电镜、间接免疫荧光技术、目前观察细胞骨架的手段主要
12、有电镜、间接免疫荧光技术、酶标、组织化学等。酶标、组织化学等。酶标、组织化学等。酶标、组织化学等。 大连理工大学 环境与生命学院生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室微丝的观察微丝的观察考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法 考马斯亮蓝考马斯亮蓝考马斯亮蓝考马斯亮蓝R250R250R250R250是一种普通的蛋白质染料，它可以使各种是一种普通的蛋白质染料，它可以使各种是一种普通的蛋白质染料，它可以使各种是一种普通的蛋白质染料，它可以使各种细胞骨架蛋白质着色，并非特异地显示微丝，但是由于有细胞骨架蛋白质着色，并非特异地显示微丝，但是由于有细胞骨架蛋白质着色，并非特异地
13、显示微丝，但是由于有细胞骨架蛋白质着色，并非特异地显示微丝，但是由于有些细胞骨架纤维在该实验条件下不够稳定，例如微管；还些细胞骨架纤维在该实验条件下不够稳定，例如微管；还些细胞骨架纤维在该实验条件下不够稳定，例如微管；还些细胞骨架纤维在该实验条件下不够稳定，例如微管；还有些类型的纤维太细，在光学显微镜下无法分辨，因此我有些类型的纤维太细，在光学显微镜下无法分辨，因此我有些类型的纤维太细，在光学显微镜下无法分辨，因此我有些类型的纤维太细，在光学显微镜下无法分辨，因此我们看到的主要是微丝组成的张力纤维，直径约们看到的主要是微丝组成的张力纤维，直径约们看到的主要是微丝组成的张力纤维，直径约们看到的主
14、要是微丝组成的张力纤维，直径约40nm40nm40nm40nm左右。左右。左右。左右。 实验中用实验中用实验中用实验中用1 1 1 1Triton XTriton XTriton XTriton X100100100100可抽提掉胞质中除骨架蛋白可抽提掉胞质中除骨架蛋白可抽提掉胞质中除骨架蛋白可抽提掉胞质中除骨架蛋白以外的其他蛋白，能清晰地显示微丝束。以外的其他蛋白，能清晰地显示微丝束。以外的其他蛋白，能清晰地显示微丝束。以外的其他蛋白，能清晰地显示微丝束。大连理工大学 环境与生命学院生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室微丝的观察微丝的观察荧光法荧光
15、法用荧光染料甲基罗丹明标记的鬼笔环用荧光染料甲基罗丹明标记的鬼笔环肽处理后，可在荧光显微镜下看到微肽处理后，可在荧光显微镜下看到微丝动态变化的图象。丝动态变化的图象。 大连理工大学 环境与生命学院生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室微管的观察微管的观察免疫组织化学法免疫组织化学法 用抗管蛋白的免疫血清用抗管蛋白的免疫血清用抗管蛋白的免疫血清用抗管蛋白的免疫血清( ( ( (一级抗体，例如兔抗管蛋白抗体一级抗体，例如兔抗管蛋白抗体一级抗体，例如兔抗管蛋白抗体一级抗体，例如兔抗管蛋白抗体) ) ) )与体外培养细胞一起温育，该抗体将与胞质中的微管与体外培
16、养细胞一起温育，该抗体将与胞质中的微管与体外培养细胞一起温育，该抗体将与胞质中的微管与体外培养细胞一起温育，该抗体将与胞质中的微管( ( ( (抗抗抗抗原原原原) ) ) )特异结合，然后再加荧光素标记的抗球蛋白抗体（二特异结合，然后再加荧光素标记的抗球蛋白抗体（二特异结合，然后再加荧光素标记的抗球蛋白抗体（二特异结合，然后再加荧光素标记的抗球蛋白抗体（二级抗体），例如异硫氰酸荧光素级抗体），例如异硫氰酸荧光素级抗体），例如异硫氰酸荧光素级抗体），例如异硫氰酸荧光素(FITC)(FITC)(FITC)(FITC)标记的羊抗兔抗体标记的羊抗兔抗体标记的羊抗兔抗体标记的羊抗兔抗体共同温育，该二级抗
17、体与一级抗体结合，从而使微管间接共同温育，该二级抗体与一级抗体结合，从而使微管间接共同温育，该二级抗体与一级抗体结合，从而使微管间接共同温育，该二级抗体与一级抗体结合，从而使微管间接地标上荧光素。置荧光显微镜下用一定波长激发光照射即地标上荧光素。置荧光显微镜下用一定波长激发光照射即地标上荧光素。置荧光显微镜下用一定波长激发光照射即地标上荧光素。置荧光显微镜下用一定波长激发光照射即由荧光所在显示出微管的形态和分布。由荧光所在显示出微管的形态和分布。由荧光所在显示出微管的形态和分布。由荧光所在显示出微管的形态和分布。大连理工大学 环境与生命学院生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室生物科学与工程
18、系细胞生物学实验教学研究室2.2.实验材料实验材料 、用品、用品 实验材料：实验材料：实验材料：实验材料：培养的培养的培养的培养的HelaHelaHelaHela细胞细胞细胞细胞 实验用品：实验用品：实验用品：实验用品： 实实实实验验验验器器器器材材材材：光光光光学学学学显显显显微微微微镜镜镜镜，荧荧荧荧光光光光显显显显微微微微镜镜镜镜，冰冰冰冰箱箱箱箱( ( ( (20202020及及及及4)4)4)4)，小小小小型型型型振振振振荡荡荡荡器器器器，温温温温箱箱箱箱，细细细细胞胞胞胞培培培培养养养养设设设设备备备备；平平平平皿皿皿皿，直直直直径径径径30mm30mm30mm30mm小小小小染染
19、染染缸缸缸缸，载载载载玻玻玻玻片片片片，盖玻片，铝盒等。盖玻片，铝盒等。盖玻片，铝盒等。盖玻片，铝盒等。 主要试剂主要试剂主要试剂主要试剂 M M M M缓冲液，缓冲液，缓冲液，缓冲液，1%Triton X1%Triton X1%Triton X1%Triton X100100100100（用（用（用（用M M M M缓冲液配制），缓冲液配制），缓冲液配制），缓冲液配制），0.2%0.2%0.2%0.2%考马考马考马考马斯亮蓝斯亮蓝斯亮蓝斯亮蓝R250R250R250R250，3.0%3.0%3.0%3.0%戊二醛（用戊二醛（用戊二醛（用戊二醛（用0.2mol/L0.2mol/L0.2mol/
20、L0.2mol/L磷酸盐缓冲液配制），磷酸盐缓冲液配制），磷酸盐缓冲液配制），磷酸盐缓冲液配制），3.7%3.7%3.7%3.7%甲醛甲醛甲醛甲醛PEMDPEMDPEMDPEMD，甲基罗丹明，甲基罗丹明，甲基罗丹明，甲基罗丹明鬼笔环肽染液。鬼笔环肽染液。鬼笔环肽染液。鬼笔环肽染液。 PEMPEMPEMPEM缓冲液，缓冲液，缓冲液，缓冲液，PEMPPEMPPEMPPEMP缓冲液，缓冲液，缓冲液，缓冲液，PEMDPEMDPEMDPEMD缓冲液，缓冲液，缓冲液，缓冲液， 兔抗管蛋白血清（一抗）兔抗管蛋白血清（一抗）兔抗管蛋白血清（一抗）兔抗管蛋白血清（一抗），FITC-FITC-FITC-FITC-
21、羊抗兔抗体（二抗），甘油羊抗兔抗体（二抗），甘油羊抗兔抗体（二抗），甘油羊抗兔抗体（二抗），甘油-PBS(9:1-PBS(9:1-PBS(9:1-PBS(9:1，pH 8.5-9.0)pH 8.5-9.0)pH 8.5-9.0)pH 8.5-9.0)。大连理工大学 环境与生命学院生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室4.4.实验步骤实验步骤微丝的观察微丝的观察微丝的观察微丝的观察考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法 细胞培养在平皿中的盖玻片上，生长密度达细胞培养在平皿中的盖玻片上，生长密度达细胞培养在平皿中的盖玻片上，生长密度达细胞培养在平
22、皿中的盖玻片上，生长密度达+时，取出盖玻片，用时，取出盖玻片，用时，取出盖玻片，用时，取出盖玻片，用PBSPBSPBSPBS洗洗洗洗3 3 3 3次。次。次。次。 用用用用1%Triton X1%Triton X1%Triton X1%Triton X100100100100处理处理处理处理2525252530 min30 min30 min30 min，室温或，室温或，室温或，室温或37373737均可。均可。均可。均可。 立即用立即用立即用立即用M M M M缓冲液轻轻洗细胞缓冲液轻轻洗细胞缓冲液轻轻洗细胞缓冲液轻轻洗细胞3 3 3 3次。次。次。次。 略晾干后，用略晾干后，用略晾干后，用
23、略晾干后，用3%3%3%3%戊二醛固定细胞戊二醛固定细胞戊二醛固定细胞戊二醛固定细胞5-15 min5-15 min5-15 min5-15 min。 PBSPBSPBSPBS洗数次，滤纸吸干。洗数次，滤纸吸干。洗数次，滤纸吸干。洗数次，滤纸吸干。 用用用用0.2%0.2%0.2%0.2%考马斯亮蓝考马斯亮蓝考马斯亮蓝考马斯亮蓝R250R250R250R250染片染片染片染片30min-1h30min-1h30min-1h30min-1h。然后小心用水冲洗，蒸馏水冲洗，。然后小心用水冲洗，蒸馏水冲洗，。然后小心用水冲洗，蒸馏水冲洗，。然后小心用水冲洗，蒸馏水冲洗，空气中略干燥。空气中略干燥。空
24、气中略干燥。空气中略干燥。 普通光学显微镜下用普通光学显微镜下用普通光学显微镜下用普通光学显微镜下用40404040物镜或油镜观察。物镜或油镜观察。物镜或油镜观察。物镜或油镜观察。大连理工大学 环境与生命学院生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室4. 4. 实验步骤实验步骤 细胞培养在平皿中的盖玻片小条上，当细胞生长密度达细胞培养在平皿中的盖玻片小条上，当细胞生长密度达细胞培养在平皿中的盖玻片小条上，当细胞生长密度达细胞培养在平皿中的盖玻片小条上，当细胞生长密度达+(+(+(+(约约约约70%70%70%70%80%)80%)80%)80%)时取出放进
25、小染缸中，用时取出放进小染缸中，用时取出放进小染缸中，用时取出放进小染缸中，用PBSPBSPBSPBS清清冲洗。清清冲洗。清清冲洗。清清冲洗。 3.7%3.7%3.7%3.7%甲醛甲醛甲醛甲醛PEMDPEMDPEMDPEMD室温固定室温固定室温固定室温固定10 min10 min10 min10 min，用，用，用，用PBSPBSPBSPBS洗去固定液后，略干燥洗去固定液后，略干燥洗去固定液后，略干燥洗去固定液后，略干燥再放人预冷的再放人预冷的再放人预冷的再放人预冷的 20202020丙酮中再固定丙酮中再固定丙酮中再固定丙酮中再固定3 3 3 35 min5 min5 min5 min，取出略
26、干燥。，取出略干燥。，取出略干燥。，取出略干燥。 在清洁的载玻片上滴加在清洁的载玻片上滴加在清洁的载玻片上滴加在清洁的载玻片上滴加20202020 l l l l染液，将盖玻片上的细胞样品反扣其染液，将盖玻片上的细胞样品反扣其染液，将盖玻片上的细胞样品反扣其染液，将盖玻片上的细胞样品反扣其上，放人湿盒内，置暗处室温下染色上，放人湿盒内，置暗处室温下染色上，放人湿盒内，置暗处室温下染色上，放人湿盒内，置暗处室温下染色2020202025 min25 min25 min25 min。然后用。然后用。然后用。然后用PBSPBSPBSPBS洗洗洗洗3 3 3 3次，次，次，次，无离子水洗无离子水洗无离
27、子水洗无离子水洗2 2 2 2次，略干燥后甘油次，略干燥后甘油次，略干燥后甘油次，略干燥后甘油PBSPBSPBSPBS封片。封片。封片。封片。 荧光显微镜下观察结果，用绿光激发。荧光显微镜下观察结果，用绿光激发。荧光显微镜下观察结果，用绿光激发。荧光显微镜下观察结果，用绿光激发。微丝的观察微丝的观察微丝的观察微丝的观察甲基罗丹明甲基罗丹明甲基罗丹明甲基罗丹明鬼笔环肽法鬼笔环肽法鬼笔环肽法鬼笔环肽法大连理工大学 环境与生命学院生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室4. 4. 实验步骤实验步骤细胞培养在盖玻片上，长到细胞培养在盖玻片上，长到+时取出，用时取
28、出，用3737预温的预温的PEMPPEMP缓冲液轻轻漂洗细胞。缓冲液轻轻漂洗细胞。0.50.5Triton X-100/PEMPTriton X-100/PEMP溶液预温到溶液预温到3737，处理细胞，处理细胞1 15 52min2min。用用PEMPPEMP缓冲液洗细胞缓冲液洗细胞2 2次。次。用用3.7%3.7%甲醛甲醛PEMDPEMD溶液室温下固定细胞溶液室温下固定细胞30 min30 min，PBSPBS洗两次，用洗两次，用滤纸吸干多余的液体。滤纸吸干多余的液体。抗管蛋白抗体用抗管蛋白抗体用0.3% Triton X-100/PBS0.3% Triton X-100/PBS稀释成稀释成
29、1:41:4、1:81:8、1:161:16等不同浓度，分别滴加约等不同浓度，分别滴加约4040L L在细胞上，将此长满细胞的盖玻片反在细胞上，将此长满细胞的盖玻片反扣在清洁的载玻片上，放在铺有湿纱布的铝盒内，密闭，扣在清洁的载玻片上，放在铺有湿纱布的铝盒内，密闭，3737温育温育1 h1 h。微管的观察微管的观察微管的观察微管的观察大连理工大学 环境与生命学院生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室取出样品，放取出样品，放35mm35mm小染色缸内，按下列顺序洗涤，以除去残余的小染色缸内，按下列顺序洗涤，以除去残余的抗血清：抗血清：PBS1%Trito
30、n XPBS1%Triton X100/PBSPBS100/PBSPBS。每次洗。每次洗5min5min，可以放，可以放在小型振荡器上轻轻振荡洗涤。然后取出样品，用滤纸吸去水分，在小型振荡器上轻轻振荡洗涤。然后取出样品，用滤纸吸去水分，略干燥。略干燥。在细胞面上滴加在细胞面上滴加40 40 L L左右左右FITC-FITC-羊抗兔抗体羊抗兔抗体( (用前仍以用前仍以0.3%Triton X0.3%Triton X100/PBS100/PBS稀释成稀释成1:41:4或或1:8)1:8)。同步骤。同步骤5 5放放3737温育温育1 h1 h。同步骤同步骤6 6洗涤细胞，无离子水洗样品二次。洗涤细胞
31、，无离子水洗样品二次。略干燥后，用甘油略干燥后，用甘油-PBS(9:1)-PBS(9:1)封片。置荧光显微镜下观察，蓝光封片。置荧光显微镜下观察，蓝光激发，外加阻断滤片激发，外加阻断滤片K530K530。先用低倍镜观察，后转油镜观察。先用低倍镜观察，后转油镜观察。微管的观察微管的观察微管的观察微管的观察大连理工大学 环境与生命学院生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室考马斯亮蓝显示细胞微丝考马斯亮蓝显示细胞微丝考马斯亮蓝显示细胞微丝考马斯亮蓝显示细胞微丝5. 5. 实验结果实验结果大连理工大学 环境与生命学院生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室生物
32、科学与工程系细胞生物学实验教学研究室FITCFITC标记的细胞微管（标记的细胞微管（标记的细胞微管（标记的细胞微管（400400） 大连理工大学 环境与生命学院生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室甲基罗丹明甲基罗丹明甲基罗丹明甲基罗丹明鬼笔环肽标记的细胞微丝（鬼笔环肽标记的细胞微丝（鬼笔环肽标记的细胞微丝（鬼笔环肽标记的细胞微丝（ 10001000）大连理工大学 环境与生命学院生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室6.6.注意事项注意事项 各步洗细胞要轻，勿使细胞脱落。各步洗细胞要轻，勿使细胞脱落。各步洗细胞
33、要轻，勿使细胞脱落。各步洗细胞要轻，勿使细胞脱落。 用用用用1%Triton X1%Triton X1%Triton X1%Triton X100 100 100 100 抽提杂蛋白要作预实验，抽提时间长将破坏细抽提杂蛋白要作预实验，抽提时间长将破坏细抽提杂蛋白要作预实验，抽提时间长将破坏细抽提杂蛋白要作预实验，抽提时间长将破坏细胞结构，抽提时间短背景干扰大。胞结构，抽提时间短背景干扰大。胞结构，抽提时间短背景干扰大。胞结构，抽提时间短背景干扰大。 甲基罗丹明甲基罗丹明甲基罗丹明甲基罗丹明鬼笔环肽标记微丝，染色时间勿太长，否则背景发红。鬼笔环肽标记微丝，染色时间勿太长，否则背景发红。鬼笔环肽标
34、记微丝，染色时间勿太长，否则背景发红。鬼笔环肽标记微丝，染色时间勿太长，否则背景发红。在没有固定液在没有固定液在没有固定液在没有固定液3.7%3.7%3.7%3.7%甲醛甲醛甲醛甲醛PEMDPEMDPEMDPEMD的情况下，也可以用的情况下，也可以用的情况下，也可以用的情况下，也可以用-20-20-20-20冷甲醇代替，冷甲醇代替，冷甲醇代替，冷甲醇代替，但是效果较差。但是效果较差。但是效果较差。但是效果较差。 细胞充分贴壁铺展时应力纤维较多，形态挺直。反之，细胞收缩变细胞充分贴壁铺展时应力纤维较多，形态挺直。反之，细胞收缩变细胞充分贴壁铺展时应力纤维较多，形态挺直。反之，细胞收缩变细胞充分贴
35、壁铺展时应力纤维较多，形态挺直。反之，细胞收缩变圆，应力纤维弯曲，甚至部分解聚消失而显得稀少。圆，应力纤维弯曲，甚至部分解聚消失而显得稀少。圆，应力纤维弯曲，甚至部分解聚消失而显得稀少。圆，应力纤维弯曲，甚至部分解聚消失而显得稀少。 每步洗涤要充分，并吸去水分每步洗涤要充分，并吸去水分每步洗涤要充分，并吸去水分每步洗涤要充分，并吸去水分( ( ( (但也不要干透但也不要干透但也不要干透但也不要干透) ) ) )，以免稀释下一步的，以免稀释下一步的，以免稀释下一步的，以免稀释下一步的抗体或试剂，这样才能得到清晰的荧光图像。抗体或试剂，这样才能得到清晰的荧光图像。抗体或试剂，这样才能得到清晰的荧光
36、图像。抗体或试剂，这样才能得到清晰的荧光图像。大连理工大学 环境与生命学院生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室7.7.思考题思考题 微丝观察实验中，微丝观察实验中，微丝观察实验中，微丝观察实验中，1%Triton X1%Triton X1%Triton X1%Triton X100 100 100 100 处理细胞的作用是什么处理细胞的作用是什么处理细胞的作用是什么处理细胞的作用是什么? ? ? ?此实验此实验此实验此实验是否能看到微管、中间纤维是否能看到微管、中间纤维是否能看到微管、中间纤维是否能看到微管、中间纤维? ? ? ?为什么为什么为什么为
37、什么? ? ? ? M-M-M-M-缓冲液的作用是什么缓冲液的作用是什么缓冲液的作用是什么缓冲液的作用是什么? ? ? ? 如果使用的抗体浓度越高，温育时间越长，是否免疫荧光图像会更清如果使用的抗体浓度越高，温育时间越长，是否免疫荧光图像会更清如果使用的抗体浓度越高，温育时间越长，是否免疫荧光图像会更清如果使用的抗体浓度越高，温育时间越长，是否免疫荧光图像会更清晰晰晰晰? ? ? ? 试分别用细胞松弛素试分别用细胞松弛素试分别用细胞松弛素试分别用细胞松弛素B B B B（3 3 3 3 g/mlg/mlg/mlg/ml培养液）、秋水仙酰胺（培养液）、秋水仙酰胺（培养液）、秋水仙酰胺（培养液）、秋水仙酰胺（0.050.050.050.05 g/mLg/mLg/mLg/mL培培培培养液）在养液）在养液）在养液）在37373737下处理培养的细胞下处理培养的细胞下处理培养的细胞下处理培养的细胞2h2h2h2h，然后按前述实验方法作考马斯蓝，然后按前述实验方法作考马斯蓝，然后按前述实验方法作考马斯蓝，然后按前述实验方法作考马斯蓝染色，细胞内纤维形态有什么变化染色，细胞内纤维形态有什么变化染色，细胞内纤维形态有什么变化染色，细胞内纤维形态有什么变化? ? ? ?比较所得结果并解释之。比较所得结果并解释之。比较所得结果并解释之。比较所得结果并解释之。
