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1、MTT法检测细胞活力法检测细胞活力1MTT法目的和意义检测细胞存活和生长情况检测细胞存活和生长情况用于评价药物产生的细胞毒作用用于评价药物产生的细胞毒作用2原理四唑盐（噻唑蓝）是一种能接受氢原子的染料，简四唑盐（噻唑蓝）是一种能接受氢原子的染料，简称称MTT活细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性的活细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细）能溶解细胞中的紫蓝色结晶物，用酶联免疫检测仪在胞中的紫蓝色结晶物，用酶联免疫检测仪在490n
2、m波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量，波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量，从而反映细胞的增殖情况。从而反映细胞的增殖情况。在一定细胞数范围内，在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与活细结晶物形成的量与活细胞数成正比。胞数成正比。3活细胞+MTT琥珀酸琥珀酸脱脱氢酶氢酶紫蓝色结晶物Formazan4贴壁细胞操作步骤1.接种细胞：用接种细胞：用0.25%胰蛋白酶消化单层培养细胞，胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含血清的培养液配成用含血清的培养液配成单个细胞悬液单个细胞悬液，以每孔，以每孔2000-3000个细胞接种于个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积孔培养板中，每孔体积90ul。
3、 （边缘孔用（边缘孔用PBS或空白培养基填充）。或空白培养基填充）。 2.培养细胞：将培养板移入培养细胞：将培养板移入CO2孵箱中，在孵箱中，在37、5%CO2及饱和湿度条件下培养，至细胞单层铺满及饱和湿度条件下培养，至细胞单层铺满孔底（孔底（96孔平底板，大约孔平底板，大约12h），加入浓度梯度的），加入浓度梯度的药物。原则上，细胞贴壁后即可加药，每孔加药药物。原则上，细胞贴壁后即可加药，每孔加药10ul，一般设，一般设5个复孔。个复孔。3.5%CO2，37孵育分别孵育孵育分别孵育24小时后，倒置显小时后，倒置显微镜下观察。微镜下观察。54.每孔加入每孔加入10ulMTT溶液（溶液（5mg/
4、ml，即，即0.5%MTT），继续培养），继续培养4h。若药物与。若药物与MTT能够反应，能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲冲2-3遍后，再加遍后，再加入含入含MTT的培养液。的培养液。5.终止培养，小心吸去孔内培养液。终止培养，小心吸去孔内培养液。6.每孔加入每孔加入100ul二甲基亚砜（置摇床上低速振荡二甲基亚砜（置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。处测量各孔的吸光值。7.同时设置调零孔（培养基、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），、二甲基亚砜）
5、，对照孔（细胞、培养液、对照孔（细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜）、二甲基亚砜）6悬浮细胞操作步骤：1）将细胞离心收集后，调节细胞悬液浓度大约）将细胞离心收集后，调节细胞悬液浓度大约1104/ml，每孔先加细胞悬液每孔先加细胞悬液90ul,相应梯度的药物每孔相应梯度的药物每孔10ul；共；共100ul加入到加入到96孔板（边缘孔用孔板（边缘孔用PBS填充）。每板设对照。同时填充）。每板设对照。同时设置调零孔（培养基、设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、二甲基亚砜），对照孔（细胞、培养液、培养液、MTT、二甲基亚砜），、二甲基亚砜），每组设每组设5个个复孔。复孔。2）置）置3
6、7，5%CO2孵育孵育24小时，倒置显微镜下观察。小时，倒置显微镜下观察。3）每孔加入）每孔加入10ulMTT溶液（溶液（5mg/ml，即，即0.5%MTT），），继续培养继续培养4h4）每孔加三联裂解液（每孔加三联裂解液（10gSDS，异丁醇异丁醇5ml，10MHCl0.1ml用双蒸水溶解配成用双蒸水溶解配成100ml）过夜，）过夜， 第二天早晨置摇床第二天早晨置摇床上低速振荡上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪仪OD570nm测量各孔的吸光值。测量各孔的吸光值。7药物的配制浓度体积过滤8MTT的配制MTT一般最好现用现配，过滤后一般最好
7、现用现配，过滤后4C避光保存两周内有效，避光保存两周内有效，或配制成或配制成5mg/ml保存在保存在-20度长期保存，避免反复冻融，度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。尤其当免分解。尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。变为灰绿色时就绝对不能再用了。MTT有致癌性，用的时候小心有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的有条件最好带那种透明的簿膜手套簿膜手套.配成的配成的MTT需要无菌，需要无菌，MTT对菌很敏感；往对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，因为时间较短。孔板加时不避光也没
8、有关系，因为时间较短。9实验结果统计学处理所有数值以xs表示，应用SPSS软件进行方差分析，p0.05时为相差显著，p0.01时为相差非常显著。可以以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线曲线，专门公式求IC50（半数抑制浓度 ）。或计算抑制率。 OD对照组-OD实验组 抑制率 %=OD对照组100%10实验结果统计学处理公式如下：lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)Xm:lg最大剂量I:lg(最大剂量/相临剂量)P:阳性反应率之和Pm:最大阳性反应率Pn:最小阳性反应率11举例药物浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001umol/l，稀
9、释倍数为10，最大浓度为0.1，抑制率为0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入计算公式：Pm=0.95Pn=0.06P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1Xm=lg0.1=-1lgI=lg0.1/0.01=1lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025IC50=0.0002512注意事项1选择适当的细胞接种浓度。选择适当的细胞接种浓度。在进行在进行MTT试验试验前，对每一种细胞都应测其贴壁率、倍增时间以前，对每一种细胞都应测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，然后确定及不同接种细
10、胞数条件下的生长曲线，然后确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间。试验中每孔的接种细胞数和培养时间。2设空白对照，设空白对照，与试验平行设不加细胞只加培与试验平行设不加细胞只加培养液的空白对照孔。最后比色时，以空白孔调零。养液的空白对照孔。最后比色时，以空白孔调零。 13实验前应明确的问题1.选择适当的细胞接种浓度。选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、试验前，要进行
11、预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。太多敏感性降低，太少观察不到差异。142.药物浓度的设定。药物浓度的设定。一定要多看文献，参考别一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的
12、结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记！初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。效浓度和时间。3.时间点的设定。时间点的设定。在不同时间点的测定在不同时间点的测定OD值，值，输入输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表
13、现的最明显）。显）。154.培养时间。培养时间。100ul的培养液对于的培养液对于10的的45次方的增殖期细胞来说，很难维持次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液换液的。的。5.MTT法只能测定细胞相对数和相对活法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。力，不能测定细胞绝对数。做做MTT时，尽时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色比色OD值的升高。值的升高。167.实验时应设置调零孔，对照
14、孔，加药孔。实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。入不同浓度的药物。8.避免血清干扰。避免血清干扰。用含用含15胎牛血清培养液培胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于一般选小于
15、10胎牛血清的培养液进行。在呈色胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。后，尽量吸净培养孔内残余培养液。17关于细胞的接种(铺板)细胞过了细胞过了30代以后就不要用了代以后就不要用了;培养板要用好的培养板要用好的（最好进口板），不好的板或重复利用的板只可（最好进口板），不好的板或重复利用的板只可做预实验。做预实验。接种时最好按照预实验摸索出的密度接种接种时最好按照预实验摸索出的密度接种,且而细且而细胞过密或者过少，增殖都会过快或者过慢，其增胞过密或者过少，增殖都会过快或者过慢，其增值率线性关系不佳。故而值率线性关系不佳。故而MTT细胞密度多采用细胞密度多采用10000/ml
16、，100ul/孔。孔。细胞密度要根据不同细胞的特点来定。细胞密度要根据不同细胞的特点来定。 悬浮细胞悬浮细胞每孔的细胞数可达到每孔的细胞数可达到105,贴壁细胞可为贴壁细胞可为103-104。18MTT本身就是比较粗的实验，增殖率本身就是比较粗的实验，增殖率10%左右的左右的波动都不算奇怪。特别是新手，波动都不算奇怪。特别是新手，20的波动也是的波动也是常见的，所以很可能是技术原因引起的，特别是常见的，所以很可能是技术原因引起的，特别是种板技术一定要过关种板技术一定要过关。注意注意细胞悬液一定要混匀细胞悬液一定要混匀，已避免细胞沉淀下来，已避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接几
17、个就要导致每孔中的细胞数量不等，可以每接几个就要再混匀一下。加样器操作要熟练，尽量避免人为再混匀一下。加样器操作要熟练，尽量避免人为误差。另外，吹散次数过多也会影响细胞活力。误差。另外，吹散次数过多也会影响细胞活力。所以要熟练鞋、快些上板。所以要熟练鞋、快些上板。19如何清除上清直接吸出：直接吸出：加加DMSO前要把液体吸掉，但培养液里的紫前要把液体吸掉，但培养液里的紫色结晶可能会吸去，可在这之前先用平板离心机离心色结晶可能会吸去，可在这之前先用平板离心机离心96孔孔板，板，2000r，5分钟，然后吸掉上清分钟，然后吸掉上清(如果是悬浮细胞，则如果是悬浮细胞，则推荐此法推荐此法,悬浮细胞要离心
18、悬浮细胞要离心2500rpm10min.且其做且其做MTT最最好用圆底型好用圆底型96孔板孔板,清除上清时注意不要把下面的结晶颗清除上清时注意不要把下面的结晶颗粒吸掉粒吸掉,建议各孔吸弃建议各孔吸弃150-160ul即可即可)。翻转倒扣法：翻转倒扣法：可以直接将板翻转倒扣（垫几层滤纸）可以直接将板翻转倒扣（垫几层滤纸）23次，比用次，比用“吸吸”的办法更不容易使细胞脱离出来。可的办法更不容易使细胞脱离出来。可以轻拍，或者倾斜一点帮助吸液，但前提是细胞贴壁要比以轻拍，或者倾斜一点帮助吸液，但前提是细胞贴壁要比较牢。较牢。20加入DMSO在同一批实验中最好不要更换在同一批实验中最好不要更换DMSO
19、。加加DMSO前把孔中前把孔中液体尽量弃干净如果培养液没弃干净，空白孔也要留有等液体尽量弃干净如果培养液没弃干净，空白孔也要留有等量的培养液，这样在检测时可以尽量去除培养液的影响，量的培养液，这样在检测时可以尽量去除培养液的影响，DMSO的量也可为的量也可为100ul或或150ul.加了加了DMSO后用振荡器轻轻振荡后用振荡器轻轻振荡510min,时间控制尽量时间控制尽量严格一点严格一点,放置时间长了会影响结果放置时间长了会影响结果,值会偏大值会偏大,且结果不可且结果不可信信.加入加入DMSO溶解后尽快检测。溶解后尽快检测。21OD值的测定至于测定波长的选择是因显色溶液而异的。对于至于测定波长
20、的选择是因显色溶液而异的。对于DMSO，溶解后呈紫（红）色，溶解后呈紫（红）色，490nm有最大吸收值有最大吸收值 。DMSO溶后溶后10分钟内测，越放颜色越深，而做为溶分钟内测，越放颜色越深，而做为溶解液测吸收光值，其值可在三天内保持不变。解液测吸收光值，其值可在三天内保持不变。细胞密度细胞密度偏大测出的吸光度也会偏大，细胞密度小吸光度偏大测出的吸光度也会偏大，细胞密度小吸光度也会偏小；另外跟细胞状态也有关系，也会偏小；另外跟细胞状态也有关系，细胞状态不好的话细胞状态不好的话，吸光度值也会低的；细胞数目少，或者是培养的时间短，吸光度值也会低的；细胞数目少，或者是培养的时间短，OD值也会偏低。如果各个孔的孔间差异性特别明显的话值也会偏低。如果各个孔的孔间差异性特别明显的话说明有可能存在污染说明有可能存在污染,空白孔的空白孔的OD值太高，很可能是值太高，很可能是细菌细菌污染污染。22谢谢观看谢谢观看23
