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1、酶的分子改造获得具有优良性质的生物催化剂新酶催化剂的获得途径q新酶筛选q可培养微生物酶的筛选：富集、驯化q不可培养微生物酶的筛选：宏基因组 q基因数据库挖掘q现有酶的分子改造q理性设计 (Rational design)：在深入了解酶的结构、功能和催化机制等信息的基础上，对酶的突变位点进行精确设计，采用基因工程手段对天然酶的序列进行改造，获得具有所需性能的新酶q定向进化 (Directed evolution)：通过随机突变、DNA重组等手段对酶的基因序列进行改造，并对获得的突变酶库进行定向筛选获得性能优异的突变酶酶蛋白的理性设计改造酶的理性设计改造步骤n分子模建：根据已知的目标酶一级结构序列
2、，构建蛋白质的分子图像n理性设计突变位点：通过对酶结构与性能之间的关系的理性分析，确定需突变的氨基酸残基n酶的突变与表达：n通过基因工程手段，对酶基因DNA进行定点突变n选择合适的表达载体与宿主，对突变酶进行高效表达n对突变酶的性质进行分析，指导新一轮理性设计蛋白质一级结构决定高级结构蛋白质一级结构决定高级结构酶的理性设计改造 分子建模n序列分析：序列分析：n基因测序确定目标酶的一级结构，从公共酶数据库搜索相关序列，用免费的ClustalW程序或服务器做多重序列联配 公共酶数据库：http:/www.brenda.uni-koeln.de ClustalW 服务器：http:/www.ch.e
3、mbnet.org/software/ClustalW.htmln分子模建：分子模建：以已知的同源蛋白质结构为模板对目标酶进行同源模建 Swissmodel同源模建服务器：http:/swissmodel.expasy.org n分子图像：分子图像：模建成功，服务器会E.mail返回PDB文件，可用Rasmol或 PDBviewer等免费软件进行演示分析Gre2pCgKR1Homology modeling of CgKR1Small pocketObey the Prelog rule!H-bond donorDocking analysisLarge pocketBMEH同源模建同源模建模
4、板：模板：human EH (PDB entry code: 3I28)Ramachandran plot结构比对图结构比对图 ( 黄色黄色: BMEH)均方根偏差 RMSD: 1.24 最好的区域：90.6%允许的区域：9.4%不允许的区域：0%总的一致性分值总的一致性分值: 107.8 (期望值期望值 58.75130.55)注：同源模建和分子对接工作是与药学院唐赟教授课题组合作完成。注：同源模建和分子对接工作是与药学院唐赟教授课题组合作完成。Docking 解释对映选择性解释对映选择性主要理论依据：主要理论依据：Bruice等提出的易于进攻构象理论(near attack conform
5、ations, NACs)B. Schitt, T. C. Bruice, J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 1455814570.距距 离离: 3.2 角度角度1: 145 15o角度角度2: 90 15oDocking 解释对映选择性解释对映选择性a AD分别为底物分别为底物25在在BMEH活性位点的分子对接图活性位点的分子对接图SubstrateG (kcal/mol)d (Angstroms)1 (deg)2 (deg)RSRSRSRS225.322.83.13.7136.8 106.8 85.155.0323.422.63.23.8136.9 110.184.
6、261.7423.021.43.23.6128.3 105.1 74.651.8527.529.03.22.9121.9 153.7 73.499.9Docking 实验结果实验结果反反应应较较快快对对映映体体具具有有: 较较低低的的能能量量，较短的距离和较大的角度较短的距离和较大的角度进一步地解释需要更准确的酶结进一步地解释需要更准确的酶结构和采用构和采用MD分析等分析等a The data shown are the average values of three independent docking simulations. 在已知DNA序列中取代特定的核苷酸，从而改变酶结构中特定的氨
7、基酸残基；或对一段最可能影响酶功能与性质的基因序列进行随机突变，可以表达产生一个或一系列突变酶分子。 n寡核苷酸引物介导的PCR定点突变法n盒式突变法nDNA全合成法 酶的理性设计改造 DNA定点突变寡核苷酸引物介导的PCR定点突变法盒式突变法(cassette mutagenesis) 盒式突变法，又称片段置换法(DNA fragment replacement)，是1985年Wells提出的n利用目标基因的适当限制性内切酶位点，用任意长度和序列的DNA片段来置换或取代目标基因上的一段DNA序列n通过盒式突变可以对特定位点的氨基酸残基进行饱和突变；也可以用来产生嵌合蛋白质，将蛋白质分子中的整
8、个结构域用完全不同的氨基酸序列来置换n通过盒式突变可以产生各种特异性的突变或突变家族，在这些突变体中各种不同的序列被集中在目标酶的一个特定区域，从而为研究蛋白质特定结构区段的功能提供了一个切实可行的方法DNA全合成法图7-1 基因组装PCR理性设计理性设计突变酶突变酶突变位点突变位点研究目的研究目的研究结果研究结果枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶Met222SerMet222Leu提高酶的抗氧化能力提高酶的抗氧化能力饱和突变，保留原酶活力饱和突变，保留原酶活力的的50在在1 M H2O2存在下，存在下，1 h不丢失酶活力不丢失酶活力枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶Asp90Lys Glu156Lys提
9、高该酶在提高该酶在pH7的酶活的酶活力力Pka由由7降为降为6，在，在pH7时时酶活力提高酶活力提高3倍倍葡萄糖异构酶葡萄糖异构酶Gly138Pro提高热稳定性提高热稳定性热半衰期提高了热半衰期提高了1倍，最倍，最适温度提高了适温度提高了1012oCL-天冬酰胺酶天冬酰胺酶IILys196Ala降低免疫原性降低免疫原性酶活力保持不变，免疫原酶活力保持不变，免疫原性降低了性降低了2.5倍倍尿激酶原尿激酶原Lys300His提高溶栓活性提高溶栓活性降低了内源性催化活性，降低了内源性催化活性，增加了溶栓活性增加了溶栓活性2倍倍脂肪酸合成酶脂肪酸合成酶改变了改变了7个氨基酸残基个氨基酸残基改变酶的催化
10、功能改变酶的催化功能将去饱和酶改为将去饱和酶改为 -羟化酶羟化酶改造实例改造实例 ChemBioChem 2009, 10, 853 861Shape of the substrate binding site in CYP102A1 wild type (centre) near to the active haem (yellow).The transition-state model to rationalize the enantioselectivity in the lipase-catalyzed kinetic resolution of secondary alcohols
11、(residues 287 and 290 are added to the original version)理性设计改造的优势及其局限性n目标明确，工作量较小n目前，研究确定了影响酶稳定性(热稳定性、pH稳定性、有机溶剂耐受性等性质)的许多结构特征，理性设计在改善酶稳定性方面具有较高的成功可能性n对其它基本性质(如活性、底物特异性、对映选择性)和结构之间的关系的理解还非常不充分，其结构影响参数难以清楚地界定，成功范例较少n有理设计改造将来的进步主要依赖酶结构-功能方面的重大认识突破，其次在于结构生物学方面结构鉴定的进展，和生物信息学方面模建程序的完善酶蛋白的定向进化改造蛋白质定向进化概念的
12、提出 1993年，美国科学家Arnold FH首先提出酶分子的定向进化的概念，并用于天然酶的改造或构建新的非天然酶。Frances H. Arnold酶的定向进化n人为创造特殊的条件，模拟自然进化机制，在体外对基因进行随机突变；从一个或多个已经存在的亲本酶(天然的或者人为改造的)出发，经过基因的突变和重组，构建人工突变酶库，采用高效的筛选或选择方法，最终获得具有某些优良特性的进化酶n定向进化=随机突变/正向重组+定向选择/筛选 生物催化剂的定向进化选择出发基因通过随机突变和/或基因重组建立多样性突变基因库表达载体多样性基因克隆进表达载体并在相应的微生物中表达优良的突变基因优良的突变基因,作为下
13、一轮操作的出发基因，进行多轮循环大量表达，用于生产等过程大量表达，用于生产等过程挑选/筛选突变酶基因库的建立n易错PCR (Error prone PCR)nDNA改组 (DNA Shuffling)n随机引发重组 (Random-priming recombination)n交错延伸 (Stagger extension process)易错PCR 在PCR扩增目的基因的同时引入碱基错配，获得随机突变基因片段n调整反应条件，如提高镁离子浓度，加入锰离子，改变体系中四种dNTP的浓度等，即可调节基因扩增的突变频率n使用Mn2+代替Mg2+作为DNA合成酶的激活剂使碱基配对错误率提高，0.12
14、10-4 (标准条件) 7 10-3n通常控制每个基因2-5碱基替代的平均突变水平，对应导致1-3个氨基酸的变异。更高的突变率将导致高比例无活性克隆的产生n一轮突变库中经筛选得到的改良突变子可以再进行下一轮的易错PCR，反复进行随机突变，使正向突变逐步得到积累，直到获得所需的突变酶 n由于ep-PCR所固有的突变偏向性，该方法并不是真正随机的。据测算，平均突变数为5.7种氨基酸替代DNA Shuffling将出发DNA分子随机剪切为50-100bp的片段，凝胶纯化在没有引物的情况下进行40-60个循环的PCR操作。片段之间相互配对，DNA链延伸，并在下一个PCR循环中扩增。用全长DNA两端引物
15、PCR扩增获得全长突变体产物，凝胶纯化回收，克隆到目标载体中。 DNA Shuffling的优缺点 n优点：模仿了自然界的杂交重组进化，优点：模仿了自然界的杂交重组进化，被称为被称为“有性重组有性重组”，提供了使，提供了使DNA快快速功能性进化的方法速功能性进化的方法 与自然界的双亲本重组相比，还可实现与自然界的双亲本重组相比，还可实现多亲本分子的重组，更具优势多亲本分子的重组，更具优势 n缺点：对亲本基因序列的同源性要求较缺点：对亲本基因序列的同源性要求较高高(常常不小于常常不小于90%) 产物中有较多未重组的亲本产物中有较多未重组的亲本DNA交错延伸(Stagger extension p
16、rocess) 以具有一定同源性的(多种)亲本基因作为模板，进行PCR扩增反应 采用非常短的退火/延伸时间，提前终止引物延伸，产物在下一轮循环中与不同母体模板链随机退火，生成重组序列 ，并进一步延伸 多次循环，直至形成全长杂合基因。最后应用两端引物扩增获得完整的杂合基因。 随机引发重组(Random-priming recombination)以单链DNA 为模板，配合一套随机序列引物，产生大量互补于模板不同位点的短DNA 片段，由于碱基的错配和错误引发，这些短DNA片段中也会有少量的点突变获得的短DNA片段互为引物进行PCR延伸，最终组装成完整长度的基因定向进化的筛选方法qSelection
17、Selection (选择) 施加一定选择性压力，仅使库中表达具有所需优良性质的酶的克隆存活或生长地更快。它要求目标酶与微生物的生存/生长有关联性 物竞天择，适者生存，真正模拟自然进化。qScreeningScreening (筛检) 在库中存在大量其它成员的情况下，采用高通量、高灵敏度、高选择性的方法挑选所需的目标酶 You get what you screen for !代表性的选择方法方法选择压特征抗生素抗生素能够降解或修饰抗能够降解或修饰抗生素物质生素物质常用作分子生物学工具常用作分子生物学工具生长的选择性物质生长的选择性物质 能够降解选择性化能够降解选择性化合物合物降解物质成为生长
18、需要的元降解物质成为生长需要的元素如素如N N、C C、S S自养互补作用自养互补作用恢复代谢功能恢复代谢功能强阳性选择强阳性选择活性选择n挑选通常用于胞内酶进化，因为对它们来说，细胞生存和酶活之间的必需联系易于实施 n将枯草杆菌的细胞生长和胞外蛋白酶(subtilisin)相联系，细胞生长于中空纤维内，平均密度为每纤维一个克隆，用牛血清白蛋白作为唯一氮源。分泌更多枯草杆菌蛋白酶或活力更强的酶的细胞将获得更多的氮源，生长地更快。中空纤维提供了微小的分隔，限制了交叉给料。Appl Microbiol Biotechnol, 1998, 49: 290-294 高通量筛选技术1突变微生物分离突变微
19、生物分离琼脂板涂布法 在特殊条件下培养突变菌，通过宿主菌的生长情况、培养基颜色、特定反应的出现等判断是否具有目的基因。微球细胞固定法 与数字成像系统结合，将单个细胞附着在单个固体珠上，突变体进行分离和筛选。流式细胞计数法 细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，排成单行，逐个通过流式细胞计数仪进行测定。高通量筛选技术2酶活力检测 反应产物显色pH指示剂显色对硝基苯酚和伞形酮衍生物等显色底物分光光度计和荧光酶标仪通过检测底物消耗或产物生成进行终点检测GC/HPLC，使用较短的柱子以缩短分析时间同位素标记底物质谱热力学红外检测定向进化改造的实例目标酶改造对象结果卡那霉素核苷基转移酶热稳定性在60-50
20、酶半衰期增加200倍枯草杆菌蛋白酶有机溶剂耐受性在60二甲基亚砜溶液中的活力提高170倍-内酰胺酶作用于新底物对cefotaxime的活力提高32000倍对硝基苯酯酶有机溶剂中的底物特异性和活性活力增加60-150倍-半乳糖苷酶底物特异性活力增加66倍，底物特异性增加1000倍环己酮单加氧酶催化硫醚氧化的对映选择性产物ee值从14%(R)提高到98.9%(R)以及99.7%(S)定向进化-产物显色筛选 巨大芽孢杆菌P450 BM-3，最适底物为C12-C18的脂肪酸，对短链烷烃羟化活力较低 两轮易错PCR，最佳突变酶的比活提高了5倍Adv. Synth. Catal., 2001, 343:
21、601-606定向进化-荧光产物筛选Curr. Opin. Biotechnol., 2000, 11: 325330 通过定向进化，将通过定向进化，将P450camP450cam的萘羟化活力提高的萘羟化活力提高2020倍倍 野生型酶以野生型酶以O O2 2为氧化剂，需要为氧化剂，需要NADPHNADPH，而突变酶以而突变酶以H H2 2O O2 2为氧化剂，无须辅酶为氧化剂，无须辅酶定向进化-酶的对映选择性筛选nORGANICnLETTERSOrg. Lett., 2004, 6: 177-180部分理性设计方案(Semi-rational approach) 使用定向进化技术对酶进行改造无
22、须了解酶的结构与功能之间的关系，但是对大规模酶库进行筛选工作量较大，人们提出了一些方案减小工作量n根据了解的结构信息限定随机突变的区域n随机突变，随后进行饱和突变n通过计算机模拟对突变库进行筛选，确定可行的突变方案部分理性设计方案(Semi-rational approach)n组合活性位点饱和突变(combinatorial active site saturation test)n使用NDT密码子n通过软件分析，确定可行的突变方案组合活性位点饱和突变NNK Codon vs. NDT CodonN: adenine/cytosine/guanine/thymine; K: guanine/
23、thymineD: adenine/guanine/thymine; T: thymineNDT密码子编码的氨基酸：Phe, Leu, Ile, Val,Tyr, His, Asn, Asp, Cys, Arg, Ser, Gly排除的氨基酸：Ala，Lys，Glu，Gln，Pro，Met，The，Trp3DM软件分析确定可变氨基酸残基n鉴定各位点的氨基酸分布/频率n鉴定有利于进化的氨基酸或不允许的氨基酸/折叠水解酶的折叠水解酶的3DM数据库分析数据库分析使用允许的使用允许的aa残基残基使用不允许的使用不允许的aa残基残基饱和突变饱和突变48photophoto protein enginee
24、ring chemical biology biomaterials self-assembly artificial proteins biocatalyisJin Kim MontclareAssistant Professor, New York University78%COMPLETEphotophotoGreen biocatalysts Peter James BakerFellow49Teflon 聚四氟乙烯(Polytetrafluoroethene)，一般称作“不粘涂层” ,是一种使用了氟取代聚乙烯中所有氢原子的人工合成高分子材料。具有抗酸碱、抗各种有机溶剂和耐高温的特点，
25、普遍用于厨房锅灶涂层，给人们带来了“不粘锅”。纽约大学理工学院科学家受特氟龙材料的启发，制造出一种能在高温下保持活性和功能的氟化蛋白质，极具应用前景，能广泛用于工业洗涤剂、国防和医疗等多个领域。50 PTE发挥活性需为二聚体，而其界面部分是由苯丙氨酸介导的(F65, F72, F73, F104, F132, F149和F179)。 作者以单氟取代的苯丙氨酸，即对氟苯丙氨酸(pFF)替代原有的苯丙氨酸，希望提高其稳定性，并改善其功能。 利用苯丙氨酸缺陷型E.coli AF-IQ来实现 亲和色谱纯化后，pFF-PET浓度仅2 mg L-1，为PET的十分之一(20 mg L-1)。 浓度低主要是
26、由于pFF-PET产生了不溶性包涵体，使可溶表达水平降低。51 检测pFF的引入情况： 1) MALDI-TOF MS (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometer) 基质附助激光解吸电离离子源(MALDI)的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。它是一种软电离技术，适用于混合物及生物大分子的测定。 飞行时间质量分析器TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根
27、据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比(M/Z)与离子的飞行时间成正比，检测离子。 2) 氨基酸含量测定：证实有89.4%的pFF引入，保证pFFS在PET中的高含量。52Supporting Information Figure 3. Structural comparison of PTE and pFF-PTE. Far-UV CD spectra of PTE (closed triangles) and pFF-PTE (closed circles) at 25 oC, after heating to 70 oC and cooling to 25 oC the s
28、pectra for PTE (open triangles) and pFF-PTE (open circles) was reassessed.70加热15 min后，冷却至25，圆二色谱法检测，发现PTE结构完全被破坏，pFF-PTE仍有部分结构保持：208 nm仍有33%的信号，222 nm残余30%。证明：氟化后蛋白有恢复折叠的能力53 Differential scanning calorimetry(DSC) 差示扫描量热法 用于测定蛋白质的Tm值(Melting Temperature) 对PTE及pFF-PTE进行了两次温度扫描测定，温度范围：0-70oC，初次扫描两种蛋白都
29、出现了两次恒温过渡(endothermic transitions)，pFF-PTE比PTE过渡温度稍有提高(1.3-2.5oC)，第二次加热扫描中，PTE无恒温过程，而pFF-PTE仍出现两次，但温度稍有下降。 在热变性后，pFF-PTE可重折叠Figure 2. Differential scanning calorimetry of PTE and pFF-PTE. A) Initial scan of PTE from 070oC. B) Initial scan of pFF-PTE from 070oC. C) Secondary scan of pFF-PTE from 070o
30、C.542.43.36.95.82.94.73.7 氟化后酶对底物1,3的活力提高，对2则降低部分由于F132位于活性位点的离去基团口袋；若将其突变为酪氨酸，活力提高。 氟化的PTE对相同的有机磷酸酯家族的底物1和2有明显的选择性，但是对不同家族的底物(1和3)，选择性有所下降。55 Figure 3. Residual activity assay on PTE (black) and pFF-PTE (gray) for substrates : A) 1,B) 2, and C) 3. In all cases the data is shown as the average of three experiments and the error bars represent the standard deviation. 65oC温育后，PTE对三种底物皆无活力，而pFF-PTE仍能保持41%，23%和31%的活力氟化作用增强了蛋白质的稳定性，更能耐受热钝化作用。习 题1、列表比较分析理性设计改造与定向进化改造的差异2、例举3个酶定向进化改造的例子，分别针对酶的稳定性、活性以及选择性这三个方面。对研究者所采用的DNA突变策略以及筛选方法作简单说明。请列出出处。
