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1、组化第3章酶组织化学方法酶酶的底物酶酶的底物最初的反应物另外物质最初的反应物另外物质（金属盐）（金属盐）不溶于水的显色产物不溶于水的显色产物酶的分类：酶的分类：1.氧化还原酶：是催化氧化还原反应的酶。2.转移酶:是催化功能基团转移的酶。3.水解酶:是催化水解反应的酶。4.裂解酶:是催化分裂或合成化合物的酶。5.异构酶:是催化同分异构体相互转化的酶。6.合成酶:是催化将两种物质合成一各物质,并必须与ATP分解相偶联的酶。酶组织化学反应中注意事项酶组织化学反应中注意事项n在制备标本及组化实验中必须做到既要最大在制备标本及组化实验中必须做到既要最大限度地保存酶的活性，又要保存好组织细胞的限度地保存酶
2、的活性，又要保存好组织细胞的形态结构，以保证酶在组织细胞中准确定位。形态结构，以保证酶在组织细胞中准确定位。n酶反应的温度、时间、酶反应的温度、时间、PH必须控制好。必须控制好。n试剂的浓度配制必须准确。试剂的浓度配制必须准确。n所用器皿必须清洁，以防污染及出现假阳性。所用器皿必须清洁，以防污染及出现假阳性。n必须做阳性或阴性对照试验。必须做阳性或阴性对照试验。第二节若干酶组织化学反应程序一、碱性磷酸酶碱性磷酸酶（一）名称：（一）名称：常用名：碱性磷酸酶常用名：碱性磷酸酶（alkalinephosphatase,ALP）水水解解酶酶，在在碱碱性性环环境境下下催催化化水水解解磷磷酸酸脂脂生生成成
3、磷磷酸酸和和醇醇。在在运运输输较较为为活活跃跃的的细细胞胞膜膜上上广广泛泛分分布布，如如毛毛细细血血管管内内皮皮细细胞胞、肝肝内内毛毛细细胆胆管管膜膜、肾肾近近曲曲小小管管的刷状缘、肠上皮的纹状缘和神经细胞的突触膜等。的刷状缘、肠上皮的纹状缘和神经细胞的突触膜等。(二)反应原理：反应原理：ALP在在有有激激活活剂剂（Mg2+）存存在在和和PH9.4时时，将将其其磷磷酸酸盐盐底底物物（如如一一甘甘油油磷磷酸酸钠钠、一一苯苯酚酚磷磷酸酸钠钠）分分解解产产生生甘甘油油钠钠和和磷磷酸酸离离子子，后后者者被被孵孵育育液液中中的的氯氯化化钙钙所所捕捕获获，在在有有酶酶活活性性存存在在处处生生成成磷磷酸酸钙
4、钙沉沉淀淀，但但为为非非金金属属盐盐，需需要要加加入入硝硝酸酸钴钴，从从而而生生成成无无色色磷磷酸酸钴钴沉沉淀淀，再再通通过过硫硫化化铵铵处处理理，形形成棕黑色硫化钴。成棕黑色硫化钴。（三）光镜显示法Gomori改良钙钴法1）溶液的配制：）溶液的配制：孵育液：孵育液：3甘油磷酸钠甘油磷酸钠10ml2巴比妥钠巴比妥钠10ml2氯化钙（氯化钙（2.7%CaCl22H2O）20ml5%硫酸镁硫酸镁(MgSO47H2O)1ml蒸馏水蒸馏水5ml调此液调此液pH至至9.4,可冰箱保存。可冰箱保存。2硝酸钴（硝酸钴（Co(NO3)2）0.5%硫化铵硫化铵(NH4)2S)(新配新配)2)染色步骤:石蜡切片脱
5、蜡入水石蜡切片脱蜡入水,或冰冻切片或或冰冻切片或经经10%福尔马林固定福尔马林固定15min;入孵育液入孵育液,3730-40min(肾组织肾组织10min,肝组织肝组织60min);流水冲洗流水冲洗5min;2%（Co(NO3)2)5min;蒸馏水洗蒸馏水洗;1%(NH4)2S1min;蒸馏水洗蒸馏水洗;甘油明胶封片甘油明胶封片;3）对照）对照:孵育液中去除孵育液中去除-甘油磷酸钠甘油磷酸钠。4）染色结果：）染色结果：ALP活性的最终反应产物为棕黑色硫化钴沉淀。活性的最终反应产物为棕黑色硫化钴沉淀。5）说明：）说明：钙钴法在一般实验室仍是常用的方法，但因钙钴法在一般实验室仍是常用的方法，但因
6、其化学反应多次转换，容易造成定位不准确；其化学反应多次转换，容易造成定位不准确；石蜡切片虽然也能显示石蜡切片虽然也能显示ALP活性，但经石蜡包活性，但经石蜡包埋处理（包括酒精、二甲苯、高温等），酶活埋处理（包括酒精、二甲苯、高温等），酶活性丧失大部分。性丧失大部分。二、酸性磷酸酶二、酸性磷酸酶（一）名称：常用名：常用名：酸性磷酸酶酸性磷酸酶（acidphosphaatase,ACP）主要位于细胞内的溶酶体内，是溶酶体主要位于细胞内的溶酶体内，是溶酶体的标的标志酶。此外，尚有非溶酶体性志酶。此外，尚有非溶酶体性ACP。ACP在细胞在细胞退变过程中活性最强，在核酸和蛋白质代谢活动增退变过程中活性最
7、强，在核酸和蛋白质代谢活动增强时，也见强时，也见ACP活性增强。活性增强。ACP也参与脂肪代谢。也参与脂肪代谢。在神经传导冲动时，在神经传导冲动时，ACP参与参与Ca2+依赖的神经递依赖的神经递质释放过程。总之，在疾病、免疫反应和细胞损伤质释放过程。总之，在疾病、免疫反应和细胞损伤与修复过程中与修复过程中ACP均具有一定的生物学意义。均具有一定的生物学意义。（二）反应原理（二）反应原理显示酸性磷酸酶，先将切片放入含显示酸性磷酸酶，先将切片放入含有酶底物（有酶底物（-甘油磷酸钠）的溶液）的溶液（PH5.0）中孵育，底物经酶水解，释）中孵育，底物经酶水解，释放磷酸，用捕捉剂硝酸铅与磷酸反应，放磷酸
8、，用捕捉剂硝酸铅与磷酸反应，形成微细的磷酸铅，沉淀于酶存在的部形成微细的磷酸铅，沉淀于酶存在的部位，再用硫化铵处理，磷酸铅被置换形位，再用硫化铵处理，磷酸铅被置换形成粗颗粒状的黑色硫化铅沉淀物，便可成粗颗粒状的黑色硫化铅沉淀物，便可用光镜看到。用光镜看到。（三）光镜显示（三）光镜显示ACP有铅法和偶氮偶联法：有铅法和偶氮偶联法：1、铅法：铅法：1）孵育液的配制：）孵育液的配制：0.05mol/L醋酸盐缓冲液醋酸盐缓冲液,pH5.010ml蔗糖蔗糖0.8g硝酸铅硝酸铅Pb(NO3)210mg3%(约约0.1mol/L)-甘油磷酸钠甘油磷酸钠1ml按上述顺序加入按上述顺序加入,待硝酸铅完全溶解后再
9、逐滴待硝酸铅完全溶解后再逐滴加入底物加入底物,边加边搅至溶液完全透明。边加边搅至溶液完全透明。2)染色步骤：石蜡切片脱蜡到水；冰冻切片或冰冻石蜡切片脱蜡到水；冰冻切片或冰冻切切片冷福尔马林钙固定片冷福尔马林钙固定10min后水洗；后水洗；入孵育液入孵育液24h（肝组织（肝组织1h左右），左右），37；双蒸馏水洗；双蒸馏水洗；入入1硫化铵（新配）溶液内硫化铵（新配）溶液内12min流水洗。流水洗。13）对照：）对照：在孵育液内加入在孵育液内加入0.01mol/L氟化钠氟化钠(NaF)抑制剂后抑制剂后,ACP反应呈阴性。反应呈阴性。M4）染色结果：）染色结果：ACP呈棕黑色硫化铅颗粒。呈棕黑色硫化
10、铅颗粒。5）说明：）说明：ACP是可溶性酶，以冷固定后结果是可溶性酶，以冷固定后结果较满较满意意.石蜡切片制作过程易使酶石蜡切片制作过程易使酶失活。失活。三、三、核苷酸酶核苷酸酶（一）名称（一）名称常用名：核苷酸酶（Nucleotidase）核核苷苷酸酸酶酶是是一一种种特特异异性性的的磷磷酸酸单单酯酯酶酶，它它能能水水解解核核糖糖核核苷苷和和去去氧氧核核糖糖核核苷苷在在5位位置置的的磷磷酸酸酯酯，如如一一磷磷酸酸腺腺苷苷（），一一磷磷酸酸肌肌苷苷（），尿尿苷苷磷磷酸酸（UMP）,胞胞苷苷磷磷酸酸（）等等，水水解解产产生生核核苷苷和和磷磷酸酸，但但不不能能分分解解甘甘油油磷磷酸酸，葡葡萄萄糖糖磷
11、磷酸酸。核核苷苷酸酸酶酶是是一一种种最最适适p值相当广泛的酶。值相当广泛的酶。（二）反应原理（二）反应原理n底物经酶水解，用金属离子捕捉生成的磷酸离子而形成沉淀。即：腺苷磷酸水腺苷磷酸。（三）光镜显示方法（三）光镜显示方法铅法（铅法（Wachs和和Meisel1956）（1）取材：新鲜组织冰冻切片取材：新鲜组织冰冻切片（2）孵育液的配制：孵育液的配制：腺苷腺苷磷酸钠磷酸钠4mg0.2MTris-苹果酸缓冲液苹果酸缓冲液（Tris-maleatebuffer）p7.44ml0.1MMgSO4(2.5%）1ml2%硝酸铅硝酸铅0.6ml蒸馏水蒸馏水0.4ml（1）方法与步骤：）方法与步骤：新鲜组织
12、冰冻切片新鲜组织冰冻切片,或冷或冷10%福尔马林福尔马林固定冰冻切片固定冰冻切片;蒸馏水水洗蒸馏水水洗;入孵育液入孵育液,恒温恒温37,孵育孵育2060分钟分钟;自来水洗自来水洗;入入1%硫化铵硫化铵1分钟分钟;蒸馏水冲洗蒸馏水冲洗;甘油明胶封固。甘油明胶封固。(4)结果与评价结果与评价:棕黑色硫化铅沉淀为酶活性所在部位。棕黑色硫化铅沉淀为酶活性所在部位。(5)对照对照:可除去底物可除去底物,或以或以甘油磷酸钠代替底甘油磷酸钠代替底物物,或加入碱性磷酸酶抑制剂溴化四唑草或加入碱性磷酸酶抑制剂溴化四唑草酸盐可防止杂入的碱性磷酸酶起作用。酸盐可防止杂入的碱性磷酸酶起作用。四、四、葡萄糖葡萄糖6磷酸
13、酶磷酸酶(一一)名称名称常用名:葡萄糖6磷酸酶（Glucose-6-phosphatasePhosphohydro-lase）葡葡萄萄糖糖6磷磷酸酸酶酶是是一一种种催催化化多多种种磷磷酸酸化化合合物物水水解解的的磷磷酸酸酶酶。例例如如它它可可以以最最快快的的速速度度催催化化葡葡萄萄糖糖6磷磷酸酸水水解解,也也可可以以水水解解阿阿洛洛糖糖-6-磷磷酸酸、1,5-山山梨梨醇醇聚聚糖糖-6-磷磷酸酸、甘甘露露糖糖-6-磷磷酸酸、半半乳乳糖糖-6-磷磷酸酸、核核酸酸5磷磷酸酸及及2-甘甘油油磷磷酸酸,同同时时此此酶酶还还可可水水解解焦焦磷磷酸酸、核核苷苷三三磷磷酸酸,果果糖糖-6-磷磷酸酸、氨氨甲甲酰
14、酰基基-磷磷酸酸、磷磷酸酸烯烯醇醇丙丙酮酮酸、磷酰胺盐和某些其它焦磷酸化合物。酸、磷酰胺盐和某些其它焦磷酸化合物。（二）光镜显示方法（二）光镜显示方法铅法（铅法（Wachstei和和Meisel1956）（1）原原理理：葡葡萄萄糖糖6磷磷酸酸被被释释放放出出磷磷酸酸后后，为为硝硝酸酸铅铅所所捕捕获获，最最终终反反应应产产物物为为颗颗粒粒状状的硫化铅沉淀。的硫化铅沉淀。（2）孵育液的配制：）孵育液的配制：0.125%葡萄糖葡萄糖6磷酸钠磷酸钠4ml0.2MTris-苹果酸（苹果酸（Tris-Moleate）缓冲液缓冲液p64ml2%Pb(N03)20.6ml蒸蒸馏馏水水1.4ml新鲜配制新鲜配制
15、,充分混合后使用。充分混合后使用。（1）方法与步骤：）方法与步骤：新鲜组织新鲜组织,冰冻切片冰冻切片,3%冷福尔马林固定冷福尔马林固定5分钟分钟;水洗；水洗；入孵育液入孵育液,恒温恒温37,孵育孵育520分钟分钟;水洗；水洗；入入1%硫化胺硫化胺1分钟分钟;水洗；水洗；3中性福尔马林液后固定中性福尔马林液后固定10分钟；分钟；甘油明胶封固。甘油明胶封固。(4)结果与评价结果与评价:棕色硫化铅颗粒为活性所在部位。棕色硫化铅颗粒为活性所在部位。(5)对照对照:除去底物；除去底物；以以甘油磷酸钠代替葡甘油磷酸钠代替葡萄糖萄糖6钠盐钠盐；以以0.01M氟化钠作抑氟化钠作抑制剂。制剂。五、三磷酸腺苷酶五
16、、三磷酸腺苷酶(一一)名称名称常用名:三磷酸腺苷酶（三磷酸腺苷酶（Adenosinetriphosphatase，ATPase）(二二)反应原理反应原理ATP酶是分解酶是分解ATP产生产生ADP和磷酸的酶。和磷酸的酶。ATPase水解磷酸之间的高能键，释放大量的水解磷酸之间的高能键，释放大量的能量，而不是水解磷酸与碳之间的键。释放能量，而不是水解磷酸与碳之间的键。释放出来的磷酸离子被铅离子捕获，而通过形成出来的磷酸离子被铅离子捕获，而通过形成硫化铅沉淀显色。最适硫化铅沉淀显色。最适p7.2。根根据据ATP酶酶对对激激活活剂剂、抑抑制制剂剂的的不不同同反反应应，以以及及超超微微定定位位观观察察，
17、生生物物体体内内主主要要有三种三磷酸腺苷酶（有三种三磷酸腺苷酶（ATPase）。）。1、膜膜ATP酶酶：又又分分为为Na+、K+激激活活ATPase和和Mg2+激活激活ATPase；2、肌肌球球蛋蛋白白ATP酶酶：又又称称Ca2+激激活活ATPase，因为它可被，因为它可被Ca2+激活；激活；3、 线线 粒粒 体体 ATP酶酶 ： 由由 Mg2+激激 活活 的的ATPase（三）光镜显示方法（三）光镜显示方法1、Mg2+激活的三磷酸腺苷酶铅法激活的三磷酸腺苷酶铅法（1）原原理理：ATP酶酶分分解解ATP释释放放出出来来的的磷磷酸酸离离子子被被铅铅离离子子捕捕获获，通通过过形形成成硫化铅沉淀显色
18、。最适硫化铅沉淀显色。最适p值为值为7.2。（2）孵育液的配制：）孵育液的配制：三磷酸腺苷钠盐三磷酸腺苷钠盐5mg0.2MTris-盐酸（盐酸（Tris-HClbuffer）4ml2%Pb(N03)20.6ml0.1MMgSO41ml蒸馏水蒸馏水4.4ml配制时配制时Pb(N03)2要逐滴加入，并随时搅拌，使要逐滴加入，并随时搅拌，使充分混合至无色或淡乳白色。充分混合至无色或淡乳白色。（1）方法与步骤：）方法与步骤：新鲜组织新鲜组织,冰切片；冰切片；入孵育液，恒温入孵育液，恒温37孵育孵育2040分分钟钟蒸馏水洗；蒸馏水洗；入入1%硫化胺硫化胺1分钟分钟;流水洗；流水洗；甘油明胶封固。甘油明胶
19、封固。(4)结果结果:酶活性处呈棕黑色硫化铅沉淀。酶活性处呈棕黑色硫化铅沉淀。(5)对照对照:除去底物，则反应为阴性；除去底物，则反应为阴性；以以甘油磷酸钠代替底物，显示染色反应为碱性甘油磷酸钠代替底物，显示染色反应为碱性磷酸酶的定位。磷酸酶的定位。2、Ca2+激激活活的的三三磷磷酸酸腺腺苷苷酸酸钙钙-钴钴法法（肌肌球球蛋白型蛋白型ATPasePadykula和和Herman1995）（1）原原理理：此此法法类类似似碱碱性性磷磷酸酸酶酶的的钙钙-钴钴法法，但但底底物物改改用用三三磷磷酸酸腺腺苷苷钠钠盐盐，最最适适p值值为为9.0，对，对Mg2+型型ATPase起抑制作用。起抑制作用。（2）孵育
20、液的配制：）孵育液的配制：三磷酸腺苷钠盐三磷酸腺苷钠盐60mg0.1M巴比妥钠巴比妥钠4ml蒸馏水蒸馏水2ml0.18MCaCl22ml2,4二硝基苯酚二硝基苯酚30mg（1）方法与步骤：）方法与步骤：新鲜组织新鲜组织,冰冻切片；冰冻切片；入孵育液，恒温入孵育液，恒温37孵育孵育2040分钟分钟蒸馏水洗；蒸馏水洗；1CaCl2溶液换洗三次，每次溶液换洗三次，每次2分钟分钟蒸馏水洗；蒸馏水洗；入入CoCl2液液5分钟分钟;流水洗；流水洗；入硫化胺液入硫化胺液1分钟；分钟；流水洗；流水洗；甘油明胶封固。甘油明胶封固。(4)结果与评价结果与评价:硫化钴黑色沉淀为酶活性所在部位。硫化钴黑色沉淀为酶活性
21、所在部位。(5)对照对照:同铅法，可除去底物或用同铅法，可除去底物或用甘油磷酸钠作甘油磷酸钠作底物。底物。六、非特异性酯酶六、非特异性酯酶（一）名称（一）名称常用名：常用名：非特异性酯酶非特异性酯酶Nonspecificesterase）(二二)反应原理反应原理随各种方法的不同，其原理不相同。随各种方法的不同，其原理不相同。（三）、光镜显示方法（三）、光镜显示方法1、偶氮色素法（偶联偶氮色素法）、偶氮色素法（偶联偶氮色素法）由于使用不同的重氮盐，具体方法也不相同，由于使用不同的重氮盐，具体方法也不相同，现分述如下：现分述如下：(1)萘酚萘酚AS乙酸盐（乙酸盐（NaphtholASacetate
22、）法）法1）孵育液的配制：）孵育液的配制：1 萘萘 酚酚 AS乙乙 酸酸 盐盐 （ 丙丙 酮酮 溶溶 液液 ） 0.1ml0.05磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（pH7.0）10ml坚坚牢牢蓝蓝B盐盐30mg（搅拌过滤使用）（搅拌过滤使用）2）方法与步骤：）方法与步骤：新鲜组织恒冷箱切片，适当固定；新鲜组织恒冷箱切片，适当固定；入孵育液，室温或入孵育液，室温或37恒温孵育恒温孵育2030分分钟钟流水轻冲洗流水轻冲洗2分钟；分钟；2甲基绿复染细胞核；甲基绿复染细胞核；流水冲洗流水冲洗35分钟；分钟；甘油明胶封固。甘油明胶封固。3）结果与评价：）结果与评价：酶活性部位呈黑色，胞核为绿色。活性部酶活性部位呈
23、黑色，胞核为绿色。活性部位的染色根据重氮盐的不同而不同，坚牢红位的染色根据重氮盐的不同而不同，坚牢红TR为紫红色，坚牢蓝为紫红色，坚牢蓝RR为青铜色。为青铜色。七、脂酶七、脂酶（一）、名称（一）、名称常用名：脂（肪）酶（常用名：脂（肪）酶（Lipase）(二二)、反应原理、反应原理脂酶又名甘油酯水解酶，它能催化长链脂酶又名甘油酯水解酶，它能催化长链脂肪酸甘油（或其它醇）酯水解，脂肪酸甘油（或其它醇）酯水解，Ca2+、Sr2+、Mg2+、半胱氨酸、巯基乙酸和牛磺胆酸盐、半胱氨酸、巯基乙酸和牛磺胆酸盐（taurocholate）均能激活脂酶。）均能激活脂酶。（三）、光镜显示方法（三）、光镜显示方法
24、1、硫化铅法、硫化铅法（1）原理：以吐温为底物，在脂酶的作用下，）原理：以吐温为底物，在脂酶的作用下，分离出来的脂肪酸可与钙形成钙皂沉淀，进一步分离出来的脂肪酸可与钙形成钙皂沉淀，进一步以铅置换钙，最后再经硫化铵生成棕黑色硫化铅以铅置换钙，最后再经硫化铵生成棕黑色硫化铅沉淀。沉淀。（2）孵育液的配制：）孵育液的配制：5吐温吐温60（或（或80）水溶液）水溶液2ml0.2MTris缓冲液（缓冲液（pH7.27.4）5ml10%氯化钙氯化钙2ml蒸馏水蒸馏水40ml（3）方法与步骤：）方法与步骤：将冰冻切片或福尔马林固定的冰冻切片将冰冻切片或福尔马林固定的冰冻切片水洗水洗入孵育液，恒温入孵育液，恒
25、温37,孵育孵育23小时；小时；1%CaCl2液内浸洗液内浸洗;1Pb(NO3)2浸浸15分钟分钟;流水冲洗流水冲洗5分钟；分钟；0.50.1%硫化铵液内硫化铵液内1分钟；分钟；水洗；水洗；甘油明胶封固。甘油明胶封固。(4)结果与评价：结果与评价：磷酸黑色硫化铅沉淀为酯酶活性所在部位。磷酸黑色硫化铅沉淀为酯酶活性所在部位。（5）对照：）对照：去除底物吐温去除底物吐温60（或（或80），反应即为阴性。），反应即为阴性。八、乙酰胆碱酯酶和胆碱酯酶八、乙酰胆碱酯酶和胆碱酯酶(一一)名称名称常用名常用名:乙酰胆碱酯酶乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase),胆碱酯酶胆碱酯酶(choli
26、nesl-eraes)(二二)反应原理反应原理广广义义的的胆胆碱碱酯酯酶酶可可分分为为乙乙酰酰胆胆碱碱酯酯酶酶(AChE)和和狭狭义义的的胆胆碱碱酯酯酶酶(ChE)两两大大类类。二二者者的的化化学学性性质质不不同同。用用酯酯来来检检测测底底物物特特异异性性时时，AchE能能最最快快地地促促进进乙乙酰酰胆胆碱碱分分解解，也也能能分分解解乙乙酰酰基基甲甲基基胆胆碱碱，但但不不能能分分解解苯苯甲甲酰酰（基基）胆胆碱碱，同同时时，此此酶酶能能被被高高浓浓度度的的乙乙酰酰胆胆碱碱所所抑抑制制，但但是是ChE则则不同，乙酰胆碱浓度越高，越能被不同，乙酰胆碱浓度越高，越能被ChE所分解。所分解。（一）光镜显
27、示方法（一）光镜显示方法1、亚铁氰化铜法、亚铁氰化铜法（1）原理：利用乙酰胆碱酯酶能将乙（或丁）原理：利用乙酰胆碱酯酶能将乙（或丁）酰硫胆碱盐水解产生硫胆碱，使铁氰化物还原酰硫胆碱盐水解产生硫胆碱，使铁氰化物还原为亚铁氰化物，后者与铜离子结合成亚铁氰化为亚铁氰化物，后者与铜离子结合成亚铁氰化铜（铜（Copperferrocyanide）而呈色沉淀。证明）而呈色沉淀。证明酶活性的存在。若用四异丙基焦磷酰胺酶活性的存在。若用四异丙基焦磷酰胺(Tetraisopropylpyrophosphoramide),抑制非特异性胆抑制非特异性胆碱酯酶，就可以单独显示胆碱酯酶（碱酯酶，就可以单独显示胆碱酯酶（
28、AChE）。）。（2）孵育液的配制：）孵育液的配制：乙酰硫胆碱碘盐乙酰硫胆碱碘盐(acetylthiocholineiodide)5mg0.1M醋酸缓冲液醋酸缓冲液pH5.5(acetatebuffer)6.5ml0.1M（2.94%）柠檬酸钠）柠檬酸钠0.5ml30mM(0.75)CuSO41.0ml蒸馏水蒸馏水1ml5mM(0.164%)铁氰化钾铁氰化钾(potassiumferricyanide)1ml乙酰硫胆碱碘盐完全溶解于醋酸缓冲液后，乙酰硫胆碱碘盐完全溶解于醋酸缓冲液后，依次入其他溶液，临用前不超过依次入其他溶液，临用前不超过30分钟内配制分钟内配制，充分混匀至溶液呈亮绿色。最终，充分混匀至溶液呈亮绿色。最终pH5.55.6。（3）染色步骤：）染色步骤：新鲜组织，冰冻切片；新鲜组织，冰冻切片；固定：冷丙酮或固定：冷丙酮或10福尔马林固定福尔马林固定2025分钟；分钟；蒸馏水洗；蒸馏水洗；入孵育液入孵育液,室温或室温或37，恒温孵育，恒温孵育12小时；小时；蒸馏水洗；蒸馏水洗；甘油明胶封固。甘油明胶封固。
