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1、 1 1、直接、直接疗法：法：纠正突正突变基因基因 也就是在原位修复缺陷的基因，以达到也就是在原位修复缺陷的基因，以达到治治疗目的。目的。这种方法上种方法上较理想的基因治理想的基因治疗策略，由于存在某些策略，由于存在某些问题，目前正在努力，目前正在努力之中。（未之中。（未实现） 2 2、间接接疗法：以正常基因替代致病基因。法：以正常基因替代致病基因。 导入外源正常基因，代替有缺陷的基因。入外源正常基因，代替有缺陷的基因。对靶靶细胞而言，没有去除或修复有缺陷的胞而言，没有去除或修复有缺陷的基因。基因。 二者均是用二者均是用DNADNA重重组技技术设法修复患者法修复患者细胞中有缺陷的基因，使胞中有
2、缺陷的基因，使细胞恢复正常功胞恢复正常功能而达到治能而达到治疗遗传病的目的。病的目的。 1 1 途途 径径就基因就基因转移的受体移的受体细胞不同，基因胞不同，基因治治疗有两种途径：有两种途径：1 1、生殖、生殖细胞基因治胞基因治疗 2 2、体、体细胞基因治胞基因治疗2 2 1 1、生殖、生殖细胞基因治胞基因治疗l l 理理论上将正常上将正常细胞基因胞基因转移到患者移到患者的生殖的生殖细胞（精胞（精细胞，卵胞，卵细胞早期胚胞早期胚胎）使其胎）使其发育成正常个体。育成正常个体。这是理想是理想的治的治疗方法，从根本上治方法，从根本上治疗遗传病，病，使其有害基因不能在人群中播散。使其有害基因不能在人群
3、中播散。 3 3但但还存在某些存在某些问题：1 1）靶）靶细胞的胞的遗传修修饰至今尚无至今尚无实质性性进展；展；2 2）基因）基因转移效率不高，只能用移效率不高，只能用显微注射方法；微注射方法；3 3）只适用于排卵周期短而次数多的）只适用于排卵周期短而次数多的动物，很物，很难适用于人适用于人类。（但目前（但目前辅助生殖技助生殖技术的的发展展较为有效的解有效的解决了决了获取卵取卵细胞的胞的办法。一次可法。一次可获取少者取少者3-53-5个，多者十几个。）个，多者十几个。）4 42 2体体细胞基因治胞基因治疗（somatic cell gene therapysomatic cell gene t
4、herapy） 是指将正常基因是指将正常基因转移到体移到体细胞，使之表达基因胞，使之表达基因产物，以达到物，以达到治治疗的目的。但有害基因能的目的。但有害基因能遗传给后代。后代。5 5 措措 施：施：l l（1 1）正常基因）正常基因转移至体外培养的体移至体外培养的体细胞，胞，有效表达后，再回有效表达后，再回输到体内。到体内。l l（2 2）正常基因）正常基因导入靶入靶细胞，定位整合到胞，定位整合到染色体上，准确的替染色体上，准确的替换异常基因，是理异常基因，是理想的措施。想的措施。l l（3 3）随机整合，非特定座位，只要有效）随机整合，非特定座位，只要有效的表达即可达到治的表达即可达到治疗
5、的目的。的目的。l l（4 4）体）体细胞基因理胞基因理论不必不必矫正所有的体正所有的体细胞。胞。6 6存在的存在的问题： l l（1 1）对特定座位基因特定座位基因转移，目前移，目前还存在存在较大困大困难；l l（2 2）随机插入可能引起后代的基因）随机插入可能引起后代的基因突突变。7 7基因治基因治疗的方法的方法（The methods of gene therapyThe methods of gene therapy） 实施基因治施基因治疗的第一个关的第一个关键性步性步骤是是 基因基因转移移 一、一、GeneGene转移方法移方法 8 81 1、正常基因的分离与克隆、正常基因的分离与克
6、隆基因治基因治疗首先首先获得目的基因通常从基因得目的基因通常从基因组中中分离分离 经克隆克隆 定定 位位 表表 达达 评价表达情况价表达情况9 92 2、外源基因的、外源基因的转移移l通通过不同方法，将目的基因不同方法，将目的基因转移移至受体至受体细胞。胞。1010（1）化学法磷酸磷酸磷酸磷酸钙钙沉淀法：沉淀法：沉淀法：沉淀法： 目的基因与磷酸目的基因与磷酸目的基因与磷酸目的基因与磷酸钙钙等物等物等物等物质质混合，形成沉淀的混合，形成沉淀的混合，形成沉淀的混合，形成沉淀的DNADNADNADNA微微微微细颗细颗粒，易通粒，易通粒，易通粒，易通过细过细胞膜胞膜胞膜胞膜进进入入入入细细胞内，并整合
7、到受胞内，并整合到受胞内，并整合到受胞内，并整合到受体体体体细细胞基因胞基因胞基因胞基因组组中，在适当条件下得以表达。方法中，在适当条件下得以表达。方法中，在适当条件下得以表达。方法中，在适当条件下得以表达。方法简简单单，但，但，但，但转转化效率低。化效率低。化效率低。化效率低。 Ca2(PO4)2+DNA Ca2(PO4)2+DNA 混合微混合微混合微混合微细颗细颗粒粒粒粒 （ Ca Ca Ca Ca离子离子离子离子浓浓度度度度 125 mmol 125 mmol 125 mmol 125 mmol， DNA DNA DNA DNA 离子离子离子离子浓浓度度度度 5 5 5 50ug/ml0
8、ug/ml0ug/ml0ug/ml。 PH 7.0 PH 7.0 PH 7.0 PH 7.0） 沉淀反沉淀反沉淀反沉淀反应应2030min2030min 细细胞在沉淀物中暴露胞在沉淀物中暴露胞在沉淀物中暴露胞在沉淀物中暴露 524h 524h1111(2)物理方法1、电穿孔法（穿孔法（electroporotion）将将细胞至于高胞至于高压脉冲脉冲电场中，通中，通过电压使使细胞胞产生可逆性的穿孔。周生可逆性的穿孔。周围基基质中中的的DNADNA可渗可渗进细胞，胞，进而表达。而表达。 瞬瞬瞬瞬间间细胞胞 细胞膜核摸通透性胞膜核摸通透性增加增加 高高高高压压脉冲脉冲脉冲脉冲 DNA渗入渗入细胞胞1
9、2122 2、显微注射法（微注射法（microinjection microinjection ）利用利用利用利用显显微操作把目的基因直接注入靶微操作把目的基因直接注入靶微操作把目的基因直接注入靶微操作把目的基因直接注入靶细细胞或胞或胞或胞或细细胞核中。胞核中。胞核中。胞核中。 1313例：转基因动物的制备 重重重重组组基因基因基因基因 DNA DNA 微注射微注射微注射微注射 （体外）（体外）（体外）（体外） 小鼠受精卵小鼠受精卵小鼠受精卵小鼠受精卵 回植回植回植回植 假妊娠假妊娠假妊娠假妊娠 仔仔仔仔 鼠鼠鼠鼠 动动物模型：物模型：物模型：物模型：转转基因鼠基因鼠基因鼠基因鼠 ( (每个鼠
10、每个鼠每个鼠每个鼠细细胞中都含有外源基因，按孟德胞中都含有外源基因，按孟德胞中都含有外源基因，按孟德胞中都含有外源基因，按孟德尔尔方式方式方式方式遗传遗传) )14141515clone sheep Dollyclone sheep Dolly体体体体细细胞胞胞胞 提取提取提取提取 核核核核 重重重重组细组细胞胞胞胞 回植回植回植回植 Dolly Dolly Dolly Dolly卵卵卵卵细细胞胞胞胞 去核去核去核去核 细细胞胞胞胞 16163 3、脂、脂质体法（体法（liposomeliposome）l l应用人工制用人工制备的的类似似细胞膜的膜性胞膜的膜性结构构 脂脂质体，包装外源基因，再
11、与靶体，包装外源基因，再与靶细胞融合，胞融合，外源外源DNADNA导入靶入靶细胞，使其表达。胞，使其表达。 DNA 胞融合胞融合胞融合胞融合 转转化化化化细细胞胞胞胞 PEG 仙苔病毒DNA脂膜17174同源重组法 同源重同源重组（homologus recombinationhomologus recombination）: :外源基因和染色体上的基因在同源序列外源基因和染色体上的基因在同源序列间发生重生重组而插入染色体。而插入染色体。 是将外源基因定位是将外源基因定位导入入细胞的染色体上。胞的染色体上。 单交交换 双交双交换 1818通通过同源重同源重组定点插入珠蛋白基因定点插入珠蛋白基因
12、Xha IBstXIXha IneoXhaIBstXIneo正常基因座位带有珠蛋白基因的质粒重组质粒 C重重组后，插入外源基因外源基因片段后，插入外源基因外源基因片段带有有neoneo基因（新基因（新霉素抗性基因），重霉素抗性基因），重组后的后的细胞在含有胞在含有neo neo 的培养基中生的培养基中生长，没有插入新基因的，没有插入新基因的细胞死亡，将有重胞死亡，将有重组的的细胞胞筛选出出来。来。19195.病毒介病毒介导基因内基因内转移（移（Viral Viral mediated transfermediated transfer）l l是通是通是通是通过过病毒病毒病毒病毒为载为载体（体（
13、体（体（vectorvectorvectorvector），将外源基因通），将外源基因通），将外源基因通），将外源基因通过过重重重重组组技技技技术术与病毒重与病毒重与病毒重与病毒重组组，然后去感染受体，然后去感染受体，然后去感染受体，然后去感染受体细细胞。胞。胞。胞。图图：感染细胞重组病毒2020 逆逆转录病毒病毒(RNA)(RNA) 常用的病毒常用的病毒载体体 DNADNA病毒病毒 1)逆逆转录病毒（病毒（retrovirus） 目前目前应用最多的最成功的是逆用最多的最成功的是逆转录病毒，病毒，病毒感染病毒感染细胞后，其基因胞后，其基因组RNA RNA 经逆逆转录产生双生双链DNADNA拷拷
14、贝，插入宿主染色体形成前，插入宿主染色体形成前病毒（病毒（provirusprovirus），前病毒），前病毒转录产生的正生的正链既是病毒既是病毒RNARNA，再与前病毒，再与前病毒编码的外壳蛋的外壳蛋白包装成新的病毒白包装成新的病毒颗粒。粒。 完整的病毒完整的病毒颗粒具有插入宿主染色体必粒具有插入宿主染色体必需的全套需的全套酶系系统，适用于介，适用于介导基因基因转移。移。21212222例如：小鼠白血病病毒（例如：小鼠白血病病毒（Mo-MLVMo-MLV）基因基因组结构：构： LTR LTR LTR LTR gag pol env gag pol envU5 R U3 U5 R U3 U5
15、R U3 U5 R U3 U3=U3=U3=U3=增增增增强强子，子，子，子，R=R=R=R=启启启启动动子，子，子，子，U5=U5=U5=U5=转录转录起始位点。起始位点。起始位点。起始位点。 = = = =病毒包装信号，病毒包装信号，病毒包装信号，病毒包装信号，gag =gag =gag =gag =核心抗原，核心抗原，核心抗原，核心抗原，pol=pol=pol=pol=逆逆逆逆转录酶转录酶， env=env=env=env=外壳蛋白。外壳蛋白。外壳蛋白。外壳蛋白。 2323逆逆转录病毒病毒载体体优点：点：l l高效感染宿主高效感染宿主细胞，胞，转染率可达染率可达100%100%；l l病
16、毒基因和所病毒基因和所载的外源基因都可能表达；的外源基因都可能表达；l l宿主范宿主范围广，可同广，可同时感染大量感染大量细胞并胞并长期存留期存留2424缺缺 点点 病毒基因容量有限，一般只能插入病毒基因容量有限，一般只能插入病毒基因容量有限，一般只能插入病毒基因容量有限，一般只能插入7kb7kb7kb7kb左右片段；左右片段；左右片段；左右片段； 病毒随机插入靶病毒随机插入靶病毒随机插入靶病毒随机插入靶细细胞基因胞基因胞基因胞基因组组中，因病毒具有中，因病毒具有中，因病毒具有中，因病毒具有强强大大大大的启的启的启的启动动子和增子和增子和增子和增强强子，能使插入点附近的基因子，能使插入点附近的
17、基因子，能使插入点附近的基因子，能使插入点附近的基因过过度度度度表达或失活，插入的表达或失活，插入的表达或失活，插入的表达或失活，插入的 外源基因可能不适当的表达；外源基因可能不适当的表达；外源基因可能不适当的表达；外源基因可能不适当的表达； 逆逆逆逆转录转录病毒有致病作用，可能使受体病毒有致病作用，可能使受体病毒有致病作用，可能使受体病毒有致病作用，可能使受体细细胞癌胞癌胞癌胞癌变变。 根据逆根据逆根据逆根据逆转录转录病毒的缺点，人病毒的缺点，人病毒的缺点，人病毒的缺点，人们们有目的地将其改有目的地将其改有目的地将其改有目的地将其改造，保留其造，保留其造，保留其造，保留其优优点，除去癌基因和
18、病毒基因，保留点，除去癌基因和病毒基因，保留点，除去癌基因和病毒基因，保留点，除去癌基因和病毒基因，保留LTRLTRLTRLTR和和和和包装信号。包装信号。包装信号。包装信号。2525二、靶二、靶细胞的胞的选择l l 是指接受外源是指接受外源GeneGene的体的体细胞，胞，选择靶靶细胞的原胞的原则是：是：l l1 1）必）必须较坚固，便于体外培养和固，便于体外培养和进行行遗传技技术操作；操作；l l2 2）易于由人体分离又便于）易于由人体分离又便于输回体内，回体内， 具有增殖具有增殖优势，生命周期，生命周期长，能存活，能存活几月至几年，或整个生命周期；几月至几年，或整个生命周期；l l3 3
19、）易于受外源）易于受外源遗传物物质转化。化。2626某些代表性某些代表性细胞胞l l外周血外周血T T淋巴淋巴细胞、皮肤成胞、皮肤成纤维细胞胞较符合上述要求。符合上述要求。l l此外，造血干此外，造血干细胞胞地中海地中海贫血、血、严重复合免疫缺陷病等基因治重复合免疫缺陷病等基因治疗。l l肝肝CC家族性高胆固醇血症、低密度家族性高胆固醇血症、低密度脂蛋白病的脂蛋白病的 基因治基因治疗。2727基因治基因治疗存在的存在的问题与与论理学理学l l基因基因 治治疗的研究与的研究与实践中存在若践中存在若干重要干重要问题，所以更多的是，所以更多的是处于研于研究究阶段，段，临床床应用用还有待深入。有待深入
20、。2828一、导入基因的持入基因的持续性和高效表达性和高效表达l l如何提高基因的持如何提高基因的持续高效表达，从下列高效表达，从下列几方面考几方面考虑： 1 1、选择高效的基因高效的基因转移方法；移方法； 2 2、选择适当的受体适当的受体细胞（生命周期胞（生命周期长的的细胞）胞） 3 3、选择适当的适当的载体（广泛表达或特异性表体（广泛表达或特异性表达的达的载体，以使体，以使GnenGnen高效表达）高效表达）2929二、二、GeneGene治治疗与社会与社会伦理道德理道德体体细胞胞GeneGene治治疗符合符合伦理道德，没有争理道德，没有争议。生殖生殖细胞胞GeneGene治治疗可能改可能
21、改变正常人的正常人的遗传特征，存在某些争特征，存在某些争议。然而生殖。然而生殖细胞的基胞的基因治因治疗又是一个不容回避的又是一个不容回避的课题，因，因为它它比体比体细胞基因治胞基因治疗更更为彻底。所以，随着底。所以，随着分子生物学技分子生物学技术的的发展，展，GenGen治治疗技技术的成的成熟，将回答熟，将回答伦理道德方面的理道德方面的问题，相信生殖，相信生殖细胞的基因治胞的基因治疗将会被人将会被人们接受。接受。3030三、三、GeneGene治治疗的的现状与前景状与前景l l体体细胞胞GeneGene治治疗临床床实验已已经开始，开始，生殖生殖细胞胞GeneGene治治疗正在完善。正在完善。进
22、行行基因治基因治疗必必须具具备下列条件：下列条件：3131具备下列条件l l选择适当的疾病，清楚疾病的适当的疾病，清楚疾病的发病机理，病机理，GeneGene的的结构和功能。构和功能。l l被被纠正的基因已克隆，并清楚正的基因已克隆，并清楚GeneGene表达与表达与调控机制与条件。控机制与条件。l l选择适当的受体适当的受体细胞并在体外有效表达。胞并在体外有效表达。l l安全有效的基因安全有效的基因转移方法，以及供利用的移方法，以及供利用的动物模型。物模型。3232基因治基因治疗实例例1、复合免疫缺陷、复合免疫缺陷综合征的基因治合征的基因治疗（人（人类GeneGene治治疗成功例子）。成功例
23、子）。l lADAADA缺乏症缺乏症-致死性疾病，患者由于致死性疾病，患者由于腺苷酸脱氨腺苷酸脱氨酶（ADAADA）缺乏。）缺乏。 3333ADA-Gene + vector ADA-Gene + vector （逆（逆（逆（逆转录转录病毒）病毒）病毒）病毒） 重重重重组组分子分子分子分子 患者患者患者患者T Ly C IL-2T Ly C IL-2刺激刺激刺激刺激C C分裂分裂分裂分裂 导导入入入入 细细胞生胞生胞生胞生长长分裂分裂分裂分裂 10 10天天天天 Gene Gene表达表达表达表达 回回回回输输患儿体内患儿体内患儿体内患儿体内 12 12月治月治月治月治疗疗一次一次一次一次10
24、10个月个月个月个月患儿体内患儿体内患儿体内患儿体内ADAADA水平达正常人的水平达正常人的水平达正常人的水平达正常人的25%25% 34342、乙型血友病l lXR XR ，患者凝血因子，患者凝血因子缺乏，缺乏，因子基因子基因定位在因定位在Xq26.3Xq26.3q27.2q27.2。临床表床表现，易出血，凝血易出血，凝血时间长，轻伤、小手、小手术后常出血不止。后常出血不止。发病率病率为1/301/30000000。l l例如：我国学者薛京例如：我国学者薛京伦实施的施的FF的基的基因治因治疗。3535l l逆逆转录病毒病毒载体体 +FcDNA +FcDNA 重重组体体 l l5 LTR F
25、neo SV PSO LTR 3l l导入入仓鼠鼠细胞（胞（CHO CHO ）FF表达；表达；l l导入乙型血友病患者皮肤成入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体胞（体外培养）外培养）FF表达；表达；l l9191年，年，导入乙型血友病患者皮肤成入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外培养）胞（体外培养）回植病人皮下回植病人皮下FF基因基因表达，表达，FF基表达水平达正常人的基表达水平达正常人的5%5%。l l 是我国基因治是我国基因治疗成功的例子。成功的例子。36363 3、黑色素瘤的基因治、黑色素瘤的基因治疗l l肿瘤瘤GeneGene治治疗是人是人们十分关注的十分关注的问题，进行了广泛的探索。研
26、究行了广泛的探索。研究发现，肿瘤瘤浸浸润淋巴淋巴细胞胞TILTIL，它，它积聚聚肿瘤部瘤部位，并在位，并在该处持持续存在而无副作用，存在而无副作用，利用此特点利用此特点协助治助治疗肿瘤。瘤。3737例：例：例：例：细细胞因子基因治胞因子基因治胞因子基因治胞因子基因治疗疗和和和和肿肿瘤坏死因子基因治瘤坏死因子基因治瘤坏死因子基因治瘤坏死因子基因治疗疗IL-2 Gene IL-2 Gene TNF-GeneTNF-Gene （白介（白介（白介（白介2 2 2 2） （肿肿瘤坏死因子）瘤坏死因子）瘤坏死因子）瘤坏死因子） 逆逆逆逆转录转录病毒病毒病毒病毒载载体体体体 导导入入入入 TIL TIL T
27、IL TIL（体外培养的自体（体外培养的自体（体外培养的自体（体外培养的自体细细胞）胞）胞）胞） 回植患者体内回植患者体内回植患者体内回植患者体内 TILTILTILTIL进进入自体入自体入自体入自体肿肿瘤部位，提高瘤部位，提高瘤部位，提高瘤部位，提高细细胞因子胞因子胞因子胞因子杀伤肿杀伤肿瘤瘤瘤瘤细细胞胞胞胞 的作用。的作用。的作用。的作用。38384 4、自、自杀基因的基因治基因的基因治疗 原理：即用（逆原理：即用（逆转录）病毒）病毒载体将体将编码某种某种酶的基因（自的基因（自杀基因）基因）转染到染到肿瘤瘤细胞中，此胞中，此酶可将一种无害的可将一种无害的药物前体物前体转变为细胞毒复合物，胞
28、毒复合物，进而而杀伤肿瘤瘤细胞（胞（肿瘤瘤细胞不能复制而死亡）。胞不能复制而死亡）。这种种基因基因载体只能在特定的体只能在特定的组织或或肿瘤中表瘤中表达，而正常达，而正常细胞中不表达。胞中不表达。3939如：自杀基因 + 病毒载体 转染 重组载体 药物前体 无毒Gene酶 药物复合物 有毒 细胞死亡4040例如：例如：例如：例如： 单纯单纯疱疹病毒疱疹病毒疱疹病毒疱疹病毒 哺哺哺哺乳乳乳乳动动物物物物细细胞胞胞胞 HSV Gene-TK HSV Gene-TK （在（在（在（在肿肿瘤瘤瘤瘤细细胞中表达，正常胞中表达，正常胞中表达，正常胞中表达，正常细细胞中不表达）胞中不表达）胞中不表达）胞中不
29、表达） GeneTK GeneTK GCV GCV（胸苷（胸苷（胸苷（胸苷类类似物）似物）似物）似物） TdR TdR P p P p GCV-p GCV-p 抑制抑制抑制抑制DNADNA合成合成合成合成 脱脱脱脱氧胸苷酸氧胸苷酸氧胸苷酸氧胸苷酸 肿肿瘤瘤瘤瘤细细胞死亡胞死亡胞死亡胞死亡 邻邻近近近近细细胞死亡胞死亡胞死亡胞死亡/ /凋亡（旁凋亡（旁凋亡（旁凋亡（旁观观者效者效者效者效应应）41415 5、反、反义核酸基因治核酸基因治疗反反义技技术：是指利用人工合成的反：是指利用人工合成的反义RNARNA或或DNADNA导入靶入靶细胞，阻断胞，阻断GeneGene的的转录或复制，控制或复制，控
30、制细胞的中胞的中间阶段使段使编码蛋白的蛋白的GeneGene不能不能转录为mRNA mRNA 或阻或阻断翻断翻译相相应蛋白蛋白. . 4242反反义基因治基因治疗 DNA DNA RNA RNA 反义RNA 阻断表达 4343目前采用的技目前采用的技术：l l反反义RNARNA表达表达载体体l lVector Cell Vector Cell 转录RNA RNA 阻断阻断mRNAmRNAl l反反义RNA/DNARNA/DNA体外微注射体外微注射l l质脂体运脂体运载反反义RNARNA；l l其他方法其他方法 Cacl2 Cacl2沉淀方法，沉淀方法，细胞打孔胞打孔仪，逆，逆转录病毒病毒导入方法。入方法。4444 医学医学遗传学考学考试形式形式简介介 一一 、选择题（2020题，每，每题0.50.5分，共分，共1010分）分） 二、判断正二、判断正误（ 20 20题，每，每题0.50.5分，共分，共1010分）分） 三、填空三、填空题（1010题，每，每题1 1分，共分，共1010分）分） 四、解四、解释概念（概念（1010题，每，每题2 2分，共分，共2020分）分） 五、分析叙述五、分析叙述题（5 5题，每，每题1010分，共分，共5050分）分） 复复习题由网由网络学院在网上播出学院在网上播出45454646
