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1、 荧光原位杂交技术及产品简介 胡 斌荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization ,FISH） FISH是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。靶DNA与标记有荧光基团的探针同源互补，经变性-复性，形成杂交体，洗脱未结合的探针，在荧光显微镜下对杂交信号的大小、数目和分布等进行分析。 与荧光PCR的异同： 1. 都有探针，但FISH是杂交探针，荧光PCR是 Taqman 探针。 2. 都是检测核酸，但FISH保持了细胞的完整，荧光 PCR裂解细胞后再提取总DNA。 3. FI
2、SH直观判断单位细胞内信号数的多少；荧光 PCR通过机器扩增后判断拷贝数的多少。 4. 都通过荧光检测，FISH是荧光显微镜，荧光PCR是 荧光PCR仪。 5. FISH的检测标本为石蜡切片，荧光PCR为血清、组 织或细胞。与其它常用技术比较：1. FISH敏感性虽略低于PCR法，但其假阳性或假阴性率却大大低于PCR法，特异性更好。2. 与免疫组织化学法（IHC）相比，FISH具有良好的稳定性和可重复性，检测信号更强。 FISH的优点： 1. 安全、快速 2. 灵敏度及特异性高 3. 探针能长期保存 4. 杂交信号强且能同时显示多种颜色 5. 信号数目可量化，为数字化病理诊断打下 基础公司目前
3、公司目前FISH产品情况：产品情况：1.膀胱癌CSP3/GSP P16基因检测试剂盒已取得受理 证号，今年6月左右可拿到注册证；2.乳腺癌HER2（已报批，正开展后期临床实验验 证），今年4月可望拿到受理号；3.前列腺癌TMPRSS2-ERG融合基因检测试剂盒（已 初步完成研发阶段，正准备报批程序）；4.正在开展乳腺癌TOP2A，宫颈癌TERC，非小细胞 肺癌EGFR 等三个产品研发；5.产前诊断试剂（21，13，18和性染色体）。FISH实验的基本试剂： 1.荧光探针荧光探针； 2.甲酰胺； 3.氯化钠； 4.柠檬酸钠； 5.氢氧化钠； 6.吐温20。FISH实验的基本材料和设备： 1. 暗
4、房； 2. 荧光显微镜（带成像系统）；荧光显微镜（带成像系统）； 3. 恒温水浴锅； 4. 培养箱； 5. 染色缸； 6. 载玻片； 7. 移液器； 8. 暗盒。 实验方法及步骤实验方法及步骤 1）样品前处理样品前处理 2）探针变性 3）标本变性 4）杂交 5）洗脱 6）封片 7）荧光显微镜观察变性变性杂交杂交洗涤洗涤DAPIDAPI复染复染 50%50%甲酰胺甲酰胺 2XSSC2XSSC 0.1%NP-40 0.1%NP-40 70% 70%乙醇乙醇 探针变性探针变性 标本变性标本变性70%甲酰甲酰胺胺 73C 5min42C 湿盒湿盒孵育过夜孵育过夜 FISH技术在乳腺癌检测中的应用1.
5、检测的靶基因为Her-2: Her-2是乳腺癌细胞表面的受体，能控制癌细胞的生长、浸润和转移，大约30%的乳腺癌病例表达水平增加，其高表达阳性乳腺癌是一种高危肿瘤，对常规的化疗反应性差，预后不好。2. 赫赛汀治疗Her-2 高表达阳性乳腺癌： 赫赛汀为治疗性单抗，适用于治疗Her-2过度表达的乳腺癌。Her-2检测推荐方法免疫组化（IHC）FISH 若IHC结果（），应由FISH证实结果分析结果分析正常细胞判断：正常细胞判断： 单个细胞红色及绿色信号各单个细胞红色及绿色信号各2个个异常细胞判断：异常细胞判断： 红信号大于红信号大于2为异常细胞，但绿为异常细胞，但绿 色信号不少于色信号不少于2个
6、。个。结果判断结果判断 计数计数3030个细胞，统计个细胞，统计RatioRatio值（值（RatioRatio值值3030个细个细胞核中红信号总数胞核中红信号总数/30/30个细胞核中绿信号总数）：个细胞核中绿信号总数）： 1 1）RatioRatio1.81.8为为阴阴性性结结果果，提提示示该该样样本本无无Her-2Her-2基基因扩增；因扩增； 2 2）RatioRatio2.22.2为为阳阳性性结结果果，提提示示样样本本中中Her-2Her-2基基因因发生扩增；发生扩增； 3 3）RatioRatio在在1.8-2.21.8-2.2之之间间时时，可可以以选选择择增增加加计计数数细细胞胞
7、至至100100个个, ,或重做或重做FISHFISH实验来判断最终结果实验来判断最终结果。HER-2/CSP 17 2.2（阳性结果）（阳性结果） HER-2/CSP 17 2.2（阳性结果）（阳性结果）HER-2/CSP 17 1.8（阴性结果）（阴性结果） FISH技术在前列腺癌诊断中的应用1.80%左右前列腺癌存在TMPRSS2与ETS基因家族的融 合改变；2.TMPRSS2：21q22.2，为男性雄激素调节基因；3.ETS家族为E26转化特异性基因，包括: ERG(21q22.3)、ETV1(7p21.2)、 ETV4(17q21) 4.FISH 检测TMPRSS2与ERG、ETV1
8、、ETV4基因融合成为前列腺癌早期诊断及预后判断的手段： TMPRSS2/ETV1融合，占比25% TMPRSS2/ERG融合，占比55% TMPRSS2/ETV4融合，占比2%FISH技术在膀胱癌诊断中的应用FISH尿液检查尿液检查A. p16 缺失缺失, 是移行上皮细胞肿瘤发生的早期事件和是移行上皮细胞肿瘤发生的早期事件和关键步骤关键步骤B. 3, 7, 17 染色体的不稳定性与移行上皮细胞肿瘤的浸染色体的不稳定性与移行上皮细胞肿瘤的浸润行为有关润行为有关 C. 灵敏度灵敏度( 大约大约 80%), 特异性特异性 ( 大约大约 96%)p16（红色）（红色）、17号染色体（绿色）正常细胞号染色体（绿色）正常细胞p16(红红)缺失缺失,17号染色体非整倍体号染色体非整倍体产品的销售报价： 见附件1。荧光原位杂交试剂盒销售报价参考.doc配套显微镜及软件报价： 见附件2。莱卡FISH-销售建议价格.xls 谢 谢！
