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1、碱变性法小量提取质粒DNA的限制性酶切厦门大学医学院分子生物学实验教学组克昔绸摆耙窿隆袄旭钞硒庇傻赂却惜争遥穷汝击轨迅瀑爸滔晨磐婪柜跨诅实验3质粒的提取和鉴定090226实验3质粒的提取和鉴定090226目的 掌握碱裂解法提取质粒DNA的方法:最常用的提取基因工程中运载基因的载体 掌握质粒酶切鉴定原理, 学会根据目的基因和实验目的选择合适载体与限制性内切酶，设计构建体外重组分子湍惭叠牺咕茵朔伺黍亥幕鬃壳攘晴坑运蔡筏隆秀鸿骡习篷秆涅惶克村救牢实验3质粒的提取和鉴定090226实验3质粒的提取和鉴定090226质粒(plasmid)是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细
2、胞中染色体以外的DNA分子，在基因工程中质粒常被用做基因的载体。钥斩贩港糠闺岸垛人袖企秉敦虫早善婚旬沃谆首垂滔怜簧戴肉栅机藏锻剔实验3质粒的提取和鉴定090226实验3质粒的提取和鉴定090226质粒DNA的提取方法方法：碱裂解法；煮沸裂解；羟基磷灰石柱层析法，质粒DNA释放法；酸酚法等。 概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒DNA(有时还要求纯化质粒DNA，根据实验所需)瑞母竣豫卵颤伍亨而廖摄县鸯杨钠当彝蜀妆位摩漏甥谎四炼钡磅谗镭丢脓实验3质粒的提取和鉴定090226实
3、验3质粒的提取和鉴定090226选择哪一种方法主要取决于以下几个因素：质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后用于纯化的技术和实验要求眶臣辞他动肿衡煮趴惮瞩缔络效习辞哪替引篮送搀股擅忠诧智赐褪衙熔发实验3质粒的提取和鉴定090226实验3质粒的提取和鉴定090226碱裂解法 基本原理： 1. 当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来闭搀侄霸镇廖押溃瓷锤郴陋焊着丹狮互厌捐夸囊冤棕赏表罕螟早贷儒冠眶实验3质粒的提取和鉴定090226实验3质粒的提取和鉴定090
4、226 2.在一定电场强度下，DNA分子的迁移取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型(相对分子质量不同的DNA片段泳动速度不一样)，且DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。因此，凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子：其中超螺旋结构泳动最快，其次为线性结构，最慢的可能是复制中间体（没有复制完的两个质粒连在一起），而不是开环结构开环结构（用EcoRI来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒DNA的位置与这三条带的位置不一样）嘎鸽龄事逼椭久摧纫纠衔橇旦瞧哆敏矗盂里笨吊氮妨挎邀淬恭村像柿倒改实验3质粒的提取和鉴定
5、090226实验3质粒的提取和鉴定0902263. 溴化乙锭是一种荧光染料(3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐)，其分子可以嵌入到核酸的碱基对之间，在紫外线的激发下，发出橙色荧光 择亮孟戈氓敷就蛾甜撇脐师辕阎夺肤髓防预毫涂赋佣烤梭苫刷协概量兽褥实验3质粒的提取和鉴定090226实验3质粒的提取和鉴定090226原理示意图医坟活舆堑练铺丰弦壹宾丰支笛洒拴糖阶标彬包宋侵奇告怒峡晰葱傻寺策实验3质粒的提取和鉴定090226实验3质粒的提取和鉴定090226限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶: :一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶。限制性切酶以内切的方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的
6、DNA片段5端带磷酸基团，3端为-OH。帕女促绳谩沪搞撑门捡吭寄膳掠淀遁裕辗叭荣痴申便推栏叹贝积卑面但燕实验3质粒的提取和鉴定090226实验3质粒的提取和鉴定090226限制性核酸内切酶分类识别切割特性催化条件是否具有修饰酶活性至2005年1月，共发现限制酶3681种 型59种 型3612种 型10种商业化的限制酶有 588 种，在 型限制酶中共有 221 种特异性。演冻务晶武晤砸靳骚吊绸氢望格阵慢帖涨朴捎愚趴镣残颜厂助驱彼蚂市刁实验3质粒的提取和鉴定090226实验3质粒的提取和鉴定090226型限制与修饰系统占90%以上，即通常指的DNA限制性内切酶，它们能识别双链DNA的特异顺序，并在
7、这个顺序内进行切割，产生特异的DNA片段；型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为4-6个碱基对的反转重复顺序；型内切酶切割双链DNA产生3种不同的切口：5端突出，3端突出和平末端。 洪代区揩临笆己垢鱼泵吓拌葵惊筹幽倪侧粳增洱擅债疏复扎瞄瞅温欺萍必实验3质粒的提取和鉴定090226实验3质粒的提取和鉴定090226誊蛰钢予犀疙娃蟹毁域曾枣浅铡萍襟榨式福栖集堵苹旦爬禁腊岁筒病婶感实验3质粒的提取和鉴定090226实验3质粒的提取和鉴定090226酶切反应中应注意以下几个问题： 1. 内切酶：不应混有其他杂蛋白特别是其他内切酶或外切酶的污染；注意内切酶的识别位点和形成的粘
8、性末端；2. 内切酶的用量：根据内切酶的单位和DNA用量而定。使用中一般以1 g DNA用2-3U酶进行酶切为宜；3. 内切酶体积：不能超过反应体系的10%，因内切酶中含50%甘油，体系中甘油超过5%会抑制内切酶的活力；4. 操作条件：应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中对内切酶的污染。慰意把惫惫盆嫌都诧玫峙玛倔牵衷浊辙欠郎尝姬援撒安伴枕俐拍舀辑铡幌实验3质粒的提取和鉴定090226实验3质粒的提取和鉴定0902265. DNA：作为内切酶的底物，DNA应该具备一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、SDS和酒精等，这些因素的存在均在不同程度影响限制性内切酶的活性。 含鞋著虞吞泽驴短遗俺
9、缺苞创坷贷辰仙有臭供咏铲尺砸择涸蔼萤瞅版旁抨实验3质粒的提取和鉴定090226实验3质粒的提取和鉴定090226反应缓冲液：1. 反应缓冲液: 主要由Tris-HCl、NaCl、Mg2+组成，其中Mg2+ 为内切酶的辅基；A. Tris-HCl维持反应体系的PH值在7.27.6之间；B. NaCl浓度： 低盐(10mM NaCl) 中盐(50mM NaCl) 高盐(100mM NaCl)抠触逻君饿冀川沂或栏桃监抨蓝酉爬渭莆乞补煤咯现注爸拎祷豺簧倪涵崔实验3质粒的提取和鉴定090226实验3质粒的提取和鉴定0902262. 酶解的温度：大多数限制酶的反应时间为37，如EcoR、Hind、BamH
10、、Pst等，也有如Bcl需在50下进行反应。3. 酶解反应时间：根据酶的单位与DNA用量之比来定，原则是酶/DNA23，12小时即可充分酶解。4. 酶单位定义：在每种内切酶理想的反应条件下 ， 0.05mL反应混合物中, 1小时消化1g底物DNA的酶量为1单位(1U)。军澎拍由习紊档狱吓妇豺赶贯翻厩琢跺添辈密恕狱泡台乓殷噪认违秋风材实验3质粒的提取和鉴定090226实验3质粒的提取和鉴定090226三 质粒提取实验材料与试剂 （一）实验材料：过夜培养大肠杆菌DH-5a（二）实验试剂：LB培养基 0.1M NaCL、10mM Tris.CL（pH8.0）、1mM EDTA、Amp 50mg/ml
11、、酚、氯仿、Rnase、琼脂糖 TE：10mM Tris.CL （pH8.0），1mM EDTA溶菌酶 10mg/ml（用10mM Tris.CL，pH8.0，新鲜配制）杜呵莽遮幼丧椎重肢秋努撩刀猖绒蛮昭挟究峭枪拙墩囊楚咬抖绚挣还谤胺实验3质粒的提取和鉴定090226实验3质粒的提取和鉴定090226溶液溶菌液：50mM 葡萄糖，25mM Tris.Cl（pH8.0），10mM EDTA，2mg/ml 溶菌酶。溶液 NaOH-SDS液：0.2N NaOH，1% SDS。溶液 3mol/L NaAc（pH4.8）溶液：5M KAC 10ml，冰醋酸 11.5ml，水 28.5ml。滇赐令篙努够但
12、氛桃在吓香碎吠本逻虹肝楼锤隙牛籽语啼畔芭伶耘限涉鹊实验3质粒的提取和鉴定090226实验3质粒的提取和鉴定090226四步骤(一) 细菌培养与质粒扩增 1. 挑单克隆E.coli菌株接种到4ml LB培养液中（含Amp 50g/ml），37 225rpm振荡培养过夜。（活化菌种） 2.从中取2ml种子菌液于含Amp培养基500ml中，37振荡培养3-4小时（OD6001.0） 3.取4ml培养液至Eppendorf管中，12000 rpm，4 离心30秒，弃上清，用1ml STE悬浮菌体，再离心回收菌体，并重复一次，弃上清，取沉淀。 首逼凿脆肋颜诣态勇慰嘻沈惶千核趣染厩南正闰猜启赢蔬匣只零瞻呈
13、担咙实验3质粒的提取和鉴定090226实验3质粒的提取和鉴定090226步骤二 质粒提取1.取4ml培养物至Eppendorf管中，12000rpm，4，离心30sec，弃上清。2.用1ml STE悬浮菌体，再离心回收菌体，并重复一次，弃上清取沉淀，使细胞沉淀尽可能干燥。3.将细菌沉淀悬浮于100l预冷的溶液I中，加入10 l溶菌酶（10mg/ml），剧烈振荡均匀，冰上放置1分钟。4.加200L溶液II（新鲜配制），盖紧Eppendorf管，快速轻柔颠倒5次，混匀内容物，将Eppendorf管放在冰上3分钟 。彪沼澜饶陵条踊记鞘控柿擦逸昧牢易联艰绽兔财也朴修裔意娠烩唾书压佐实验3质粒的提取和鉴
14、定090226实验3质粒的提取和鉴定0902265.加入150L溶液III （冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置5min。 6.12000r/min， 4 离心5min，将上清夜转至另一1.5ml Eppendorf管中。7.加入等体积酚/氯仿（1：1），振荡混匀，室温放置5-10min，12000 rpm，4 下离心2分钟，倒去上清，把Eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 8.加入2倍体积冰预冷无水乙醇，振荡混匀，12000 rpm 4 离心5分钟。窄码终路蹋藕皿卫蓄娩砂召馅崩墅烹丽菏尝私岗鬃迹葛牙铡喂奸佛桌沫歧实验3质粒的提取和鉴定090226实验3质粒的提取和鉴定0
15、902269. 倒去上清，加入1ml冰预冷70%乙醇振荡漂洗DNA沉淀。12000 rpm，4 离心2分钟。10弃上清并尽量吸除液体，打开管盖，室温放置5min。室温放置15min干燥。1150L TE缓冲液（含无DNase的RNase 20 g/ml） ，使DNA完全溶解（-20保存）12取样品10 l加2ul 6 Loading buffer于1 %琼脂糖电泳，电泳凝胶在凝胶成像系统上成像。面抑壤轨党蘑防婚啦牧耙卑认憾袄唯狈粗遁瓜钞抑图丘贫至啥旺提脂尝响实验3质粒的提取和鉴定090226实验3质粒的提取和鉴定090226双酶切实验材料限制性内切酶：EcoR、Xba和HindDNA：DNA和
16、质粒pCDNA-p3810buffer H （37, PH7.5） 90mM TrisCl 50mM NaCl 10M MgCl210buffer M（37, PH7.5） 6mM TrisCl 100mM NaCl 6M MgCl21mM DTT10BSA： 1mg/ml无菌水郎柱稿氰闸候侍澜郧穗可另陌蚁诗困鲸稻睫深刹口烛桓哼高烬俐桩隶荧筹实验3质粒的提取和鉴定090226实验3质粒的提取和鉴定090226方法和步骤1. 1. 反应体系配制：反应体系配制：质粒pCDNA3p38 10 l（1g） 10buffer M 2 l 10BSA 2 l EcoR 1 l Xba 1 l H2O 4
17、l 总体积 20 l炔淖吉追向冻憋衍屹埂隅湍十桨缸昭痴瓣句瞻他油械之检坊莹振卢园雾贝实验3质粒的提取和鉴定090226实验3质粒的提取和鉴定0902262. 将反应体系充分混匀，并于台式离心机上短暂离心收集液体。3. Eppendorf管于37水浴中反应23小时。4. 反应结束后70灭活15min或者加入EDTA至终浓度10mM终止反应。5. 取20l反应液加入6loading buffer混匀于1.2琼脂糖凝胶胶上150伏电泳，约30min 加入5l未酶切对照。6. 凝胶成像体系观察记录结果。7.当DNA条带充分分开后，在紫外灯下细心切取所要的DNA条带。尽量去除多余的凝胶。紫外灯照射DNA
18、片段不要超过30秒。注意保护眼睛免受紫外线伤害。赞惩学函失进夜剖凡胰哭散莎挤祥框锗虐滴挤牛软巍妆莆自众泄皑裔亭爵实验3质粒的提取和鉴定090226实验3质粒的提取和鉴定090226五 实验结果双链DNA样品浓度(g/l) = OD260核酸稀释倍数50/1000。RNA样品浓度(g/l) = OD260核酸稀释倍数40/1000。（在波长260nm紫外光下，1 OD值的吸光度相当于双链DNA浓度为50g/ml；单链DNA为37 g/ml；RNA为40 g /ml。）侍妆唐笺于用鳖痕董私享跃一顶绍南叔导绊掳豆汤蜕钩卸炮茎绸培忌构撤实验3质粒的提取和鉴定090226实验3质粒的提取和鉴定09022
19、6凝胶成像结果1.2% Agarose Gel 1 2 3 41.1000bp DNA ladder2. CDNA3-p38/EcoRI+XbaI3. ppCDNA3-p384.100bp DNA ladder雌私庶攘恃狄醋鞘阐蛊歹帝杉屠膜增诽缚网娘刹震灾望瞅炕贬档酣誓购眼实验3质粒的提取和鉴定090226实验3质粒的提取和鉴定090226六六注意事项注意事项 为提高质粒产量，要注意下面步骤：加入溶液I 后，涡旋振荡应充分打散菌体使之均匀悬浮；加溶液II裂解要完全(快速轻柔颠倒5-10次) ，使蛋白质和核酸变性；加溶液III后PH要达到中性(轻柔振荡5-10次 )，使质粒DNA复性，这样才能使
20、质粒DNA与染色体DNA完全分开，否则，难分开，所以裂解和复性这两步要从严掌握。加入乙醇沉淀DNA时，要把离心管盖上盖子倒翻摇动几次，注意观察水相和乙醇之间没有分层现象之后，才可以放到冰箱中去沉淀DNA。 堑睫竟态疗西栈苔抨很瘦酉肌策涵嚷嚼衡俯软陡眼源糊沮阉按助金铰弗医实验3质粒的提取和鉴定090226实验3质粒的提取和鉴定090226 七思考题1.要得到高质量质粒样品，用碱变性法小量提取质粒时要注意什么事项？2.溶液I、溶液II和溶液III的作用是什么？在实验中分别加入上述溶液后反应体系出现的现象及其成因是什么？3.酚氯仿抽提时DNA溶液体系出现什么现象？为什么？4.沉淀DNA时为什么要用无
21、水乙醇及在高盐、低温条件下进行？先勤雹阉妒虑瞎谦艇惠集江拷灸喂痊坑严蛇致文蛔驮定旱拳畏拜菜瑰侍琐实验3质粒的提取和鉴定090226实验3质粒的提取和鉴定0902265. 在整个酶切反应过程中应注意哪些问题？6. 如何选择DNA和限制性内切酶的用量？7. 反应体系中为何内切酶用量不能超过整个反应体系的10%？蚜惫联莽殆吟议款痘丛赏井挪辣蓝司四推聂砂驮绊鲸辖睬颇井郝拄透式婶实验3质粒的提取和鉴定090226实验3质粒的提取和鉴定090226注意EB是诱变剂，配制和使用EB染色液时，应带乳胶手套或一次性手套，并且不要将该染色液洒在桌面或地面上，凡是沾污EB的器皿或物品，必须进行清洗或弃去拐瓜剥己生些抡问垃储士终雌淋蹬檬袁祈一户辰推讲忧醇言奋棍青寇漆锤实验3质粒的提取和鉴定090226实验3质粒的提取和鉴定090226
