中药成分测定方法经典实用

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1、第四章第四章 中药的含量测定中药的含量测定 1中药成分测定方法第一节第一节 含量测定的目的与意义含量测定的目的与意义 中药的含量测定与化药有很大区别中药的含量测定与化药有很大区别中药组成复杂，产生疗效的不是某单一成分，中药组成复杂，产生疗效的不是某单一成分，检测任检测任何一种活性成分均不能反映中药的整体疗效何一种活性成分均不能反映中药的整体疗效。但是借鉴化药质量控制模式，测定某一味药味的有效但是借鉴化药质量控制模式，测定某一味药味的有效成分、活性成分、指标性成分的含量的方法，对于成分、活性成分、指标性成分的含量的方法，对于控控制中药质量起着不可替代的重要作用制中药质量起着不可替代的重要作用。通

2、过测定中药中有效成分、毒性成分或某些指标性成通过测定中药中有效成分、毒性成分或某些指标性成分的含量来分的含量来衡量其制剂工艺的稳定性和中药材的质量衡量其制剂工艺的稳定性和中药材的质量优劣优劣，以保证中药的质量，达到临床用药安全、有效，以保证中药的质量，达到临床用药安全、有效的目的。的目的。 2中药成分测定方法第二节第二节 含量测定样品的处理含量测定样品的处理 样品处理的主要作用有：样品处理的主要作用有： 将被测成分有效地从样品中释放出来，并制成便于将被测成分有效地从样品中释放出来，并制成便于分析测定的稳定试样。分析测定的稳定试样。 除去杂质、纯化样品，以提高分析方法的重现性和除去杂质、纯化样品

3、，以提高分析方法的重现性和准确度。准确度。 富集浓缩或进行衍生化，以测定低含量被测成分。富集浓缩或进行衍生化，以测定低含量被测成分。衍生化不仅可提高检测器的灵敏度，还可以提高方法的衍生化不仅可提高检测器的灵敏度，还可以提高方法的选择性。选择性。 使试样的形式及所用溶剂符合分析测定的要求。使试样的形式及所用溶剂符合分析测定的要求。 3中药成分测定方法第二节第二节 含量测定样品的处理含量测定样品的处理 一、样品的粉碎一、样品的粉碎 1. 1.目的目的： 是保证含量测定所取样品均匀而有代表性，提高测定结果的是保证含量测定所取样品均匀而有代表性，提高测定结果的精密度和准确度；精密度和准确度； 是使样品

4、中的被测组分能更快地完全提取出来。是使样品中的被测组分能更快地完全提取出来。2.2.粉碎时粉碎时注意事项注意事项： 不要粉碎得过细。样品粉碎得过细，在样品提取时，会造成不要粉碎得过细。样品粉碎得过细，在样品提取时，会造成过滤困难，因此可视实际情况进行粉碎过筛。过滤困难，因此可视实际情况进行粉碎过筛。 避免污染样品。在粉碎样品时，要尽量避免由于设备的磨损避免污染样品。在粉碎样品时，要尽量避免由于设备的磨损或不干净等原因而玷污样品，或不干净等原因而玷污样品， 防止粉尘飞散或挥发性成分的损失。防止粉尘飞散或挥发性成分的损失。 过筛时，通不过筛孔的部分颗粒决不能丢弃，必须反复粉碎过筛时，通不过筛孔的部

5、分颗粒决不能丢弃，必须反复粉碎或碾磨，让其全部通过筛孔。或碾磨，让其全部通过筛孔。4中药成分测定方法第二节第二节 含量测定样品的处含量测定样品的处理理 二、样品的提取二、样品的提取 对于中药材和固体制剂样品，在粉碎后，取粉末适对于中药材和固体制剂样品，在粉碎后，取粉末适量精密称定，首先用溶剂进行提取，使被测组分和某些量精密称定，首先用溶剂进行提取，使被测组分和某些共存组分从中溶解出来（前者必须完全溶出），与滤渣共存组分从中溶解出来（前者必须完全溶出），与滤渣分离后，再对被测组分进行含量测定。分离后，再对被测组分进行含量测定。常见的提取方法常见的提取方法：Y 冷浸法冷浸法 Y 回流提取法回流提取

6、法 Y 连续回流提取法连续回流提取法 Y 超声提取法超声提取法 Y 超临界流体提取法超临界流体提取法5中药成分测定方法第二节第二节 含量测定样品的处理含量测定样品的处理 三、样品的分离净化三、样品的分离净化 （一）沉淀法（一）沉淀法（二）蒸馏法（二）蒸馏法 （三）液一液萃取法（三）液一液萃取法（LLELLE）（四）色谱法（四）色谱法 6中药成分测定方法第二节第二节 含量测定样品的处含量测定样品的处理理 （四）色谱法（四）色谱法 吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱和凝胶色谱皆可作为中吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱和凝胶色谱皆可作为中药制剂分析中的净化分离方法，其操作方式有柱色谱，薄层色谱药制剂分

7、析中的净化分离方法，其操作方式有柱色谱，薄层色谱和纸色谱。和纸色谱。 其中经典微柱色谱，也称固相萃取或液其中经典微柱色谱，也称固相萃取或液固萃取（固萃取（LSELSE）具有）具有设备简单，使用方便，快速，净化效率较高而最常用，将在此做设备简单，使用方便，快速，净化效率较高而最常用，将在此做一简介。一简介。 LSE LSE通常是指样品溶液加到装有合适固定相（净化剂）的长通常是指样品溶液加到装有合适固定相（净化剂）的长5515cm15cm，内径，内径0.50.51cm1cm的色谱柱中，将被测成分保留于柱上，洗的色谱柱中，将被测成分保留于柱上，洗去杂质后，再洗脱被测成分进行测定，或者是使杂质强烈保留

8、于去杂质后，再洗脱被测成分进行测定，或者是使杂质强烈保留于柱上，直接洗脱被测成分进行测定。用这种选择性好而柱效较低柱上，直接洗脱被测成分进行测定。用这种选择性好而柱效较低的方法进行样品的净化分离，尤其适用于一类总成分的含量测定，的方法进行样品的净化分离，尤其适用于一类总成分的含量测定，也可将色谱柱流出的样品进一步用也可将色谱柱流出的样品进一步用GCGC、HPLCHPLC、TCLTCL分离后测定。分离后测定。 LSE LSE的常用净化剂（填料）有氧化铝、氧化镁、硅藻土、硅胶、的常用净化剂（填料）有氧化铝、氧化镁、硅藻土、硅胶、活性炭、大孔树脂离子交换树脂、键合相硅胶活性炭、大孔树脂离子交换树脂、

9、键合相硅胶C8C8、C18C18、聚酰胺等。、聚酰胺等。视其性质可分为亲脂型、亲水型和离子交换型填料。视其性质可分为亲脂型、亲水型和离子交换型填料。 7中药成分测定方法第二节第二节 含量测定样品的处理含量测定样品的处理 硅胶、氧化铝等：硅胶、氧化铝等：它们是传统的吸附剂，多以它们是传统的吸附剂，多以0.070.070.15mm0.15mm(200(200100100目目) )的的颗粒颗粒1 15g5g用于样品的净化处理，其作用机制为溶质在吸附剂用于样品的净化处理，其作用机制为溶质在吸附剂表面的极性吸附作用。通常是当表面的极性吸附作用。通常是当溶于有机溶剂的样品溶于有机溶剂的样品加到柱上加到柱上

10、时非极性或时非极性或低极性的杂质先被洗出低极性的杂质先被洗出色谱柱，再用适当极性的溶色谱柱，再用适当极性的溶剂洗脱被测成分，而强极性的杂质仍保留在柱上。剂洗脱被测成分，而强极性的杂质仍保留在柱上。 氧化铝能将黄酮类吸附在柱上，用于生物碱、苷类等的测氧化铝能将黄酮类吸附在柱上，用于生物碱、苷类等的测定。例如用法（吸收系数法）定。例如用法（吸收系数法） 硅胶适合于分离中性或酸性化合物，强烈保留碱性化合物。硅胶适合于分离中性或酸性化合物，强烈保留碱性化合物。若把样品提取液加到柱上，依次用极性由小到大的溶剂洗脱，若把样品提取液加到柱上，依次用极性由小到大的溶剂洗脱，则可以将杂质和被测成分分离。则可以将

11、杂质和被测成分分离。8中药成分测定方法键合相硅胶：键合相硅胶： 十八烷基键合相硅胶（简称十八烷基键合相硅胶（简称C18C18或或ODSODS）是常用的固体萃取）是常用的固体萃取剂，其次有烷基、苯基、氰基键合相硅胶，可用来分开脂溶性剂，其次有烷基、苯基、氰基键合相硅胶，可用来分开脂溶性和水溶性杂质或成分。也常用于萃取，纯化水基质体液中憎水和水溶性杂质或成分。也常用于萃取，纯化水基质体液中憎水性药物。该类性药物。该类LSELSE的一般操作程序为：的一般操作程序为：1)1)柱的活化。用柱的活化。用2ml2ml甲醇冲洗以润湿键合相和除去杂质，再用甲醇冲洗以润湿键合相和除去杂质，再用0.50.5毫升水洗

12、去柱中的甲醇。毫升水洗去柱中的甲醇。2)2)上样。上样。3)3)清洗。用清洗。用2 25ml5ml的的水水清洗以清洗以除去弱保留的亲水成分除去弱保留的亲水成分，如无机盐、，如无机盐、氨基酸、亲水的蛋白质、糖以及中等保留成分的极性化合物、氨基酸、亲水的蛋白质、糖以及中等保留成分的极性化合物、低肽等。低肽等。4)4)洗脱。用洗脱。用2 25ml5ml甲醇或甲醇甲醇或甲醇- -水洗脱水洗脱大分子的肽、甾体、较亲脂大分子的肽、甾体、较亲脂的药物等强保留的待测组分。的药物等强保留的待测组分。 第二节第二节 含量测定样品的处含量测定样品的处理理 9中药成分测定方法大孔树脂：它可分为极性和非极性型大孔树脂：

13、它可分为极性和非极性型 极性极性 丙烯酰胺聚合物丙烯酰胺聚合物; ; 非极性非极性 苯乙烯和二乙烯苯的共聚物苯乙烯和二乙烯苯的共聚物. . 其吸附性质与烷基键合相硅胶相似，通过疏水作用其吸附性质与烷基键合相硅胶相似，通过疏水作用对非极性水溶性成份有吸附力。例如在测定复方归芪剂对非极性水溶性成份有吸附力。例如在测定复方归芪剂中的黄芪甲苷时，用大孔树脂除去水溶性的多糖杂质，中的黄芪甲苷时，用大孔树脂除去水溶性的多糖杂质，再用再用30%30%乙醇洗脱黄芪甲苷。大孔树脂的主要特点是表乙醇洗脱黄芪甲苷。大孔树脂的主要特点是表面积极大，传质速率较高和具有不同的极性及适于吸附面积极大，传质速率较高和具有不同

14、的极性及适于吸附较大分子。较大分子。 树脂在使用前需要前处理：用甲醇、乙醇、丙酮等树脂在使用前需要前处理：用甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂除去杂质，有时还需用酸、碱清洗。该填料用有机溶剂除去杂质，有时还需用酸、碱清洗。该填料用量常为量常为1 12g2g，有时也用，有时也用100100150mg150mg来萃取血、尿中药来萃取血、尿中药物，操作程序类似物，操作程序类似ODSODS填料。填料。 第二节第二节 含量测定样品的处含量测定样品的处理理 10中药成分测定方法第二节第二节 含量测定样品的处含量测定样品的处理理 聚酰胺：聚酰胺： 它是常用的有机吸附剂，主要通过与它是常用的有机吸附剂，主要通过与溶质

15、形成氢键而产生吸附作用。溶质形成氢键而产生吸附作用。 常用于含酚、酸、醌类药物样品液的常用于含酚、酸、醌类药物样品液的净化分离，净化分离， 如测定黄酮时，用样品的乙醇提取液如测定黄酮时，用样品的乙醇提取液上柱，水洗去部分杂质，以上柱，水洗去部分杂质，以95%95%乙醇洗脱总乙醇洗脱总黄酮后测定。黄酮后测定。11中药成分测定方法第二节第二节 含量测定样品的处含量测定样品的处理理 硅藻土、纤维素：硅藻土、纤维素： 它它们们为为常常用用的的亲亲水水型型填填料料，其其原原理理为为分分配配作作用用。填填料料作作为为支支持持剂剂，多多以以水水基基质质液液作作为为固固定定相相，与与水水不不混混溶溶的的有有机

16、机溶溶剂剂为为流流动动相相，较较亲亲脂脂的的成成分分从从固固定定相相转转移移到到流流动动相相，而而被被洗洗脱脱，达达到到萃萃取取的的目目的的。其其萃萃取取率率较较高高（一一般般大大于于80%80%），无无浓浓集集作作用用，萃萃取取液液较较纯纯净净，但洗脱剂用量较大（一般大于但洗脱剂用量较大（一般大于5ml5ml） 硅硅藻藻土土柱柱则则用用干干柱柱直直接接上上样样，柱柱可可再再生生。常常见见牌牌号号为为ExtretutExtretut。纤纤维维素素柱柱的的使使用用与与硅硅藻土柱相似。藻土柱相似。 12中药成分测定方法离子交换树脂：离子交换树脂： 憎水基质的离子交换树脂兼有离子交换憎水基质的离子交

17、换树脂兼有离子交换剂及大孔树脂的一些性质，所以对于在水中剂及大孔树脂的一些性质，所以对于在水中溶解度不大的药物、洗脱剂中需含一定量的溶解度不大的药物、洗脱剂中需含一定量的有机溶剂。有机溶剂。 离子交换树脂柱可用于除去样品中的离离子交换树脂柱可用于除去样品中的离子，防止组分分解，更常用于萃取样品液中子，防止组分分解，更常用于萃取样品液中可离解化合物。可离解化合物。第二节第二节 含量测定样品的处含量测定样品的处理理 13中药成分测定方法第二节第二节 含量测定样品的处含量测定样品的处理理 此外，近年来发展起来的固相微此外，近年来发展起来的固相微萃取萃取(Solid-Phase (Solid-Phas

18、e microextraction, SPME)microextraction, SPME)和液相微萃和液相微萃取取(Liquid- Phase (Liquid- Phase microextraction,LPME)microextraction,LPME)技术有良好技术有良好的应用前景。的应用前景。SPMESPME是一种无溶剂的萃是一种无溶剂的萃取技术，取样方式有直接取样和顶空取技术，取样方式有直接取样和顶空取样。取样。14中药成分测定方法（五）消化法五）消化法 对样品进行有机破坏，常用于中药制剂中重金属的检查。对样品进行有机破坏，常用于中药制剂中重金属的检查。 常用的破坏方法有湿法消化和

19、干法消化法。常用的破坏方法有湿法消化和干法消化法。 湿法消化：根据所用试剂不同，下面介绍三种常见的消湿法消化：根据所用试剂不同，下面介绍三种常见的消化方法。化方法。 （1 1）硝酸）硝酸高氯酸法高氯酸法 该法破坏能力强，反应较激烈，故该法破坏能力强，反应较激烈，故进行破坏时，必须严密注意切勿将容器中的溶液蒸干，以免发进行破坏时，必须严密注意切勿将容器中的溶液蒸干，以免发生爆炸。本法适用于血，尿、组织等生物样品和含动植物药制生爆炸。本法适用于血，尿、组织等生物样品和含动植物药制剂的破坏，经破坏后所得无机金属离子均为高价态，本法对含剂的破坏，经破坏后所得无机金属离子均为高价态，本法对含氮杂环类有机

20、物破坏不够完全。氮杂环类有机物破坏不够完全。 （2 2）硝酸）硝酸硫酸法硫酸法 该法适用于大多数有机物质的破坏，该法适用于大多数有机物质的破坏，无机金属离子均氧化成高价态，与硫酸形成不溶性硫酸盐的金无机金属离子均氧化成高价态，与硫酸形成不溶性硫酸盐的金属离子的测定，不宜采有此法。属离子的测定，不宜采有此法。 第二节第二节 含量测定样品的处含量测定样品的处理理 15中药成分测定方法第二节第二节 含量测定样品的处含量测定样品的处理理 （3 3）硫酸）硫酸硫酸盐法硫酸盐法 本法所用硫酸盐为硫酸钾或无水硫酸纳，加入本法所用硫酸盐为硫酸钾或无水硫酸纳，加入硫酸盐的目的是为了提高硫酸的沸点，以使样品破硫酸

21、盐的目的是为了提高硫酸的沸点，以使样品破坏加速完全。同时防止硫酸在加热过程中过早地分坏加速完全。同时防止硫酸在加热过程中过早地分解为解为SO3SO3而损失。经本法破坏所得金属离子，多为而损失。经本法破坏所得金属离子，多为低价态。本法常用于含砷或锑的有机样品的破坏，低价态。本法常用于含砷或锑的有机样品的破坏，破坏后得到三价砷或锑。破坏后得到三价砷或锑。 湿法消化所用的仪器，一般为硅玻璃或硼玻璃湿法消化所用的仪器，一般为硅玻璃或硼玻璃制成的凯氏瓶（直火加热）或聚四氟乙烯消化罐制成的凯氏瓶（直火加热）或聚四氟乙烯消化罐（烘箱中加热）。所用试剂应为优级纯，水应为去（烘箱中加热）。所用试剂应为优级纯，水

22、应为去离子水或高纯水，同时必须按相同条件进行空白实离子水或高纯水，同时必须按相同条件进行空白实验校正。操作时应在通风橱内进行。验校正。操作时应在通风橱内进行。 16中药成分测定方法第二节第二节 含量测定样品的处含量测定样品的处理理 干法消化干法消化 本法是将有机物灼烧灰化以达分解的目的，将适量样品置本法是将有机物灼烧灰化以达分解的目的，将适量样品置于瓷坩锅、镍坩锅或铂坩埚中，常加无水于瓷坩锅、镍坩锅或铂坩埚中，常加无水Na2CO3Na2CO3或轻质或轻质MgOMgO等以等以助灰化，混匀后，先小火加热，使样品完全炭化，然后放入高助灰化，混匀后，先小火加热，使样品完全炭化，然后放入高温炉中灼烧，使

23、其灰化完全即可。本法不适用于含易挥发性金温炉中灼烧，使其灰化完全即可。本法不适用于含易挥发性金属（如汞、砷等，）有机样品的破坏。属（如汞、砷等，）有机样品的破坏。 应用本法时要注意以下几个问题：应用本法时要注意以下几个问题： 1 1）加热灼烧时，控制温度在）加热灼烧时，控制温度在420420以下，以免某些被测金以下，以免某些被测金属化合物的挥发。属化合物的挥发。 2 2）灰化完全与否，直接影响测定结果的准确度。如欲检查）灰化完全与否，直接影响测定结果的准确度。如欲检查灰化是否完全，可将灰分放冷后，加入稍过量的稀灰化是否完全，可将灰分放冷后，加入稍过量的稀HCl-HCl-水水（1:31:3）或硝

24、酸）或硝酸- -水（水（1:31:3）溶液，振摇。若呈色或有不溶有机物，）溶液，振摇。若呈色或有不溶有机物，可于水浴上将溶液蒸干，并用小火炭化后，再行灼烧。可于水浴上将溶液蒸干，并用小火炭化后，再行灼烧。 3 3）经本法破坏后，所得灰分往往不易溶解，但此时切勿弃）经本法破坏后，所得灰分往往不易溶解，但此时切勿弃去。去。17中药成分测定方法第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法 | 分类重量分析和滴定分析。分类重量分析和滴定分析。| 化学分析法所用仪器简单，结果准确。化学分析法所用仪器简单，结果准确。| 主要用于测定制剂中含量较高的一些成分及主要用于测定制剂中含量较高的一些成分及含矿物药

25、制剂中的无机成分，如总生物碱类、总含矿物药制剂中的无机成分，如总生物碱类、总酸类、总皂苷及矿物药制剂等。酸类、总皂苷及矿物药制剂等。| 化学分析法有一定的局限性，其灵敏度低，化学分析法有一定的局限性，其灵敏度低，操作繁琐、耗时长，专属性不高，对于微量成分操作繁琐、耗时长，专属性不高，对于微量成分准确性不理想。准确性不理想。18中药成分测定方法第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法（一）重量分析法（一）重量分析法 重量法可分为挥发法、萃取法和沉淀法。重量法可分为挥发法、萃取法和沉淀法。 1 1、挥发法可测定具有挥发性或能定量转化为挥发性物质、挥发法可测定具有挥发性或能定量转化为挥发性物质

26、的组分含量。如：的组分含量。如：供试品的干燥失重测定；供试品的干燥失重测定；水分测定均属水分测定均属挥发法；挥发法；中药制剂分析中灰分及炽灼残渣的测定等。中药制剂分析中灰分及炽灼残渣的测定等。 2 2、萃取法是根据被测组分在互不相溶的两相中溶解度的、萃取法是根据被测组分在互不相溶的两相中溶解度的不同，达到分离的目的。如不同，达到分离的目的。如冰硼散中冰片的含量测定；冰硼散中冰片的含量测定；地地奥心血康胶囊中甾体总皂苷含量测定；奥心血康胶囊中甾体总皂苷含量测定；昆明山海棠片中总生昆明山海棠片中总生物碱的含量测定；物碱的含量测定；甘草浸膏中甘草酸的含量测定即采用萃取甘草浸膏中甘草酸的含量测定即采用

27、萃取法。法。 3 3、沉淀法是将被测组分定量转化为难溶化合物，测定其、沉淀法是将被测组分定量转化为难溶化合物，测定其含量的方法，适用于制剂中纯度较高的成分。如含量的方法，适用于制剂中纯度较高的成分。如西瓜霜润喉西瓜霜润喉片中西瓜霜的含量测定；片中西瓜霜的含量测定；苦参片中苦参总碱的含量测定；苦参片中苦参总碱的含量测定；复方元胡注射液总碱的测定。复方元胡注射液总碱的测定。 19中药成分测定方法第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法（二）滴定分析法二）滴定分析法 滴定分析法分为酸碱滴定法、沉淀滴定法、配位滴定法滴定分析法分为酸碱滴定法、沉淀滴定法、配位滴定法和氧化还原滴定法。和氧化还原滴定

28、法。 1 1、酸碱滴定法、酸碱滴定法 适用于测定中药制剂中所含有的生物碱、有机酸、内酯适用于测定中药制剂中所含有的生物碱、有机酸、内酯类等酸、碱组分的含量。类等酸、碱组分的含量。 直接滴定：对于直接滴定：对于KC10KC10-8-8的酸、碱组分，可在水溶液的酸、碱组分，可在水溶液中直接滴定。如：止喘灵注射液中总生物碱的含量测定、颠中直接滴定。如：止喘灵注射液中总生物碱的含量测定、颠茄酊中生物碱的含量测定。茄酊中生物碱的含量测定。 间接滴定或非水滴定法：如大山楂丸中总酸性物质的间接滴定或非水滴定法：如大山楂丸中总酸性物质的含量测定、草乌注射液中生物碱的含量测定等。含量测定、草乌注射液中生物碱的含

29、量测定等。2 2、沉淀滴定法、沉淀滴定法 主要用于生物碱、生物碱的氢卤酸盐及含卤素的其他有主要用于生物碱、生物碱的氢卤酸盐及含卤素的其他有机成分的含量测定。机成分的含量测定。20中药成分测定方法第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法3 3、配位滴定法、配位滴定法 包括包括EDTAEDTA法和硫氰酸铵法，在中药制剂分析中，法和硫氰酸铵法，在中药制剂分析中，用以测定鞣质、生物碱及含用以测定鞣质、生物碱及含Ca2+Ca2+、Mg2+Mg2+、Fe3+Fe3+、Hg2+Hg2+等矿物类制剂的含量。如等矿物类制剂的含量。如万氏牛黄清心丸等万氏牛黄清心丸等的含量测定就采用硫氰酸铵法；的含量测定就采

30、用硫氰酸铵法；牛黄解毒片中石牛黄解毒片中石膏的含量测定。膏的含量测定。4 4、氧化还原滴定法、氧化还原滴定法 适用于测定具有氧化还原性的物质，如含酚类、适用于测定具有氧化还原性的物质，如含酚类、糖类及矿物药糖类及矿物药FeFe、AsAs等成分的中药制剂。如等成分的中药制剂。如磁朱磁朱丸中全铁的含量测定采用铈量法；丸中全铁的含量测定采用铈量法；牛黄解毒片中牛黄解毒片中雄黄的含量测定；雄黄的含量测定；丹皮酚注射液中丹皮酚的含量丹皮酚注射液中丹皮酚的含量测。测。 21中药成分测定方法第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法二、可见一紫外分光光度法二、可见一紫外分光光度法 该法是中药及其制剂含量

31、测定的一种常该法是中药及其制剂含量测定的一种常用方法用方法, ,具有灵敏度高，精度好和操作简便具有灵敏度高，精度好和操作简便等优点。等优点。 该法要求被测成分本身或其显色产物对该法要求被测成分本身或其显色产物对可见可见紫外光具有选择性吸收。按测定波长紫外光具有选择性吸收。按测定波长数目不同分为单波长光谱法和多波长光谱法。数目不同分为单波长光谱法和多波长光谱法。22中药成分测定方法第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法（一）单波长光谱法（一）单波长光谱法分类分类方法方法特点特点吸收系数法吸收系数法测定所配供试品溶液在规定波长的吸测定所配供试品溶液在规定波长的吸收度，根据被测成分的吸收系数

32、收度，根据被测成分的吸收系数（E E1%1%1cm1cm）计算其含量）计算其含量对仪器要求高，使用该法时，对仪器要求高，使用该法时，应注意仪器波长、空白吸收的应注意仪器波长、空白吸收的校正，吸收度准确度的检定和校正，吸收度准确度的检定和杂散光的检查杂散光的检查无需对照品，方法简便无需对照品，方法简便对照品比较法对照品比较法在同样条件下配制对照品溶液和供试在同样条件下配制对照品溶液和供试溶液，且使前者中所含被测成分的量溶液，且使前者中所含被测成分的量应为后者中被测成分的量的应为后者中被测成分的量的100%10%100%10%，用规定波测定二者的吸，用规定波测定二者的吸收度，则可计算出供试品中被测

33、成分收度，则可计算出供试品中被测成分的浓度或含量的浓度或含量对仪器要求较高对仪器要求较高标准曲线法标准曲线法配制一系列不同浓度的对照品溶液配制一系列不同浓度的对照品溶液（常为（常为5 5个），在相同条件下分别测个），在相同条件下分别测定吸收度，绘制定吸收度，绘制A-CA-C曲线，或求出其曲线，或求出其回归直线方程（相关系数回归直线方程（相关系数r0.999r0.999），），即得标准曲线。在相同条件下，测定即得标准曲线。在相同条件下，测定供试品溶液的吸收度，就可求得供试供试品溶液的吸收度，就可求得供试品中被测成分的浓度或含量。品中被测成分的浓度或含量。本法对仪器的精度要求不高，本法对仪器的精度

34、要求不高，有时标准曲线不通过原点，只有时标准曲线不通过原点，只要重现性好也可使用要重现性好也可使用该法在比色法中最常用该法在比色法中最常用23中药成分测定方法第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法（二）多波长光谱法（计算分光光度法）（二）多波长光谱法（计算分光光度法） 供试品溶液中若有多种（两种或两种以上）供试品溶液中若有多种（两种或两种以上）组分共存，其紫外光谱彼此发生不同程度的重叠组分共存，其紫外光谱彼此发生不同程度的重叠时，则可通过测定多种波长处的吸收度，根据吸时，则可通过测定多种波长处的吸收度，根据吸收度的加和性，采用适当的数学处理方式进行多收度的加和性，采用适当的数学处理方式

35、进行多组分的同时测定，或者用其排除共存组分干扰，组分的同时测定，或者用其排除共存组分干扰，测定其中的某个组分。这就属于多波长光谱法的测定其中的某个组分。这就属于多波长光谱法的范畴。范畴。 下面简要介绍用多波长法测定存在光谱干扰下面简要介绍用多波长法测定存在光谱干扰的多组分样品中某个组分的一些技术：的多组分样品中某个组分的一些技术：双波长法双波长法（包括等吸收点法和系数倍率法）、三波长法、（包括等吸收点法和系数倍率法）、三波长法、导数光谱法和差示光谱法等。导数光谱法和差示光谱法等。 24中药成分测定方法第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法优点是可省去或简化样品预处理步骤，测定组成已知的

36、复优点是可省去或简化样品预处理步骤，测定组成已知的复杂样品，但是使用该法应慎重。杂样品，但是使用该法应慎重。 首先因为中药及其制剂的供试品溶液往往组成复杂，首先因为中药及其制剂的供试品溶液往往组成复杂，甚至干扰组分或阴性空白样品的变动性大，因此，使得其甚至干扰组分或阴性空白样品的变动性大，因此，使得其方法的适应性差，而只适应于同批样品或内控应用，目前方法的适应性差，而只适应于同批样品或内控应用，目前很少在药典和新药报批中使用多波长法作为中药制剂含量很少在药典和新药报批中使用多波长法作为中药制剂含量测定方法。测定方法。 再者，当测定的吸收度处在吸收曲线的陡峭部位时，再者，当测定的吸收度处在吸收曲

37、线的陡峭部位时，波长的微小变动可能对测定结果造成显著的偶然误差。波长的微小变动可能对测定结果造成显著的偶然误差。 还有在实际工作中，由于测试条件的变化，仪器精度还有在实际工作中，由于测试条件的变化，仪器精度与性能的限制，多波长法不用吸收系数法，而采用标准品与性能的限制，多波长法不用吸收系数法，而采用标准品对比的方法（常用标准曲线法）来进行样品的测定。对比的方法（常用标准曲线法）来进行样品的测定。 25中药成分测定方法第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法三、薄层扫描法三、薄层扫描法 薄层扫描法是以薄层色谱法为基础发展起来薄层扫描法是以薄层色谱法为基础发展起来的薄层色谱组分原位分析方法及

38、薄层色谱的记录的薄层色谱组分原位分析方法及薄层色谱的记录方法，又称薄层色谱扫描法（方法，又称薄层色谱扫描法（TLCS），相应仪），相应仪器称为薄层扫描仪（器称为薄层扫描仪（Thin Layer Chromatogram Scanner）。）。 薄层扫描法是用一定波长的光照射在薄层板薄层扫描法是用一定波长的光照射在薄层板上，对薄层色谱中吸收紫外光或可见光的斑点，上，对薄层色谱中吸收紫外光或可见光的斑点，或经激发后能发射出荧光的斑点进行扫描，将扫或经激发后能发射出荧光的斑点进行扫描，将扫描得到的图谱及积分数据用于药品的鉴别、杂质描得到的图谱及积分数据用于药品的鉴别、杂质检查或含量测定。检查或含量测

39、定。26中药成分测定方法第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法（一）基本原理（一）基本原理 薄层扫描法是指薄层色谱斑点的色谱扫薄层扫描法是指薄层色谱斑点的色谱扫描，薄层色谱扫描是指固定波长，斑点移动，描，薄层色谱扫描是指固定波长，斑点移动，测定测定A-lA-l或或F-lF-l曲线。根据薄层扫描的测定方曲线。根据薄层扫描的测定方式分为式分为薄层吸收扫描法薄层吸收扫描法和和薄层荧光扫描法薄层荧光扫描法二二种方法。种方法。27中药成分测定方法第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法1 1、薄层吸收扫描法、薄层吸收扫描法 基本原理：基本原理：Kubelka-MunkKubelka-Mun

40、k理论及曲线。由于薄层板存在理论及曲线。由于薄层板存在明显的散射现象，斑点中物质的浓度与吸光度的关系需用明显的散射现象，斑点中物质的浓度与吸光度的关系需用Kubelka-MunkKubelka-Munk理论及曲线来描述。理论及曲线来描述。Kubelka-MunkKubelka-Munk理论以斑点理论以斑点的相对的相对反射率反射率和相对透光率计算薄层色谱斑点的吸光度，说和相对透光率计算薄层色谱斑点的吸光度，说明了固定相的散射参数明了固定相的散射参数SXSX对斑点中物质的浓度与吸光度间关对斑点中物质的浓度与吸光度间关系的影响，获得不同散射参数系的影响，获得不同散射参数SXSX时斑点的时斑点的A-K

41、XA-KX理论曲线，即理论曲线，即Kubelka-MunkKubelka-Munk曲线。曲线。 光源：钨灯和氘灯；光源：钨灯和氘灯； 灵敏度：在灵敏度：在200-800nm200-800nm波长范围内选择合适波长进行测定，波长范围内选择合适波长进行测定，其灵敏度可达其灵敏度可达ngng级；级； 适用范围：适用于在可见、紫外区有吸收的物质，及通适用范围：适用于在可见、紫外区有吸收的物质，及通过色谱前或色谱后衍生成上述化合物的样品组分。过色谱前或色谱后衍生成上述化合物的样品组分。28中药成分测定方法2 2、薄层荧光扫描法、薄层荧光扫描法 基本原理：基本原理：F=2.3KIF=2.3KI。ECLEC

42、L或或F=KCF=KC 光源：氙灯或汞灯。光源：氙灯或汞灯。 灵敏度：最低可测到灵敏度：最低可测到10-50pg10-50pg。 适用范围：适合于本身具有荧光或经过适当处理适用范围：适合于本身具有荧光或经过适当处理后可产生荧光的物质的测定。后可产生荧光的物质的测定。 Kubelka-MunkKubelka-Munk理论不适用于薄层荧光扫描，无需理论不适用于薄层荧光扫描，无需进行曲线校直。用薄层荧光扫描进行定量分析时，用进行曲线校直。用薄层荧光扫描进行定量分析时，用斑点荧光强度的积分值（色谱峰峰面积）与斑点中组斑点荧光强度的积分值（色谱峰峰面积）与斑点中组分的含量代替上式中分的含量代替上式中F

43、F与与C C 进行运算。进行运算。第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法29中药成分测定方法（二）薄层色谱的规范化操作（二）薄层色谱的规范化操作1 1、仪器与材料、仪器与材料薄层板；薄层板；涂布器；涂布器；点样器材；点样器材；展开箱展开箱（层析缸）（层析缸）显色与检测仪器显色与检测仪器2 2、操作方法、操作方法薄层板的制备；薄层板的制备；点样；点样；展开；展开；检测；检测；第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法30中药成分测定方法第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法（三）定量分析方法（三）定量分析方法1 1、方法学考察、方法学考察 新建薄层扫描定量方法必须进行方新建薄

44、层扫描定量方法必须进行方法考察，以说明新建方法的可靠性，考法考察，以说明新建方法的可靠性，考察的内容有工作曲线、定量结果的精密察的内容有工作曲线、定量结果的精密度及准确度、统计检验等内容。度及准确度、统计检验等内容。31中药成分测定方法（1 1）工作曲线）工作曲线 检查所选择的散射参数检查所选择的散射参数SXSX值是否适宜。值是否适宜。SXSX值适宜则工值适宜则工作曲线被校直为直线，否则，调整作曲线被校直为直线，否则，调整SXSX值再校正，直至在一定值再校正，直至在一定点样量范围内工作曲线成直线为止。点样量范围内工作曲线成直线为止。 考察工作曲线是否过原点，以便确定采用一点法或二考察工作曲线是

45、否过原点，以便确定采用一点法或二点法定量。点法定量。 确定点样量的线性范围。既使采用曲线校直，也只是确定点样量的线性范围。既使采用曲线校直，也只是在一定点样量范围内工作曲线为直线，因此需确定点样量的在一定点样量范围内工作曲线为直线，因此需确定点样量的上、下限。上、下限。 为降低定量误差，最好调整点样量，使供试品与对照品为降低定量误差，最好调整点样量，使供试品与对照品的峰面积相接近。的峰面积相接近。 为了克服薄层板间差异，外标法及内标法均应采用随行为了克服薄层板间差异，外标法及内标法均应采用随行标准法，即标准溶液与供试品溶液交叉点在同一块薄层板上。标准法，即标准溶液与供试品溶液交叉点在同一块薄层

46、板上。 第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法32中药成分测定方法第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法（2 2）精密度考察）精密度考察 取同一供试品溶液，在同一块薄层板上以取同一供试品溶液，在同一块薄层板上以相同点样量平行点相同点样量平行点5 5点以上，展开后测定其峰点以上，展开后测定其峰面积，求算相对标准差（面积，求算相对标准差（RSDRSD），作为衡量定），作为衡量定量分析结果精密度的指标。量分析结果精密度的指标。RSDRSD应小于应小于4%4%。 式中：为式中：为n n次测量的平均值，次测量的平均值，S S为标准差。为标准差。33中药成分测定方法第三节第三节 常用定量分

47、析方法常用定量分析方法（3 3）准确度考察）准确度考察 回收率是衡量定量方法准确度的指标，常用回收率是衡量定量方法准确度的指标，常用加样回收率（加样回收率（R R）来衡量，其值应在）来衡量，其值应在95-105%95-105%之间，之间，测量数据一般为测量数据一般为5-65-6个。个。 将加入纯品的试样溶液、供试品溶液及标准将加入纯品的试样溶液、供试品溶液及标准溶液点于同一块薄层板上，展开后进行薄层扫描，溶液点于同一块薄层板上，展开后进行薄层扫描，测定各斑点的峰面积，计算各溶液中组分的量，测定各斑点的峰面积，计算各溶液中组分的量，计算回收率（计算回收率（R R）。）。34中药成分测定方法（4

48、4）统计检验）统计检验 统计检验是检验两种方法、两台仪器或两个人测量统计检验是检验两种方法、两台仪器或两个人测量的两组实验数据的精密度或准确度（偶然误差或系统误的两组实验数据的精密度或准确度（偶然误差或系统误差）间是否存在显著性差异，说明新建定量方法可否代差）间是否存在显著性差异，说明新建定量方法可否代替旧方法或优于旧方法。替旧方法或优于旧方法。 统计检验包括统计检验包括F F检验与检验与t t检验。检验。 F F检验检验即精密度差别检验，用以检验两组数据的精即精密度差别检验，用以检验两组数据的精密度或偶然误差是否存在显著性差异，一般为单侧检验。密度或偶然误差是否存在显著性差异，一般为单侧检验

49、。 t t检验检验即准确度差别检验，用以检验两组测量数据即准确度差别检验，用以检验两组测量数据的平均值或系统误差是否存在显著性差异。若的平均值或系统误差是否存在显著性差异。若t t检验证检验证明两种方法测得的均值不存在显著性差异时，则新方法明两种方法测得的均值不存在显著性差异时，则新方法可以代替旧方法，可以代替旧方法，t t检验一般为双侧检验。检验一般为双侧检验。 t t检验与检验与F F检验的具体方法参见分析化学的有关论著，检验的具体方法参见分析化学的有关论著，此从略。此从略。第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法35中药成分测定方法第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法2

50、2、定量方法、定量方法 常用的定量方法有常用的定量方法有外标法外标法、内标法内标法、追加法追加法（叠（叠加法）及加法）及回归曲线回归曲线定量法。定量法。（1 1）外标法）外标法 外标法是薄层色谱扫描最常用的定量方法，方法外标法是薄层色谱扫描最常用的定量方法，方法简便，但点样必须准确。简便，但点样必须准确。外标一点法外标一点法 工作曲线通过原点（截距为零）时可用外标一点工作曲线通过原点（截距为零）时可用外标一点法定量。只需点一种浓度的标准品溶液，与供试液同法定量。只需点一种浓度的标准品溶液，与供试液同板展开，对比，测定组分含量，其计算公式为：板展开，对比，测定组分含量，其计算公式为：C=FC=F

51、1 1AA 式中：式中：C C为组分的重量或浓度，为组分的重量或浓度，A A为测得该组分的为测得该组分的峰面积，峰面积，F1F1为直线的斜率或比例常数。为直线的斜率或比例常数。36中药成分测定方法外标二点法外标二点法 工作曲线不通过原点时，只能用外标二点法定量，工作曲线不通过原点时，只能用外标二点法定量，至少需点二种不同浓度的标准溶液（或一种浓度两种点至少需点二种不同浓度的标准溶液（或一种浓度两种点样量），才能决定一直线样量），才能决定一直线, ,其计算公式为：其计算公式为：C=FC=F1 1A+FA+F2 2 式中：式中：C C、A A同前，同前，F F1 1为直线的斜率或比例常数，为直线的

52、斜率或比例常数，F F2 2为纵坐标的截距，为纵坐标的截距，F F1 1和和F F2 2值由仪器自动算出。值由仪器自动算出。 外标一点法、二点法只是指用一种或二种浓度的标准溶液对比外标一点法、二点法只是指用一种或二种浓度的标准溶液对比定量，为减小误差，同一薄板上定量，为减小误差，同一薄板上供试品点样不得少于供试品点样不得少于4 4个个，对照品对照品每一浓度不得少于每一浓度不得少于2 2个个；并调整标淮溶液的浓度或供试品与标准溶；并调整标淮溶液的浓度或供试品与标准溶液的点样量，使其峰面积相接近；且点样量必须准确，宜用定量毛液的点样量，使其峰面积相接近；且点样量必须准确，宜用定量毛细管点样细管点样

53、。第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法37中药成分测定方法第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法（2 2）内标法）内标法 内标法是选一个纯物质作为内标物，并准确称内标法是选一个纯物质作为内标物，并准确称取一定量内标物加至供试液及标准液中，计算供试取一定量内标物加至供试液及标准液中，计算供试品溶液中某组分含量的定量方法。品溶液中某组分含量的定量方法。 内标物的选择要求是：内标物的选择要求是：Z 纯度合乎要求，展开后不得有杂质斑点，否则内纯度合乎要求，展开后不得有杂质斑点，否则内标斑点的峰面积将不能代表内标物的量。标斑点的峰面积将不能代表内标物的量。Z 内标物须为样品中所不含有的

54、成分。内标物须为样品中所不含有的成分。Z 内标物不与其它斑点相重叠，分离度合乎要求。内标物不与其它斑点相重叠，分离度合乎要求。Z 为简化计算，内标物在标准溶液及供试品溶液中为简化计算，内标物在标准溶液及供试品溶液中的浓度应相等。的浓度应相等。38中药成分测定方法特点：特点： 1 1）在一定点样量范围内，内标法定量准确度与点样量无关。）在一定点样量范围内，内标法定量准确度与点样量无关。 2 2）不易找到适宜）不易找到适宜RfRf值的纯品内标物，且溶液配制等操作较值的纯品内标物，且溶液配制等操作较麻烦。麻烦。方法：方法： 1 1）内标一点法：当工作曲线通过原点时采用内标一点法。）内标一点法：当工作

55、曲线通过原点时采用内标一点法。内标一点法公式：内标一点法公式： 2 2）工作曲线不通过原点时必须采用内标二点法）工作曲线不通过原点时必须采用内标二点法内标二点法公式：内标二点法公式： 式中：式中：C C、CisCis分别为组分及内标物的浓度或重量，分别为组分及内标物的浓度或重量，A A、AisAis分分别为测得组分及内标物的峰面积，别为测得组分及内标物的峰面积，F1F1为直线的斜率或比例常数，为直线的斜率或比例常数，F2F2为截距，为截距，F1F1和和F2F2由仪器自动计算并内存，可直接给出样品的浓由仪器自动计算并内存，可直接给出样品的浓度或重量。度或重量。第三节第三节 常用定量分析方法常用定

56、量分析方法39中药成分测定方法（3 3）回归曲线定量法）回归曲线定量法 将不同浓度（或不同量）的标准溶液与供将不同浓度（或不同量）的标准溶液与供试液点在同一块薄层板上，展开、扫描试液点在同一块薄层板上，展开、扫描; ; 由计算机对所测得的峰面积及相应点样量由计算机对所测得的峰面积及相应点样量进行线性或非线性回归进行线性或非线性回归; ; 直接由回归方程或回归曲线计算供试液含直接由回归方程或回归曲线计算供试液含量的方法量的方法; ; CAMAG CAMAG系列薄层扫描仪即采用此方法。系列薄层扫描仪即采用此方法。第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法40中药成分测定方法第三节第三节 常用定

57、量分析方法常用定量分析方法（四）影响薄层色谱分析的主要因素（四）影响薄层色谱分析的主要因素1 1、样品的预处理及供试液的制备、样品的预处理及供试液的制备2 2、薄层色谱的点样技术、薄层色谱的点样技术3 3、吸附剂的活性与相对湿度的影响、吸附剂的活性与相对湿度的影响4 4、溶剂蒸气在薄层色谱中的作用、溶剂蒸气在薄层色谱中的作用5 5、温度的影响、温度的影响41中药成分测定方法相对湿度相对湿度（% %）所需硫酸浓度（所需硫酸浓度（V/VV/V）硫酸（硫酸（mlml）水（水（mlml）3232686810010042425757100100585839.539.5100100656534341001

58、00727227.527.5100100888810.810.88989控制相对湿度用的硫酸溶液控制相对湿度用的硫酸溶液第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法42中药成分测定方法第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法四、气相色谱法四、气相色谱法 气相色谱法是以气体为流动相的柱色谱分离气相色谱法是以气体为流动相的柱色谱分离分析方法。分析方法。 特点：分离效能高、选择性好、灵敏度高，特点：分离效能高、选择性好、灵敏度高，样品用量少及分析速度快等特点，兼具分离、分样品用量少及分析速度快等特点，兼具分离、分析的功能，适用于热稳定性好的易挥发性或可转析的功能，适用于热稳定性好的易挥发性或

59、可转化为易挥发性组分的分析。化为易挥发性组分的分析。 适用范围：适用于热稳定性好的易挥发性或适用范围：适用于热稳定性好的易挥发性或可转化为易挥发性组分的分析。可转化为易挥发性组分的分析。43中药成分测定方法第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法（一）基本原理（一）基本原理 气相色谱是根据汽化后的试样被载气带入气相色谱是根据汽化后的试样被载气带入色谱柱，由于各组分在两相间作用不同，在色色谱柱，由于各组分在两相间作用不同，在色谱柱中移动有快慢，经一定柱长后得到分离，谱柱中移动有快慢，经一定柱长后得到分离，依次被载气带入检测器，将各组分浓度或质量依次被载气带入检测器，将各组分浓度或质量变化转

60、换成电信号变化记录成色谱图，利用色变化转换成电信号变化记录成色谱图，利用色谱峰保留值进行定性分析，利用峰面积或峰高谱峰保留值进行定性分析，利用峰面积或峰高进行定量分析的方法。进行定量分析的方法。44中药成分测定方法第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法（二）实验条件的选择（二）实验条件的选择 在气相色谱分析中，为达到满意的分离效果，需在气相色谱分析中，为达到满意的分离效果，需依据依据Van DeemeterVan Deemeter方程式和分离度方程式选择合适的方程式和分离度方程式选择合适的分离条件，主要有固定相、柱温、载气流速等条件的分离条件，主要有固定相、柱温、载气流速等条件的选择。

61、选择。 1 1、固定相的选择、固定相的选择 1 1）气）气液色谱液色谱 固定液：按极性相似、化学官能团相似的固定液：按极性相似、化学官能团相似的相似相似性原则性原则和主要差别选择。和主要差别选择。 载体：一般为适宜粒度，经酸洗并硅烷化处理载体：一般为适宜粒度，经酸洗并硅烷化处理的硅藻土。的硅藻土。 2 2）气）气固色谱：固定相大多采用高分子多孔微球固色谱：固定相大多采用高分子多孔微球（GDXGDX），用于分离水及含羟基（醇）化合物。），用于分离水及含羟基（醇）化合物。45中药成分测定方法第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法2 2、柱温的选择、柱温的选择 选择的基本原则：在使最难分离的

62、组分有符合要求的分选择的基本原则：在使最难分离的组分有符合要求的分离度的前提下，尽可能采用较低柱温，但以保留时间适宜及离度的前提下，尽可能采用较低柱温，但以保留时间适宜及不拖尾为度。不拖尾为度。 在实际工作中一般在实际工作中一般根据样品的沸点来选择柱温根据样品的沸点来选择柱温，具体有，具体有如下几点：如下几点：Y 高沸点的样品（沸点高沸点的样品（沸点300-400300-400），采用），采用1-5%1-5%低固定液配低固定液配比，柱温比，柱温200-250200-250。Y 沸点为沸点为200-300200-300的样品，采用的样品，采用5-10%5-10%固定液配比，柱温固定液配比，柱温1

63、50-180150-180。Y 沸点为沸点为100-200100-200的样品，采用的样品，采用10-15%10-15%固定液配比，柱温固定液配比，柱温选各组分的平均沸点选各组分的平均沸点2/32/3左右。左右。Y 气体等低沸点样品，采用气体等低沸点样品，采用15-25%15-25%高固定液配比，柱温选沸高固定液配比，柱温选沸点左右，在室温或点左右，在室温或5050下进行分析。下进行分析。Y 对于宽沸程样品，需采用程序升温方法进行分析。对于宽沸程样品，需采用程序升温方法进行分析。 但需注意的是柱温要低于固定液的最高使用温度。但需注意的是柱温要低于固定液的最高使用温度。46中药成分测定方法3 3

64、、载气的选择、载气的选择 主要从对峰展宽（柱效）、柱压降和检测器灵主要从对峰展宽（柱效）、柱压降和检测器灵敏度的影响三方面考虑。敏度的影响三方面考虑。 N N2 2是最常用的载气；是最常用的载气； 载气流速较低时，宜用载气流速较低时，宜用N N2 2；流速高时，宜用；流速高时，宜用H H2 2、HeHe； 较长色谱柱，宜用较长色谱柱，宜用H H2 2作载气；作载气； 热导检测器应选用热导检测器应选用H H2 2、HeHe；氢焰检测器、电子；氢焰检测器、电子捕获检测器，一般用捕获检测器，一般用N N2 2； 一般控制载气流速高于其最佳流速。常用的载一般控制载气流速高于其最佳流速。常用的载气流速为

65、气流速为20-80ml/min20-80ml/min。第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法47中药成分测定方法第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法4 4、其他条件的选择、其他条件的选择= 气化室（进样口）温度：气化温度取决于样品的挥发性、气化室（进样口）温度：气化温度取决于样品的挥发性、沸点范围、稳定性及进样量等因素。沸点范围、稳定性及进样量等因素。 = 检测室温度检测室温度 检测器温度一般需高于柱温，以免色谱柱检测器温度一般需高于柱温，以免色谱柱的流出物在检测器中冷凝而污染检测器。通常可高于柱温的流出物在检测器中冷凝而污染检测器。通常可高于柱温3030左右或等于气化室温度

66、。左右或等于气化室温度。= 进样量进样量 在检测器灵敏度足够的前提下，尽量减少进样在检测器灵敏度足够的前提下，尽量减少进样量，通常以塔板数下降量，通常以塔板数下降10%10%作为最大允许进样量。对于作为最大允许进样量。对于填充柱填充柱，气体样品为气体样品为0.1-1l0.1-1l，液体样品为，液体样品为0.1-1l0.1-1l，最大不超过，最大不超过4l4l为宜。毛细管柱需用分流器分流进样，为宜。毛细管柱需用分流器分流进样，分流后的进样量分流后的进样量为填充柱的为填充柱的1/10-1/1001/10-1/100。此外，。此外，进样速度要快进样速度要快，进样时间要，进样时间要短，注意留针时间和室

67、温的影响，以准确控制进样量，以利短，注意留针时间和室温的影响，以准确控制进样量，以利于分离。于分离。48中药成分测定方法第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法5 5、检测器、检测器V 热导检测器（热导检测器（TCDTCD）：通用型检测器，应用广）：通用型检测器，应用广泛，但灵敏度较低；泛，但灵敏度较低；V 氢焰离子化检测器（氢焰离子化检测器（FIDFID）：应用最广泛，适）：应用最广泛，适用于含碳有机物的测定，载气多为用于含碳有机物的测定，载气多为N2N2。V 氮氮- -磷检测器（磷检测器（NPDNPD）：专属性检测器，可用）：专属性检测器，可用于中药及其制剂中农药残留量的检测。于中药

68、及其制剂中农药残留量的检测。V 电子捕获检测器（电子捕获检测器（ECDECD）：专属性检测器，适）：专属性检测器，适用于痕量电负性有机物用于痕量电负性有机物如含卤素、硫、氧、硝如含卤素、硫、氧、硝基、羰基、氰基等化合物的分析。基、羰基、氰基等化合物的分析。49中药成分测定方法第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法（三）定量分析方法（三）定量分析方法 气相色谱常用的定量方法有内标法、外标法、归一化气相色谱常用的定量方法有内标法、外标法、归一化法等。法等。1 1、内标法、内标法 特点：特点：为最常用的定量方法为最常用的定量方法 优点：可抵消仪器稳定性差、进样量不够准确等原因优点：可抵消仪器

69、稳定性差、进样量不够准确等原因所带来的定量分析误差；所带来的定量分析误差； 缺点：样品的配制较麻烦，有些内标物不易寻找。缺点：样品的配制较麻烦，有些内标物不易寻找。 关键：选择合适的内标物。关键：选择合适的内标物。 适用范围：适用范围： 适用于样品的所有组分不能全部流出色适用于样品的所有组分不能全部流出色 谱柱；谱柱； 检测器不能对每个组分都产生信号；检测器不能对每个组分都产生信号； 只需测定样品中某几个组分含量时的情只需测定样品中某几个组分含量时的情 况。况。50中药成分测定方法第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法 原理：选择一内标物，将一定量的内标物加入到样品中，原理：选择一内标

70、物，将一定量的内标物加入到样品中，根据试样重量根据试样重量W W和内标物重量和内标物重量WsWs及待测组分和内标物的峰而积及待测组分和内标物的峰而积AiAi、AsAs，求出待测组分的含量。，求出待测组分的含量。待测组分百分含量为：待测组分百分含量为：Ci%= 式中式中fifi、fsfs分别为被测组分和内标的重量校正因子。分别为被测组分和内标的重量校正因子。 在中药制剂分析时，校正因子经常不知，可采用药典方法在中药制剂分析时，校正因子经常不知，可采用药典方法测定校正因子再用内标法，或采用测定校正因子再用内标法，或采用内标对比法内标对比法测定。测定。51中药成分测定方法第三节第三节 常用定量分析方

71、法常用定量分析方法（3 3）内标工作曲线法）内标工作曲线法 内标工作曲线法与外标法相同，只内标工作曲线法与外标法相同，只是在各种浓度的标准溶液中加入相同量是在各种浓度的标准溶液中加入相同量的内标物，进样，以标准物与内标物的的内标物，进样，以标准物与内标物的峰面积比峰面积比A Ai i/A/AS S对对C Ci i作工作曲线（或求回作工作曲线（或求回归方程）样品测定时也加入等量的内标归方程）样品测定时也加入等量的内标物，根据样品与内标物峰面积比物，根据样品与内标物峰面积比A AX X/A/AS S由由工作曲线求得待测组分含量。工作曲线求得待测组分含量。 52中药成分测定方法第三节第三节 常用定量

72、分析方法常用定量分析方法2 2、外标法、外标法关键：关键：进样量准确；进样量准确； 实验条件恒定。实验条件恒定。分类：分类：1 1）工作曲线法：用一系列浓度的对照品）工作曲线法：用一系列浓度的对照品 溶液确定工作曲线，在完全相同条件溶液确定工作曲线，在完全相同条件 下，准确进样等体积的样品溶液，计下，准确进样等体积的样品溶液，计 算其含量；算其含量； 2 2）外标一点法：当工作曲线截距为零）外标一点法：当工作曲线截距为零 时，可采用外标一点法定量，时，可采用外标一点法定量，53中药成分测定方法3 3、归一化法、归一化法 关键：要求所有组分均要产生色谱峰。关键：要求所有组分均要产生色谱峰。 适用

73、范围：通常只能用于粗略考察供试品的杂质含量，适用范围：通常只能用于粗略考察供试品的杂质含量， 一般宜用于微量杂质的含量检查一般宜用于微量杂质的含量检查. . 校正面积归一化法测定各组分的含量。校正面积归一化法测定各组分的含量。面积归一化法计算：面积归一化法计算：54中药成分测定方法第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法 高效液相色谱法（高效液相色谱法（HPLCHPLC）是以经典液相色）是以经典液相色谱法为基础，引入气相色谱的理论和实验方法。谱法为基础，引入气相色谱的理论和实验方法。高压输送流动相，采用高效固定相及在线检测高压输送流动相，采用高效固定相及在线检测等手段发展而来的分离分析方

74、法，具有分离效等手段发展而来的分离分析方法，具有分离效能高、分析速度快及应用范围广等特点。能高、分析速度快及应用范围广等特点。 适用范围：适用于极性、非极性化合物，适用范围：适用于极性、非极性化合物，离子型化合物和高分子化合物的分离分析。离子型化合物和高分子化合物的分离分析。55中药成分测定方法第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法（一）（一）HPLCHPLC的基本原理的基本原理（二）（二）HPLCHPLC实验条件的选择实验条件的选择1 1、色谱柱的选择、色谱柱的选择 根据被分离物质的化学结构、极性和溶解度等因素根据被分离物质的化学结构、极性和溶解度等因素进行选择。进行选择。 大多数药

75、物可用大多数药物可用C18C18反相（反相（ODSODS）柱加以分离测定；）柱加以分离测定； 也可选用正相分配色谱柱（氨基柱、氰基柱）或硅也可选用正相分配色谱柱（氨基柱、氰基柱）或硅胶吸附色谱柱等；胶吸附色谱柱等； 解离药物可用离子对色谱、离子抑制色谱或离子交解离药物可用离子对色谱、离子抑制色谱或离子交换色谱分离测定；换色谱分离测定； 脂溶性药物异构体的分离测定可采用硅胶吸附色谱脂溶性药物异构体的分离测定可采用硅胶吸附色谱柱。柱。56中药成分测定方法2 2、流动相的选择、流动相的选择 1 1）反相键合相色谱）反相键合相色谱流动相流动相常用溶剂常用溶剂适用范围适用范围部分含水溶剂部分含水溶剂甲醇

76、甲醇- -水、乙腈水、乙腈- -水系统水系统用于分离中等极性、弱极性药物用于分离中等极性、弱极性药物非水溶剂非水溶剂乙腈乙腈- -二氯甲烷、甲醇二氯甲烷、甲醇- -四四氢呋喃等氢呋喃等用于分离疏水性物质用于分离疏水性物质缓冲溶液缓冲溶液三乙胺磷酸盐、磷酸盐、三乙胺磷酸盐、磷酸盐、醋酸盐溶液醋酸盐溶液用于可溶于水并具可解离特性的用于可溶于水并具可解离特性的化合物化合物反相键合相色谱常用流动相反相键合相色谱常用流动相57中药成分测定方法第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法2 2）正相键合相色谱）正相键合相色谱 常采用饱和烷烃（如正已烷）中加入常采用饱和烷烃（如正已烷）中加入一种极性较大的

77、溶剂作为极性调节剂（如异一种极性较大的溶剂作为极性调节剂（如异丙醚），通过调节极性调节剂的浓度改变溶丙醚），通过调节极性调节剂的浓度改变溶剂强度；剂强度； 常采用二元以上的混合溶剂系统。常采用二元以上的混合溶剂系统。 58中药成分测定方法第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法3 3、洗脱方式、洗脱方式 等度洗脱是在同一分析周期内流动相的组等度洗脱是在同一分析周期内流动相的组成保持恒定，使所有组分的成保持恒定，使所有组分的k k值都处于这个范值都处于这个范围内，适用于组分数较少、性质差别不大的样围内，适用于组分数较少、性质差别不大的样品。品。 梯度洗脱是在一个分析周期内程序控制流梯度洗脱

78、是在一个分析周期内程序控制流动相的组成（如溶剂极性、离子强度和动相的组成（如溶剂极性、离子强度和pHpH值等）值等），适用于分析组分数多、性质相差较大的复杂，适用于分析组分数多、性质相差较大的复杂混合物样品，从而使所有组分都在适宜条件下混合物样品，从而使所有组分都在适宜条件下获得分离。获得分离。 59中药成分测定方法4 4、检测器、检测器检测器检测器特点特点检测限检测限适用范围适用范围紫外检测器（紫外检测器（UVUV或或UVDUVD）分为）分为:可变可变波长型波长型二极管阵二极管阵列检测器列检测器 用于检测有外吸收的物质用于检测有外吸收的物质; ; 灵敏度较高灵敏度较高, ,噪音低噪音低, ,

79、线线性范围宽性范围宽, ,对流速和温度波对流速和温度波动不灵敏动不灵敏, ,可用于梯度洗脱可用于梯度洗脱. .1010-7-7-10-10-12-12g g用于芳烃、稠环芳烃、用于芳烃、稠环芳烃、芳香氨基酸、核酸、芳香氨基酸、核酸、甾体激素、羰基和羧甾体激素、羰基和羧基化合物等基化合物等荧光检测器荧光检测器(FD) (FD) 用于能产生荧光或其衍生用于能产生荧光或其衍生物能发荧光的物质物能发荧光的物质; ; 灵敏灵敏度高于紫外检测器度高于紫外检测器110110-10-10g/mlg/ml主要用于氨基酸、多主要用于氨基酸、多环芳烃、维生素、甾环芳烃、维生素、甾体化合化物及酶等体化合化物及酶等蒸发

80、光散射检测器蒸发光散射检测器(ELSD)(ELSD)属通用型检测器属通用型检测器, ,理论上理论上可用于挥发性低于流动相的可用于挥发性低于流动相的任何样品组分任何样品组分; ; 检测灵敏检测灵敏度较低度较低, ,适用于流动相能挥适用于流动相能挥发的色谱洗脱发的色谱洗脱, ,不能用含缓不能用含缓冲盐的流动相冲盐的流动相用于检测糖、高分子用于检测糖、高分子子化合物、高级脂肪子化合物、高级脂肪酸、磷脂、维生素、酸、磷脂、维生素、氨基酸、甘油三酯及氨基酸、甘油三酯及甾体等几十类化合物甾体等几十类化合物60中药成分测定方法4 4、检测器、检测器电化学检测器电化学检测器(ECD)(ECD)用于能氧化、还原

81、的有用于能氧化、还原的有机物质的检测机物质的检测110110-12-12g/mlg/ml适用生物胺、酚、适用生物胺、酚、羰基化合物、巯羰基化合物、巯基化合物等基化合物等示差折光检测器示差折光检测器(RID)(RID)属通用型检测器属通用型检测器, ,利用利用组分与流动相折射率之组分与流动相折射率之差进行检测差进行检测. . 稳定性稳定性好好, ,操作方便操作方便.灵敏度灵敏度低低, ,受环境温度、流动相受环境温度、流动相组成等波动的影响大组成等波动的影响大, ,不不适合梯度洗脱适合梯度洗脱1010-8-8g/mlg/ml尤其适合于糖类尤其适合于糖类的检测的检测化学发光检测器化学发光检测器(CL

82、D)(CLD)高选择性、高灵敏度高选择性、高灵敏度的新型检测器的新型检测器. . 设备设备简单简单, ,自身发光自身发光, ,无需光无需光源源, ,价格便宜价格便宜PgPg级级(10(10-12-12) )用于分析微量脂用于分析微量脂质、核酸、生物质、核酸、生物胺等胺等61中药成分测定方法5 5、HPLCHPLC前处理前处理（1 1）流动相的处理）流动相的处理 溶剂的纯化溶剂的纯化 选择专供色谱分析用的选择专供色谱分析用的“色谱纯色谱纯”溶剂，溶剂，分析纯或优级纯溶剂在很多情况下也可满足色分析纯或优级纯溶剂在很多情况下也可满足色谱分析的要求。由于不同的色谱柱和检测方法谱分析的要求。由于不同的色

83、谱柱和检测方法对溶剂的要求不同，有时需进行除去紫外杂质、对溶剂的要求不同，有时需进行除去紫外杂质、脱水、重蒸等纯化操作。水一般采用石英系统脱水、重蒸等纯化操作。水一般采用石英系统二次蒸馏水。二次蒸馏水。第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法62中药成分测定方法流动相脱气流动相脱气 HPLC HPLC所用的流动相必须预先除去其中的空气，习所用的流动相必须预先除去其中的空气，习称脱气，一般在临用前对流动相进行脱气，常用的脱称脱气，一般在临用前对流动相进行脱气，常用的脱气法有超声波振荡脱气、惰性气体（气法有超声波振荡脱气、惰性气体（HeHe）鼓泡吹扫脱）鼓泡吹扫脱气、抽真空、加热法。气、抽真

84、空、加热法。过滤过滤 过滤是为了防止不溶物堵塞流路和色谱柱入口处过滤是为了防止不溶物堵塞流路和色谱柱入口处的微孔垫片，因此应预先除去流动相中的任何固体微的微孔垫片，因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。流动相最好在玻璃容器内蒸馏，而常用的方法是粒。流动相最好在玻璃容器内蒸馏，而常用的方法是过滤，采用过滤，采用0.45m0.45m以下微孔滤膜过滤。以下微孔滤膜过滤。 滤膜分有机溶剂专用和水溶液专用两种。滤膜分有机溶剂专用和水溶液专用两种。第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法63中药成分测定方法第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法（2 2）样品的处理）样品的处理 HPLC HP

85、LC分析前需对样品进行预处理，以便将待测物质有分析前需对样品进行预处理，以便将待测物质有效地从样品基质中释放出来，使样品的形式及所用溶剂符效地从样品基质中释放出来，使样品的形式及所用溶剂符合合HPLCHPLC的要求。的要求。待测组分的提取待测组分的提取溶剂的挥发溶剂的挥发( (浓缩）浓缩） 滤过滤过 样品溶液进样前，需用滤膜抽滤或针头滤器过滤，样品溶液进样前，需用滤膜抽滤或针头滤器过滤，以有效除去样品溶液中的悬浮物或部分大分子杂质。以有效除去样品溶液中的悬浮物或部分大分子杂质。64中药成分测定方法第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法正相色谱正相色谱: :流动相极性小于固定相极性的分配

86、流动相极性小于固定相极性的分配色谱法，主要用于极性物质的分离测定；色谱法，主要用于极性物质的分离测定；反相色谱反相色谱: :流动相极性大于固定相极性的分配流动相极性大于固定相极性的分配色谱法，主要用于非极性、中等极性物质的分色谱法，主要用于非极性、中等极性物质的分离测定离测定 65中药成分测定方法第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法 化学键合相是将固定液的官能团键合在载体上化学键合相是将固定液的官能团键合在载体上所形成的固定相。所形成的固定相。 具有化学性能稳定，热稳定性好，一般在具有化学性能稳定，热稳定性好，一般在pH2-pH2-8 8范围的溶液中不变质，使用过程不流失，载样量范围

87、的溶液中不变质，使用过程不流失，载样量大，适于梯度洗脱等特点，已广泛用于正相与反相大，适于梯度洗脱等特点，已广泛用于正相与反相色谱，离子抑制色谱，离子对色谱。色谱，离子抑制色谱，离子对色谱。 药典中药典中HPLCHPLC法所采用的固定相均为化学键合相。法所采用的固定相均为化学键合相。以化学键合相为固定相的色谱法称为化学键合相色以化学键合相为固定相的色谱法称为化学键合相色谱法谱法. . 现就中药分析中最常用的键合相色谱法作一介现就中药分析中最常用的键合相色谱法作一介绍。绍。 66中药成分测定方法第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法（1 1）反相键合相色谱法）反相键合相色谱法 反相键合相

88、色谱法是现代液相色谱中反相键合相色谱法是现代液相色谱中应用最为广泛应用最为广泛的方法，占整个的方法，占整个HPLCHPLC应用的应用的80%80%左右。左右。 反相色谱法一般采用非极性键合相，十八烷基键合反相色谱法一般采用非极性键合相，十八烷基键合相（简称相（简称ODSODS或或C C1818）是最常用的非极性固定相，对于各）是最常用的非极性固定相，对于各种类型的化合物都有较强的适应能力；种类型的化合物都有较强的适应能力； 流动相通常以水为基础溶剂，再加入一定量能与水流动相通常以水为基础溶剂，再加入一定量能与水互溶的极性调整剂，常用的有甲醇互溶的极性调整剂，常用的有甲醇- -水、乙腈水、乙腈-

89、 -水系统。水系统。 极性调整剂的性质及其与水的混合比例对溶质的保极性调整剂的性质及其与水的混合比例对溶质的保留值和分离选择性有显著影响，留值和分离选择性有显著影响， 流动相的极性增大，洗脱能力降低，溶质的流动相的极性增大，洗脱能力降低，溶质的k k增大，增大，t tR R增大；反之，增大；反之，k k与与t tR R减小。调整流动相的极性，可控制减小。调整流动相的极性，可控制k k值在所要求的范围内（值在所要求的范围内（k=1-10k=1-10），对于结构类似的组），对于结构类似的组分，极性大的组分先出柱。分，极性大的组分先出柱。 67中药成分测定方法第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分

90、析方法（2 2）正相键合相色谱法）正相键合相色谱法 正相键合相色谱法的应用不如反相色谱正相键合相色谱法的应用不如反相色谱法普及，主要用于分离分析溶于有机溶剂的法普及，主要用于分离分析溶于有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质。氰基（极性及中等极性的分子型物质。氰基（-CN-CN）、）、氨基（氨基（-NH2-NH2）和二醇基（）和二醇基（DIOLDIOL）键合相是正）键合相是正相色谱常用的极性键合相，流动相通常用烷相色谱常用的极性键合相，流动相通常用烷烃（常用正已烷）加适量极性调整剂构成。烃（常用正已烷）加适量极性调整剂构成。 68中药成分测定方法第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法（3

91、 3）离子对色谱法）离子对色谱法 直接将离子对试剂加入到流动相中，用以分离离子型或可离子直接将离子对试剂加入到流动相中，用以分离离子型或可离子化化合物的方法作为离子对色谱法（化化合物的方法作为离子对色谱法（PICPIC或或IPCIPC），该法可分为正相），该法可分为正相离子对色谱法和反相离子对色谱法，但近年来广泛应用的几乎都是离子对色谱法和反相离子对色谱法，但近年来广泛应用的几乎都是反相离子对色谱法，故本书只介绍反相离子对色谱法反相离子对色谱法，故本书只介绍反相离子对色谱法. . 基本原理基本原理: :以以C18C18或或C8C8键合相为固定相，用含离子对试剂的有键合相为固定相，用含离子对试剂

92、的有机溶媒机溶媒- -水溶液为流动相，用以分离离子型或可离子化化合物水溶液为流动相，用以分离离子型或可离子化化合物. .适用范围适用范围: : 适用于有机酸、碱、盐的分离适用于有机酸、碱、盐的分离; ; 用离子交换色谱法无法分离的离子和非离子混合物的用离子交换色谱法无法分离的离子和非离子混合物的 分离分离; ; 在中药制剂分析广泛用于生物碱、有机酸的分析。在中药制剂分析广泛用于生物碱、有机酸的分析。 缺点缺点: :离子对试剂价格比较贵离子对试剂价格比较贵. .分离条件的选择分离条件的选择: : 离子对试剂的性质和浓度、流动相的离子对试剂的性质和浓度、流动相的pHpH值及流值及流动相中所含有机溶

93、剂的种类与比例等。动相中所含有机溶剂的种类与比例等。69中药成分测定方法第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法i i离子对试剂的选择离子对试剂的选择 通常所选用离子对试剂的电荷应与试样离子的电荷通常所选用离子对试剂的电荷应与试样离子的电荷相反。相反。 离子对试剂离子对试剂主要应用对象主要应用对象1 1、季铵类（如四甲基、四丁基、季铵类（如四甲基、四丁基、十六烷基三甲基铵）十六烷基三甲基铵）强酸和弱酸（如磺酸染料、羧酸、强酸和弱酸（如磺酸染料、羧酸、磺胺类药物、水溶性维生素）磺胺类药物、水溶性维生素）2 2、叔胺类（如三辛基胺）、叔胺类（如三辛基胺）磺酸盐等磺酸盐等3 3、烷基磺酸盐（如

94、戊烷、已烷、烷基磺酸盐（如戊烷、已烷、庚烷、辛烷、十二烷基磺酸盐）庚烷、辛烷、十二烷基磺酸盐）强碱和弱碱（如儿茶酚胺、罂粟碱、强碱和弱碱（如儿茶酚胺、罂粟碱、烟酰胺）烟酰胺）4 4、高氯酸、高氯酸各种碱性物质（如有机胺、肽）各种碱性物质（如有机胺、肽）5 5、烷基硫酸盐（如辛烷、十二烷、烷基硫酸盐（如辛烷、十二烷基硫酸盐）基硫酸盐）应用对象同烷基磺酸盐应用对象同烷基磺酸盐70中药成分测定方法第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法反相离子对色谱法中流动相反相离子对色谱法中流动相pHpH值的选择原则值的选择原则样品类型样品类型流动相流动相PHPH值值说说 明明1 1、强酸、强酸（pKa2p

95、Ka2pKa2）如氨基）如氨基酸、羧酸酸、羧酸6-7.46-7.42-52-5样品可离解，其样品可离解，其k k值取决于离子对的性质样值取决于离子对的性质样品的离解被抑制，其品的离解被抑制，其k k值取决于未离解样品值取决于未离解样品的性质。的性质。3 3、强碱、强碱（pKa8pKa8）如季铵）如季铵类类2-82-8同强酸同强酸4 4、弱碱、弱碱（pKa8pKa8）如儿茶）如儿茶酚胺酚胺6-7.46-7.42-52-5样品的离解被抑制，其样品的离解被抑制，其k k值取决于未离解样值取决于未离解样品的性质品的性质样品可离解，其样品可离解，其k k值取决于离子对的性质。值取决于离子对的性质。ii.

96、 ii. 流动相流动相pHpH值的控制值的控制 71中药成分测定方法第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法iii. iii. 有机溶剂的选择有机溶剂的选择 反相离子对色谱法中，甲醇反相离子对色谱法中，甲醇- -水、乙腈水、乙腈- -水系统是最常用的流动相，流动相中所含有水系统是最常用的流动相，流动相中所含有机溶剂的比例越高，组分的机溶剂的比例越高，组分的k k值越小。一般而值越小。一般而言，样品组分的疏水性及离子对试剂的疏水言，样品组分的疏水性及离子对试剂的疏水性越强，所需有机溶剂的比例越高。性越强，所需有机溶剂的比例越高。72中药成分测定方法第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析

97、方法（4 4）离子抑制色谱法）离子抑制色谱法 原理原理: :由于离子对试剂的价格较贵，对弱酸、弱碱的分由于离子对试剂的价格较贵，对弱酸、弱碱的分离，往往采用离子抑制色谱法。通过向流动相加入少量弱离，往往采用离子抑制色谱法。通过向流动相加入少量弱酸（常用醋酸）、弱碱（常用氨水）或缓冲盐（常用磷酸酸（常用醋酸）、弱碱（常用氨水）或缓冲盐（常用磷酸盐及醋酸盐），调节流动相的盐及醋酸盐），调节流动相的pHpH值，抑制样品组分的解离，值，抑制样品组分的解离，增加组分在固定相中的溶解度，改善峰形，达到分离有机增加组分在固定相中的溶解度，改善峰形，达到分离有机弱酸、弱碱的目的，这种技术称为离子抑制色谱法弱酸

98、、弱碱的目的，这种技术称为离子抑制色谱法（ISCISC）。）。 73中药成分测定方法第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法（4 4）离子抑制色谱法）离子抑制色谱法特点特点: :该方法简便、经济实用、分离效果好，在许该方法简便、经济实用、分离效果好，在许多场合可替代离子对色谱法，但重复性较差是其缺多场合可替代离子对色谱法，但重复性较差是其缺点。点。适用范围适用范围: :离子抑制色谱法通常用于反相色谱中，离子抑制色谱法通常用于反相色谱中，适用于适用于3.0pKa7.03.0pKa7.0的弱酸、的弱酸、7.0pKa8.07.0pKa8.0的弱的弱碱和两性化合物的分离，以及它们与分子型化合物碱

99、和两性化合物的分离，以及它们与分子型化合物共存时的分离。共存时的分离。74中药成分测定方法第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法离子抑制色谱法与离子对色谱法的区别：离子抑制色谱法与离子对色谱法的区别： 离子抑制色谱法是向流动相中加入抑制剂，离子抑制色谱法是向流动相中加入抑制剂，调节调节pHpH值，抑制样品组分的解离，使其以分子形值，抑制样品组分的解离，使其以分子形式存在。而离子对色谱法是加入离子对试剂，并式存在。而离子对色谱法是加入离子对试剂，并调节调节pHpH值使样品组分尽可能呈解离状态，使离子值使样品组分尽可能呈解离状态，使离子对试剂的反离子与样品离子结合成中性离子对。对试剂的反离

100、子与样品离子结合成中性离子对。 离子抑制色谱仅适用于弱酸、弱碱的分离，离子抑制色谱仅适用于弱酸、弱碱的分离，不适用于有机强酸、强碱的分离；而离子对色谱不适用于有机强酸、强碱的分离；而离子对色谱法对不同强度的酸、碱均适用。法对不同强度的酸、碱均适用。75中药成分测定方法第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法（四）定量分析方法（四）定量分析方法HPLCHPLC常用的定量方法有常用的定量方法有: :外标法外标法、内标法（内标对比法和内标标准曲线法）内标法（内标对比法和内标标准曲线法）内加法。内加法。 76中药成分测定方法第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法七、荧光分析法七、荧光分析

101、法 优点优点: :灵敏度高灵敏度高( (检测限可达检测限可达1010-10-10-10-10- -1212g/mlg/ml）、选择性好、方法快捷，试样量少）、选择性好、方法快捷，试样量少（几十微克或几十微升）等特点，并可提供（几十微克或几十微升）等特点，并可提供较多的荧光参数（激发光谱、荧光光谱、荧较多的荧光参数（激发光谱、荧光光谱、荧光强度等）。光强度等）。 缺点缺点: : 其不足之处是干扰因素较多需严其不足之处是干扰因素较多需严格控制实验条件，且具有天然荧光的物质数格控制实验条件，且具有天然荧光的物质数量不多，因而其应用不如可见量不多，因而其应用不如可见紫外光度法紫外光度法广泛。广泛。77

102、中药成分测定方法第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法2 2、测定方法、测定方法 直接荧光法直接荧光法 中药及其制剂中许多物质本身具有荧光，可中药及其制剂中许多物质本身具有荧光，可用荧光法直接测定，但由于中药制剂成分复杂，一般需经适当用荧光法直接测定，但由于中药制剂成分复杂，一般需经适当的提取分离后，再进行荧光测定，如白芷中莨菪亭、伞花内酯的提取分离后，再进行荧光测定，如白芷中莨菪亭、伞花内酯的含量测定。的含量测定。 制备荧光衍生物制备荧光衍生物 对于没有荧光或荧光很弱的物质，可选对于没有荧光或荧光很弱的物质，可选择合适的试剂，使其生成具有特异荧光的衍生物，从而扩大荧择合适的试剂，使其

103、生成具有特异荧光的衍生物，从而扩大荧光分析的范围。如包公藤甲素的荧光分析。光分析的范围。如包公藤甲素的荧光分析。 化学引导荧光法化学引导荧光法 利用氧化、还原、水解、缩合、配合和利用氧化、还原、水解、缩合、配合和光化学反应等化学方法，使一些自身不能产生荧光的物质转变光化学反应等化学方法，使一些自身不能产生荧光的物质转变为荧光化合物，从而用荧光法测定。如番泻苷的含量测定。为荧光化合物，从而用荧光法测定。如番泻苷的含量测定。 荧光淬灭法荧光淬灭法 利用某些物质可使荧光物质的荧光淬灭的性利用某些物质可使荧光物质的荧光淬灭的性质，间接地测定其含量。如荧光淬灭法测定苦杏仁苷。质，间接地测定其含量。如荧光

104、淬灭法测定苦杏仁苷。 胶束增敏荧光法胶束增敏荧光法 利用胶束溶液对荧光物质的增溶、增敏利用胶束溶液对荧光物质的增溶、增敏和增稳作用和增稳作用. .78中药成分测定方法最新进展GC快速微型联用多维79中药成分测定方法HPLC：超高效液相色谱仪超高效液相色谱仪（UPLC/RPLC）超高速超高速超高分离度超高分离度超高灵敏度超高灵敏度粒径粒径1.7微米微米最新进展UPLCUPLC的商品化，是分离科学和技术的巨大进步，液的商品化，是分离科学和技术的巨大进步，液相色谱亦由此进入了全新的时代。相色谱亦由此进入了全新的时代。80中药成分测定方法81中药成分测定方法图2：比较5m颗粒与1.7m颗粒。峰容量和分

105、辨率显著增加。82中药成分测定方法83中药成分测定方法84中药成分测定方法85中药成分测定方法第四节第四节 含量测定方法的效能指标含量测定方法的效能指标 任何一种分析方法，根据其使用对象和任何一种分析方法，根据其使用对象和要求，都应有相应的效能指标。常用的效能要求，都应有相应的效能指标。常用的效能评价指标有：评价指标有：准确度、精密度、专属性、检准确度、精密度、专属性、检测限、定量限、线性与范围、耐用性测限、定量限、线性与范围、耐用性等。等。 分析方法的效能指标可以作为对分析方分析方法的效能指标可以作为对分析方法的评估尺度，也可作为建立新的分析方法法的评估尺度，也可作为建立新的分析方法的实验研

106、究依据。的实验研究依据。 86中药成分测定方法第四节第四节 含量测定方法的效能指标含量测定方法的效能指标一、准确度一、准确度 准准确确度度是是指指测测定定结结果果与与真真实实值值或或参参考考值值接接近近的的程程度度，表表示示分分析析方方法法测测量量的的正正确确性性，一一般般以以回回收收率率（% %）表表示示。准确度应在规定的范围内建立。准确度应在规定的范围内建立。87中药成分测定方法 即于已知被测物含量（即于已知被测物含量（A A）的试样中加入一定量）的试样中加入一定量（B B）的被测物对照品进行测定，得总量（）的被测物对照品进行测定，得总量（C C）。）。 回收率（回收率（% %）=(C-A

107、)/B100%=(C-A)/B100% 在规定范围内（即在规定范围内（即A+BA+B在标准曲线的线性范围内，且在标准曲线的线性范围内，且控制控制A:BA:B在在1:11:1左右），测定次数左右），测定次数n5n5，报告平均回收率，报告平均回收率（% %）和）和RSD.RSD.中药含量测定的回收率一般要求在中药含量测定的回收率一般要求在95%95%105%105%，一些方法，一些方法操作步骤繁复，可要求略低操作步骤繁复，可要求略低不可小于不可小于90%90%。RSDRSD一般一般应在应在3%3%以内。以内。第四节第四节 含量测定方法的效能指标含量测定方法的效能指标88中药成分测定方法二、精密度二

108、、精密度 精密度系指用该法经多次取样测定同一个均匀样品，精密度系指用该法经多次取样测定同一个均匀样品，各测定值彼此接近的程度。精密度一般用标准偏差各测定值彼此接近的程度。精密度一般用标准偏差（S S）或相对标准偏差（）或相对标准偏差（RSDRSD）表示，或同时报告可信限。）表示，或同时报告可信限。 在相同条件下，由一个分析人员同一次测定所得结在相同条件下，由一个分析人员同一次测定所得结果的精密度称为果的精密度称为重复性重复性; ; 在不同实验室由不同分析人员测定结果的精密度，在不同实验室由不同分析人员测定结果的精密度，称为重现性。考察的变动因素包括不同实验室，不同分称为重现性。考察的变动因素包

109、括不同实验室，不同分析人员，不同仪器，不批号试剂，不同测试耗用时间，析人员，不同仪器，不批号试剂，不同测试耗用时间，不同环境（分析温度、湿度等）、不同测定日期等。当不同环境（分析温度、湿度等）、不同测定日期等。当分析方法将被法定标准采用时，应进行重现性试验。分析方法将被法定标准采用时，应进行重现性试验。89中药成分测定方法三、专属性三、专属性 T专属性是指在其他成分可能存在下，采用的方专属性是指在其他成分可能存在下，采用的方法能正确测定出被测成分的特性。法能正确测定出被测成分的特性。T考察共存组分是否对被测组分的测定有干扰。考察共存组分是否对被测组分的测定有干扰。T中药组成复杂，成分不完全清楚

110、，干扰物质的中药组成复杂，成分不完全清楚，干扰物质的化学纯品不一定都能得到，给考察分析方法的专化学纯品不一定都能得到，给考察分析方法的专属性带来困难，因此常用属性带来困难，因此常用阴性对照法阴性对照法。T 通过样品的预处理（提取、分离净化、衍生化）通过样品的预处理（提取、分离净化、衍生化）提高分析方法的专属性尤为中药。提高分析方法的专属性尤为中药。90中药成分测定方法四、线性与范围四、线性与范围 分析方法的线性是指在设计的范围内，测试结果与试样中分析方法的线性是指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度成正比关系的程度。换言之，就是试样中被测物浓度被测物浓度成正比关系的程度。换言之，就是试样

111、中被测物浓度的变化与试验结果（或测得的响应信号）成线性关系。的变化与试验结果（或测得的响应信号）成线性关系。 所谓线性范围是指能达到一定精密度，准确度和线性，测所谓线性范围是指能达到一定精密度，准确度和线性，测试方法适用的高、低限浓度或量的区间。试方法适用的高、低限浓度或量的区间。 线性与范围可通过绘制标准曲线来确定。线性与范围可通过绘制标准曲线来确定。 通常是在一定条件下，分别精密制备至少通常是在一定条件下，分别精密制备至少6 6个不同浓度的供个不同浓度的供试样品（或对照品）进行测定，用作图法（响应信号或经数学转试样品（或对照品）进行测定，用作图法（响应信号或经数学转换的响应信号（换的响应信

112、号（Y Y）对被测物浓度或量（）对被测物浓度或量（X X）作图）或计算回归方）作图）或计算回归方程（程（Y=a+bXY=a+bX）得标准曲线。）得标准曲线。 用相关系数（用相关系数（r r）来衡量标准曲线的）来衡量标准曲线的线性度，并控制线性度，并控制r0.999r0.999，但薄层色谱扫描定量中，但薄层色谱扫描定量中r 0.995r 0.995即即可。可。 91中药成分测定方法五、耐用性五、耐用性 耐用性是指在测定条件有小的变动时，测定结果耐用性是指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为常规检验提供依据。开始研不受影响的承受程度，为常规检验提供依据。开始研究分析方法时，就应考

113、虑其耐用性。如果测试条件要究分析方法时，就应考虑其耐用性。如果测试条件要求苛刻，则应在方法中写明。求苛刻，则应在方法中写明。 典型的变动因素有：被测溶液的稳定性，样品提典型的变动因素有：被测溶液的稳定性，样品提取次数，时间等。取次数，时间等。 液相色谱液相色谱法典型的变动因素有：流动相的组成和法典型的变动因素有：流动相的组成和pHpH值，不值，不同厂牌或不同批号的同类型色谱柱，柱温、流速等。同厂牌或不同批号的同类型色谱柱，柱温、流速等。 气相色谱气相色谱法的变动因素有：不同厂牌或批号的色谱柱、固定法的变动因素有：不同厂牌或批号的色谱柱、固定相、不同类型的担体、柱温、进样口和检测器温度等。相、不同类型的担体、柱温、进样口和检测器温度等。 薄层色谱薄层色谱法的变动因素有：吸附剂或薄层板的型号和厂牌，法的变动因素有：吸附剂或薄层板的型号和厂牌，展开时的温度、湿度等。展开时的温度、湿度等。92中药成分测定方法此课件下载可自行编辑修改，供参考！此课件下载可自行编辑修改，供参考！感谢你的支持，我们会努力做得更好！感谢你的支持，我们会努力做得更好！