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1、诊断学诊断学2临床病原学检查山东大学刘金玲临床病原体检查目的临床病原体检查目的临床病原体检查目的临床病原体检查目的: :是确定感染的发生和性质，在疾病早期提供是确定感染的发生和性质，在疾病早期提供恰当的治疗方案，并采取有效的预防措施，恰当的治疗方案，并采取有效的预防措施，防止感染传播造成的危害。防止感染传播造成的危害。各种不同病原体的实验诊断方法遵各种不同病原体的实验诊断方法遵循以下基本原则循以下基本原则1.正确、规范采集和运送标本。2.直接显微镜查见病原体或检出病原体抗原，借助分子生物学的方法检测病原体核酸，结合病人的病史、症状或体征，快速作出初步诊断。3.初步诊断同时，对病原体进行分离与鉴
2、定。4.检测机体对病原体的免疫产物。5.参与临床选择抗菌药物，指导和监控微生物的治疗方案，避免 耐药菌株的产生。5病原学诊断细菌学诊断病毒学诊断真菌学诊断 致病菌的检验程序和常用项目致病菌的检验程序和常用项目直接涂片直接涂片染色镜检染色镜检分离培养分离培养形态特征形态特征生化试验生化试验血清学试验血清学试验动物实验动物实验明明确确诊诊断断初步诊断初步诊断血清学诊断血清学诊断细菌的快速鉴定细菌的快速鉴定形态学检查形态学检查（常规培养或特殊培养）（凝集试验、（凝集试验、 沉淀反应、免疫标记技术等）沉淀反应、免疫标记技术等）(微生物数字编码分类鉴定法、血培养自动化检测系统、核微生物数字编码分类鉴定法
3、、血培养自动化检测系统、核酸杂交技术、酸杂交技术、PCR技术、技术、DNA芯片技术等）芯片技术等）药药物物敏敏感感试试验验7细菌感染检查检验特点通过对标本直接显微镜检，病原菌的分离培养鉴定，病原菌的抗原检测，核酸检测和细菌感染后机体免疫应答产物的测定及药物的测定及药物敏感性试验，对细菌感染性疾病可作出及时、准确的病原学诊断。Diagnosis Strategy for Bacterial Infection9 革兰阳性菌革兰阳性菌(Gram positive bacteria)(Gram positive bacteria) 革兰阴性菌革兰阴性菌(Gram negative bacteria)
4、(Gram negative bacteria)涂片涂片结晶紫结晶紫 染色染色碘液碘液媒染媒染酒精酒精脱色脱色复红复红复染复染革兰染色法（革兰染色法（Gram Stain）由丹麦医生由丹麦医生Hans Christian Gram于于1884年年创立。立。1.步步骤直接涂片染色镜检适用于具有特征性形态和染色性的病原菌,如葡萄球菌、脑膜炎奈瑟菌、抗酸染色阳性的结核分枝杆菌等。大多数细菌的形态与染色并无显著特异性，因此需要分离培养。如肠道杆菌均为G-杆菌，菌落形态亦相同。培养特征：化脓性链球菌-小而透明、溶血环。分离培养生化试验：如肠道杆菌进行乳糖发酵试验。血清学试验：已知抗体测抗原或已知抗原测病
5、人血清中相应的抗体。如玻片凝集，鉴定菌种和型。动物试验：测定细菌的毒力、病原菌的分离和鉴定。分离培养血清学诊断血清学诊断原理：已知抗体测未知抗原进行病原菌的鉴定或用已知抗原检测患者体液中有无相应特异性抗体和其效价的动态变化，可作为某些传染病的辅助诊断。标本：双份血清标本，恢复期血清抗体效价比急性期升高4倍者方有意义。单份血清效价超过一定标准才有诊断意义。种类：凝集试验、沉淀试验、中和试验、补体结合试验。常用的血清学诊断方法 类型类型诊断应用举例诊断应用举例直接凝集试验直接凝集试验伤寒和副伤寒（肥达试验）、立克次体（外斐试验）、伤寒和副伤寒（肥达试验）、立克次体（外斐试验）、钩端螺旋体（显微凝集
6、试验）钩端螺旋体（显微凝集试验）乳胶凝集试验乳胶凝集试验检测脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌等抗体检测脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌等抗体沉淀试验沉淀试验梅毒（梅毒（VDRLVDRL、RPRRPR试验）试验）补体结合试验补体结合试验检测检测Q Q热柯克斯体等抗体热柯克斯体等抗体中和试验中和试验风湿热（抗风湿热（抗O O试验）试验）ELISAELISA广泛用于病原体的诊断和流行病学调查广泛用于病原体的诊断和流行病学调查玻片凝集试验玻片凝集试验试管凝集试验试管凝集试验酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验细菌的快速鉴定API细菌数值鉴定系统细菌数值鉴定系统PCR技术19姬姆萨染色衣原体包涵体HSV病毒被支原体感染
7、的精子梅毒螺旋体20 检测程序病毒感染的微生物学检查法Diagnosis Strategy for Viral Infection 23病毒感染的微生物学检查法ELISA for HIV antibodyMicroplate ELISA for HIV antibody: coloured wells indicate reactivity病毒的数量与感染性测定蚀斑测定：准确滴定病毒感染性的方法蚀斑（Plaque）每个蚀斑是由一个有感染性病毒颗粒形成，称为蚀斑形成单位（Plaque forming unit，PFU）。病毒的感染量用PFU/ml表示50%感染量（ID50）或50%组织细胞感染量
8、（TCID50）不能准确地测定感染性病毒颗粒的数量乙型肝炎的病原学乙型肝炎的病原学诊断断 A病毒性肝炎病毒性肝炎Hepatitis Virus肠道传播肠道传播肠道外传播肠道外传播F, TTVF, TTV? ? 其他其他ENANBNANBBDC病毒性肝炎病毒性肝炎- 背景背景 传染源粪便血液/血源性物质/体液血液/血源性物质/体液血液/血源性物质/体液粪便传播途径粪-口经皮肤/经粘膜经皮肤/经粘膜经皮肤/经粘膜粪-口慢性感染否是是是否病毒性肝炎类型病毒性肝炎类型ABCDE基因组类型 ssRNA dsDNA ssRNA ssRNA ssRNAHepatitis B Virus乙型肝炎的病原体乙型肝
9、炎的病原体在全世界广泛流行，估计全球半数以上人在全世界广泛流行，估计全球半数以上人口已被口已被HBVHBV感染过，感染过，5%5%的人口为的人口为HBVHBV慢性感慢性感染染中国：乙肝高发区，人群中国：乙肝高发区，人群HBsAgHBsAg的检出率达的检出率达9.8%9.8%HBV virionThe infectious virion is called the DANE particle.HBV Viral Genome OrganizationHBsAgHBcAgHBeAg3200 Base Pair GenomeHepatocyte receptor bindng siteHBV DNA
10、 PolymeraseProtein that transactivates transcriptional promotorsBoth comprised of HBsAgHBV nomenclatureHBV: hepatitis B virusHBsAg: hepatitis B virus surface antigenHBsAb: hepatitis B virus surface antibodyHBcAg: hepatitis B virus core antigenHBcAb: hepatitis B virus core antibodyHBeAg: hepatitis B
11、virus e antigenHBeAb: hepatitis B virus e antibody抗原抗原组成成-HBsAg位于病毒表面，是一种糖蛋白位于病毒表面，是一种糖蛋白4种亚型种亚型(adr,adw,ayr,ayw)欧美国家欧美国家: adw我国汉族我国汉族: adr我国少数民族我国少数民族: ayw判断判断HBV感染的指标之一感染的指标之一刺激机体产生保护性抗体即抗刺激机体产生保护性抗体即抗-HBs抗原抗原组成成- - HBcAg位于位于Dane颗粒核心部分和肝细胞核内，在颗粒核心部分和肝细胞核内，在血清中不易检出游离的血清中不易检出游离的HBcAg主要成分是蛋白质主要成分是蛋白质
12、刺激机体产生抗刺激机体产生抗-HBc(非保护性抗体非保护性抗体)在乙肝急性期、恢复期和在乙肝急性期、恢复期和HBsAg携带者中携带者中常可检出抗常可检出抗-HBc抗抗-HBc IgM常提示病毒处于复制状态常提示病毒处于复制状态抗原抗原组成成- - HBeAg位于位于HBVHBV的核心的核心, ,是一种可溶性蛋白抗原是一种可溶性蛋白抗原HBeAgHBeAg和和DaneDane颗粒出现相平行，且与颗粒出现相平行，且与DNADNA多聚酶在血中的消多聚酶在血中的消长动态相符合长动态相符合血中血中HBeAgHBeAg的出现可作为的出现可作为HBVHBV复制及血清有感染性的指标复制及血清有感染性的指标刺激
13、机体产生抗刺激机体产生抗- -HBeHBe抗抗- -HBeHBe能与受染肝细胞表面的能与受染肝细胞表面的e e抗原结合抗原结合, ,通过补体介导破通过补体介导破坏受染的肝细胞坏受染的肝细胞, ,抗抗- -HBeHBe的出现是预后良好的征象的出现是预后良好的征象抗原抗原组成成- Pre-S- Pre-S抗原抗原位于位于HBV的外衣壳上，有两种的外衣壳上，有两种刺激机体产生抗刺激机体产生抗Pre-S1和抗和抗Pre-S2，能阻断能阻断HBV与与肝细胞受体结合，从而起到抵抗病毒的作用肝细胞受体结合，从而起到抵抗病毒的作用抗抗Pre-S1和抗和抗Pre-S2的出现，表示病情好转，趋向的出现，表示病情好
14、转，趋向痊愈痊愈传染源染源患者患者潜伏期潜伏期急性期急性期慢性期慢性期无症状无症状HBsAg携携带者者 各种体液中各种体液中HBV的浓度的浓度高高中等中等低低/ /不能检出不能检出血液精液尿血清阴道分泌物粪便伤口渗出物唾液汗液泪液乳汁血源性传播输血、注射、外科和牙科手术、针刺等剃刀、牙刷和蚊虫叮咬等母婴垂直传播宫内传播分娩时微小皮损处传播产后母婴密切接触性传播HBV 传播途径传播途径高高 (8%): (8%): 占占45%45%一生感染的危险一生感染的危险 60% 60%婴幼儿感染常见婴幼儿感染常见中等中等 (2% (2%7%): 7%): 占占43% 43% 一生感染的危险是一生感染的危险是
15、 20% 20%60%60%感染存在于所有年龄组感染存在于所有年龄组低低 (2%): (2%): 占占12%12%一生感染的危险一生感染的危险 20% 20%许多感染发生在成人危险组许多感染发生在成人危险组Global Patterns of Chronic HBV Infection病原学诊断病原学诊断- -抗原抗体检测抗原抗体检测l项目：项目：HBsAg、抗抗-HBs、HBeAg、抗抗-HBe、抗抗-HBc以及以及抗抗-HBc IgMl方法方法ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay，最常用，定性最常用，定性)发光免疫分析发光免疫分析(定量定量)反相间
16、接血凝试验反相间接血凝试验(少用少用)ELISA的基本原理的基本原理利用抗原和抗体特异性结合利用抗原和抗体特异性结合主要的试剂主要的试剂固相抗原或抗体固相抗原或抗体酶标记的抗原或抗体酶标记的抗原或抗体酶的底物酶的底物ELISA的主要方法的主要方法间接法间接法: 测定抗测定抗-HBs夹心法：测定夹心法：测定HBsAg和和HBeAg竞争法：测定抗竞争法：测定抗-HBc中和法：测定抗中和法：测定抗-HBe捕捉法：测定抗捕捉法：测定抗-HBc IgM病原学诊断病原学诊断( (二二) )-核酸检测核酸检测核酸杂交核酸杂交探针探针PCRPCR引物引物HBsAg 感染的标志感染的标志Anti-HBs 既往感
17、染既往感染/接种疫苗接种疫苗Anti-HBc IgM 急性感染标志急性感染标志Anti-HBc IgG 既往或慢性感染既往或慢性感染HBeAg 急性病毒复制，有传染性急性病毒复制，有传染性 Anti-HBe 病毒不再复制病毒不再复制HBV-DNA 急急性性病病毒毒复复制制，比比HBeAg更更准准确确；主要用于监测治疗反应主要用于监测治疗反应血清学血清学检测的的临床意床意义HBsAg 抗抗-HBs HBeAg 抗抗-HBe 抗抗-HBc 临床意床意义急性或慢性感染急性或慢性感染(大三阳大三阳)+-+-+乙肝后期或慢性感染乙肝后期或慢性感染(小三阳小三阳)-+-潜伏期或急性乙肝早期潜伏期或急性乙肝
18、早期-+痊愈或恢复期痊愈或恢复期,有免疫力有免疫力-+-痊愈痊愈,有免疫力有免疫力疫苗接种或曾经感染过疫苗接种或曾经感染过,有免疫力有免疫力SymptomsHBeAganti-HBeTotal anti-HBcIgM anti-HBcanti-HBsHBsAg0481216202428323652100Acute HBV Infection with RecoveryTypical Serologic CourseWeeks after ExposureTitreIgM anti-HBcTotal anti-HBcHBsAgAcute(6 months)HBeAgChronic(Years)a
19、nti-HBe048 12 16 20 24 28 32 3652YearsWeeks after ExposureTitreProgression to Chronic HBV InfectionTypical Serologic Course52真菌感染检查检验特点形态学检查为检测真菌的重要手段抗原检测适合血清和脑脊液中隐球菌、念珠菌、夹膜组织胞浆菌。血清学诊断适用于深部真菌感染。53菌丝、孢子小结细菌感染的微生物学检查法病原体检查 核酸的检测 抗原、抗体的检测病毒感染的微生物学检查法电镜及免疫电镜 病毒的分离培养和鉴定 核酸的检测 抗原、抗体的检测真菌感染的微生物学检查法直接镜检 真菌的分离培养
