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1、 第一节第一节 核酸的概念和化学组成核酸的概念和化学组成 第二节第二节 核酸的分子结构核酸的分子结构 第三节第三节 核酸的理化性质核酸的理化性质 第四节第四节 核酸的分离与含量测定核酸的分离与含量测定第五章第五章 核酸的化学核酸的化学核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University核酸核酸( (Nucleic Acid) )是一类重要的含磷是一类重要的含磷酸基团的生物大分子酸基团的生物大分子, ,担负着生命信息的担负着生命信息的储存与传递储存与传递. .核酸是现代生物化学、分子生物学的重核酸是现代生物化学、分子生物学的重要研究领域要研究领域, ,是
2、基因工程操作的核心分子是基因工程操作的核心分子. .第一节第一节 核酸的概念和化学组成核酸的概念和化学组成核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University核酸与医药核酸与医药1 1）抗癌药物）抗癌药物. .如如5 5氟尿嘧啶氟尿嘧啶,6,6巯基嘌呤巯基嘌呤. .2 2）基因工程药物）基因工程药物, ,如胰岛素如胰岛素, ,白介素白介素. .3 3）基因治疗）基因治疗. .核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University一一 核酸的研究历史核酸的研究历史1.1.核酸的研究历史核酸的研究历史18681868
3、18681868年瑞士的年瑞士的MiescherMiescher测定淋巴细胞蛋白质组成测定淋巴细胞蛋白质组成时时, ,发现了不溶于稀酸和盐溶液的沉淀物发现了不溶于稀酸和盐溶液的沉淀物, ,所有细所有细胞的核里都含有此物质胞的核里都含有此物质, ,命名核素命名核素( (Nuclein););1879187918791879年年KosselKossel经过经过1010年的努力年的努力, ,搞清楚核质中有搞清楚核质中有 四种不同的组成部分四种不同的组成部分: :A A, ,T T, ,C C, ,G G; ;1889188918891889年年AltmanAltman制备了核酸并制备了核酸并建议将核
4、素改名为建议将核素改名为“核酸核酸”,”,并且已经认识到并且已经认识到“核质核质”乃乃“核酸核酸”与与蛋白质的复合体蛋白质的复合体; ;核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University19441944年年AveryAvery的的细菌转化细菌转化实验证明实验证明DNADNA是遗传物质是遗传物质1950195019501950年年ChargaffChargaff和和HotchkissHotchkiss采用纸层析法分析采用纸层析法分析DNADNA的组成的组成, ,得知得知A=TA=T, ,G=CG=C, , A+G=C+T A+G=C+T19531953
5、19531953年年Watson,CrickWatson,Crick根据根据DNADNA的的X X射线图谱的研究结射线图谱的研究结果果, ,提出了提出了DNADNA的双螺旋模型的双螺旋模型(Double helix)(Double helix)1970197019701970年发现第一个年发现第一个DNADNA限制性内切酶限制性内切酶19811981年年 GilbertGilbert和和SangerSanger建建立立DNADNA测序方法测序方法19851985年年 MullisMullis发明发明PCRPCR技术技术1990199019901990年开始实施人类基因组计划年开始实施人类基因组
6、计划; ;20032003年人类基因组计划宣告完成测序任务年人类基因组计划宣告完成测序任务核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University2. DNA2. DNA是主要的遗传物质是主要的遗传物质v19281928年年, ,英国细菌学家英国细菌学家Griffith发现肺炎球菌发现肺炎球菌: : S S型型: :有荚膜有荚膜, ,菌落光滑菌落光滑, ,使小鼠死亡使小鼠死亡 R R型型: :没有荚膜没有荚膜, ,菌落表面粗糙菌落表面粗糙, ,无致死作用无致死作用 v美国微生物学家美国微生物学家AveryAvery做了著名的肺炎球菌做了著名的肺炎球菌转化实
7、验转化实验. .核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University19281928年年GriffithGriffith的细菌转化实验的细菌转化实验结论：加热杀死的结论：加热杀死的S S型肺炎球菌里一定有某种特殊的生物分型肺炎球菌里一定有某种特殊的生物分子子, ,可使无害的可使无害的R R型转化为有害的型转化为有害的S S型型. .R型型+灭活的灭活的S S型型灭活的灭活的S S型型 S S型型 R R型型可分离可分离到到S型型细菌细菌核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University DNADNA转化试验：
8、转化试验： Avery Avery从加热杀死的从加热杀死的S S型肺炎球菌中分离各种型肺炎球菌中分离各种生物化学成分生物化学成分, ,分别加入到无害的分别加入到无害的R R型菌中型菌中. . 结果：结果：只有核酸可以使只有核酸可以使R R型转化为型转化为S S型型. . DNADNA转化：转化：一种细菌的遗传性状因吸收了另一一种细菌的遗传性状因吸收了另一种细菌的种细菌的DNADNA而发生改变的现象而发生改变的现象. . 1944 1944年年,Avery,Avery提出提出DNADNA是生命的遗传物质是生命的遗传物质, ,蛋蛋白质不是生命的遗传物质白质不是生命的遗传物质. .核酸的化学核酸的化
9、学 School Pharmacy of Yantai University噬菌体试验噬菌体试验进一步证明进一步证明DNADNA是遗传物质是遗传物质. .病毒仅含少量的病毒仅含少量的DNA(DNA(或或RNA)RNA)被一层蛋白质的外壳包裹被一层蛋白质的外壳包裹. .专门感染细菌的病毒称为专门感染细菌的病毒称为噬菌体（噬菌体（bacteriophagebacteriophage）. .19521952年年,Hershey,Hershey和和ChaseChase的噬菌体实验的噬菌体实验证明：在病毒繁殖时证明：在病毒繁殖时DNADNA能复制并且控制能复制并且控制新蛋白质外壳的合成新蛋白质外壳的合成
10、. .核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University3.3.核酸的种类和分布核酸的种类和分布核酸分为两大类：核酸分为两大类：脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸 Deoxyribonucleic Acid，DNA核糖核酸核糖核酸 Ribonucleic Acid，RNA RNARNA主要存在于细胞质中主要存在于细胞质中, ,有有3 3类类tRNA,rRNA,mRNAtRNA,rRNA,mRNA核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University二二核酸的基本结构单位核酸的基本结构单位-核苷酸核苷酸（一）核苷和核苷酸（
11、一）核苷和核苷酸核酸可以水解成核苷酸核酸可以水解成核苷酸, ,核苷酸可以继续水解成磷酸核苷酸可以继续水解成磷酸和核苷和核苷, ,核苷可以水解成戊糖和碱基核苷可以水解成戊糖和碱基, ,碱基可以分成多碱基可以分成多种类型种类型核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University一些合成的嘌呤和嘧一些合成的嘌呤和嘧啶具有临床应用价值，啶具有临床应用价值，它们可以取代某些酶它们可以取代某些酶活性部位中的天然嘧活性部位中的天然嘧啶和嘌呤底物。例如啶和嘌呤底物。例如5-5-氟尿嘧啶和氟尿嘧啶和6-6-巯基巯基嘌呤就常用于治疗某嘌呤就常用于治疗某些类型的癌症。些类型
12、的癌症。核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University 核酸中也存在一些不常见的稀有碱基核酸中也存在一些不常见的稀有碱基. .稀有碱基稀有碱基 的种类很多的种类很多, ,大部分是上述碱基的甲基化产物大部分是上述碱基的甲基化产物: :核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University核苷核苷: :由戊糖和碱基以由戊糖和碱基以C-NC-N糖苷键连接而成糖苷键连接而成糖都是通过糖的异头碳和糖都是通过糖的异头碳和嘧啶的嘧啶的N-1N-1或或嘌嘌呤的呤的N-9N-9之间形成的之间形成的N-N-糖苷键与碱基连接糖苷
13、键与碱基连接核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University核苷酸核苷酸: :核苷核苷+ +磷酸磷酸核苷一磷酸可以进一步磷酸化核苷一磷酸可以进一步磷酸化, ,形成核苷二磷酸和核苷三磷酸形成核苷二磷酸和核苷三磷酸核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University核苷酸的命名核苷酸的命名: :含一个磷酸基团：核苷一磷酸（含一个磷酸基团：核苷一磷酸（NMPNMP）含两个磷酸基团：核苷二磷酸（含两个磷酸基团：核苷二磷酸（NDPNDP）含三个磷酸基团：核苷三磷酸（含三个磷酸基团：核苷三磷酸（NTPNTP）N N 代
14、表各种碱基的名称代表各种碱基的名称核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University （二）环化核苷酸（二）环化核苷酸 细胞信号转导途径中的第二信使分子细胞信号转导途径中的第二信使分子核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University（三）辅酶类核苷酸：（三）辅酶类核苷酸：1.1.辅酶辅酶I(CoI,NADI(CoI,NAD）和辅酶）和辅酶II(CoII,NADP)II(CoII,NADP) 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（磷酸）烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（磷酸） 在生物氧化过程中起到在生物氧化过程中起到传递传递H H的作
15、用的作用. .核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University2.2.黄素腺嘌呤二核苷酸黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)(FAD)在生物氧化过程中起到在生物氧化过程中起到传递传递H H的作用的作用核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University3.3.辅酶辅酶A A（CoA CoA-SHCoA CoA-SH）参与糖、脂、蛋白质的代谢过程参与糖、脂、蛋白质的代谢过程, ,尤其在脂肪代谢过程中尤其在脂肪代谢过程中起重要作用起重要作用BACK核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai
16、 University第二节第二节 核酸的分子结构核酸的分子结构 一一.DNA.DNA的分子结构的分子结构 （一）（一）DNADNA的一级结构的一级结构: : 多聚核苷酸是通过一个多聚核苷酸是通过一个核苷酸的核苷酸的C C3 3-OH-OH与另一与另一分子核苷酸的分子核苷酸的5-5-磷酸基磷酸基团形成团形成3 3,5-,5-磷酸二酯磷酸二酯键键相连而成的链状聚合物相连而成的链状聚合物核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University5-5-磷酸端磷酸端（常用（常用5-P5-P表示）表示）3-3-羟基端羟基端（常用（常用3-OH3-OH表表示）示）多聚
17、核苷酸链具有多聚核苷酸链具有方向性方向性，表示一个多聚核苷酸链时表示一个多聚核苷酸链时, ,必须注明它的方向是必须注明它的方向是5353或是或是3535核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University核酸的一级结构：核酸的一级结构：DNADNA的一级结构是指的一级结构是指DNADNA分子中脱氧核分子中脱氧核苷酸的排列顺序苷酸的排列顺序( (碱基的排列顺序碱基的排列顺序).).DNA 5- ATGCATGC3DNA 5- ATGCATGC3 RNA: 5- AUGCAUGC3RNA: 5- AUGCAUGC3 3- TACGTACG33- TACGT
18、ACG3 核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University一）一）DNADNA与基因与基因基因基因(gene):(gene):是是DNADNA片段的核苷酸序列片段的核苷酸序列,DNA,DNA分子中分子中最小的功能单位最小的功能单位. .结构基因结构基因, ,调节基因调节基因. .基因组基因组(genome):(genome):某生物体所含全部遗传物质的总和某生物体所含全部遗传物质的总和. .核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University二）真核生物基因组特点二）真核生物基因组特点2.2.回文结构：顺读
19、到读序列一样回文结构：顺读到读序列一样核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University3.3.间隔顺序与插入顺序：间隔顺序与插入顺序：内含子内含子(intron):(intron):在真核生物细胞核中在真核生物细胞核中,DNA,DNA链上链上不能编码蛋白质的核苷酸片段不能编码蛋白质的核苷酸片段, ,原核生物无原核生物无. .外显子外显子(exon):(exon):DNADNA链上编码蛋白质的核苷酸片段链上编码蛋白质的核苷酸片段. .组蛋白基因组蛋白基因(histongene)和干扰素基因和干扰素基因(interferon gene)没有内没有内含子
20、含子核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University三）原核生物基因组特点三）原核生物基因组特点1 .1 .有基因重叠现象有基因重叠现象2.2.功能相关基因串联在一起功能相关基因串联在一起, ,并转录在同并转录在同一一mRNAmRNA中（多顺反子）中（多顺反子）3.3.没有内含子结构没有内含子结构, ,重复序列少重复序列少核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University（二）（二）DNADNA的二级结构的二级结构 DNADNA二级结构的二级结构的Watson-CrickWatson-Crick模型模型1
21、.1.提出提出DNADNA双螺旋结构模型的根据双螺旋结构模型的根据（1 1）x-x-光衍射分析光衍射分析. .WilkinsWilkins和和FranklinFranklin发现不同发现不同来源的来源的DNADNA具有相似的具有相似的X X射线衍射图谱射线衍射图谱, ,从衍从衍 射图推测出射图推测出DNADNA的结构是一个螺旋结构的结构是一个螺旋结构. .（2 2）DNADNA碱基组成的定量分析碱基组成的定量分析,20,20世纪世纪4040年代年代 chargaff chargaff规则：规则： DNA DNA碱基组成有种特异性碱基组成有种特异性, , 但无组织器官特异性但无组织器官特异性 A
22、=T; G=C; A+G=T+C A=T; G=C; A+G=T+C 核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University2.Watson-Crick2.Watson-Crick模型模型19531953年年,J.Watson,J.Watson和和F.CrickF.Crick提出了著名的提出了著名的DNADNA双螺旋结构双螺旋结构模型模型25岁岁35岁岁1962年沃森、克里克获得了诺贝尔医学和生理学奖年沃森、克里克获得了诺贝尔医学和生理学奖核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University2.0 nm小小沟沟大
23、大沟沟Watson-CrickWatson-Crick模型结构要点：模型结构要点：a a）由两条由两条反向平行反向平行的脱氧多核苷酸单链围绕一的脱氧多核苷酸单链围绕一中心轴（假想轴）构成中心轴（假想轴）构成右手右手双螺旋双螺旋结构结构. .两条链的走向两条链的走向为为5353和和35.35.双螺旋表双螺旋表面形成两种槽面形成两种槽: :大沟和小沟大沟和小沟. .核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai Universityb)b)磷酸基团与脱氧核糖在外侧磷酸基团与脱氧核糖在外侧, ,彼此间以磷酸二彼此间以磷酸二酯键相连酯键相连, ,构成的骨架构成的骨架. .碱基
24、在双螺旋碱基在双螺旋内侧内侧, ,双链中相对的碱基按双链中相对的碱基按- -和和- -通过通过氢键配对连接氢键配对连接, ,形成互补形成互补. .当知道其中一条链当知道其中一条链的顺序可推测出另一条链的顺序的顺序可推测出另一条链的顺序. .c)c)碱基平面与中心轴垂直碱基平面与中心轴垂直, ,各相邻平面部分重叠各相邻平面部分重叠. .糖环平面与中心轴平行糖环平面与中心轴平行. .d)d)双螺旋的直径为双螺旋的直径为2nm,2nm,沿轴向每个碱基平面的沿轴向每个碱基平面的距离为距离为0.34nm,0.34nm,每圈螺旋含有每圈螺旋含有1010对核苷酸对核苷酸，其，其轴向距为轴向距为3.4nm.3
25、.4nm.核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University3 DNA 3 DNA 双螺旋结构的稳定因素双螺旋结构的稳定因素主要靠三种作用力维持双螺旋的稳定：主要靠三种作用力维持双螺旋的稳定：a)a)互补碱基之间的氢键互补碱基之间的氢键. .b)b)碱基堆积力碱基堆积力. .分子中碱基的堆积可以使碱分子中碱基的堆积可以使碱基缔合基缔合. .双螺结构稳定的双螺结构稳定的主要作用力主要作用力. .c)c)离子键离子键. .磷酸基的负电荷与介质中的阳离子的正磷酸基
26、的负电荷与介质中的阳离子的正电荷之间形成的电荷之间形成的. .不同条件下不同条件下DNADNA形成的螺旋结构形成的螺旋结构不一样不一样核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University4 4 左手螺旋模型（左手螺旋模型（Z-DNA)Z-DNA) 19791979美麻省理工美麻省理工A.RichA.Rich研究人工合成研究人工合成DNA DNA d(Cpd(CpGpGpCpCpGpGpCpCpGp)Gp)提出提出. .但天然但天然DNADNA中也存在中也存在, ,可能可能与基因表达调控和疾病有关与基因表达调控和疾病有关核酸的化学核酸的化学 School
27、 Pharmacy of Yantai University （三）（三）DNADNA的三级结构的三级结构指双螺旋进一步扭曲形成的更高层次的空间结构指双螺旋进一步扭曲形成的更高层次的空间结构原核生物原核生物没有典型的细胞核结构没有典型的细胞核结构, ,超螺旋结超螺旋结构构被认为是原核生物的三级结构被认为是原核生物的三级结构真核生物真核生物与组蛋白和非组蛋白结合与组蛋白和非组蛋白结合组成核小体组成核小体. .核小体结构核小体结构被认为是真核生被认为是真核生物的三级结构物的三级结构核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai UniversityDNA 超超 螺螺 旋旋
28、 结结 构构核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai UniversityH2AH2A、H2BH2B、H3H3和和H4H4各两分子组成组蛋白八聚体，各两分子组成组蛋白八聚体，构成核心组蛋白构成核心组蛋白平均每平均每200bp200bp双螺旋双螺旋DNADNA以左手超螺旋的方式绕核以左手超螺旋的方式绕核心组蛋白表面心组蛋白表面1.751.75圈圈, ,构成核心颗粒构成核心颗粒核心颗粒和连接区核心颗粒和连接区DNADNA及附着在连接区及附着在连接区DNADNA上的组上的组蛋白蛋白H1H1构成构成核小体核小体核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of
29、Yantai University核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University二二 RNA RNA的种类和分子结构的种类和分子结构主要有三类：主要有三类：1. 1. 核糖体核糖体RNARNA (ribosomal RNA,rRNA) (ribosomal RNA,rRNA)2. 2. 信使信使RNARNA (messenger RNA,mRNA) (messenger RNA,mRNA)3. 3. 转运转运RNARNA (transfer RNA,tRNA) (transfer RNA,tRNA)RNARNA的结构基本单位的结构基本单位AMP
30、GMP CMP AMP GMP CMP UMPUMP核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University（一）信使（一）信使RNARNA（mRNAmRNA） 占细胞全部占细胞全部RNARNA的的3 35%5%，是遗传信息的携带，是遗传信息的携带者者, ,在细胞核中转录了在细胞核中转录了DNADNA上的遗传信息上的遗传信息, ,再进再进入细胞质入细胞质, ,作为蛋白质合成的模板作为蛋白质合成的模板. . mRNAmRNA分子量大小不一分子量大小不一, ,数量多数量多真核细胞中一般为单顺反子真核细胞中一般为单顺反子, ,一条一条mRNAmRNA编码一种蛋白
31、编码一种蛋白原核细胞中一般为多顺反子原核细胞中一般为多顺反子, ,一条一条mRNAmRNA编码多种蛋白编码多种蛋白核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University 真核细胞真核细胞m RNAm RNA的结构特点：的结构特点：33末端有一段约末端有一段约200200个个bpbp的的poly Apoly A尾巴尾巴 (1) (1)免受核酸外切酶的作用免受核酸外切酶的作用 (2) (2)与翻译有关与翻译有关, ,没有没有polyApolyA翻译活性降低翻译活性降低 (3) (3)与与mRNAmRNA从细胞核转移到细胞质有关从细胞核转移到细胞质有关55末端
32、有末端有7-7-甲基鸟嘌呤核苷三磷酸甲基鸟嘌呤核苷三磷酸, ,称为帽称为帽子结构子结构(m7GpppNm)(m7GpppNm) (1) (1)防止防止mRNAmRNA被核酸酶降解被核酸酶降解 (2) (2)为为mRNAmRNA翻译活性所必需翻译活性所必需 (3) (3)与蛋白质合成的正确起始有关与蛋白质合成的正确起始有关核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University 核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University（二）转运（二）转运RNA(tRNA)RNA(tRNA)分子量最小一类分子量最小一类RN
33、A,RNA,占细胞全部占细胞全部RNARNA的的15%,15%,在蛋在蛋白质的合成过程中作为各种氨基酸的载体并将其白质的合成过程中作为各种氨基酸的载体并将其转呈给转呈给mRNA.mRNA.（1 1）tRNAtRNA由由7070 9090个核苷酸组成个核苷酸组成, ,末端为末端为- -CCACCA-OH.-OH. 每种氨基酸都有相应的每种氨基酸都有相应的tRNAtRNA（2 2）tRNAtRNA二级结构：呈二级结构：呈三叶草式三叶草式, ,由氨基酸臂、由氨基酸臂、 二氢尿咪啶环、反密码环和额外环组成二氢尿咪啶环、反密码环和额外环组成（3 3）tRNAtRNA三级结构：呈三级结构：呈倒写倒写L L
34、形形结构结构, ,由氨基酸臂由氨基酸臂 和和T TC C环组成环组成L L的一横的一横, ,二氢尿咪啶环、反密二氢尿咪啶环、反密 码环和额外环组成码环和额外环组成L L的一竖的一竖. .核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University特点：特点：1.1.四臂四环四臂四环2.2.氨基酸臂氨基酸臂33端有端有CCA-OHCCA-OH的共有结构的共有结构3.D3.D环上有二氢尿嘧啶（环上有二氢尿嘧啶（D D）4.4.反密码环上的反密码子与反密码环上的反密码子与mRNAmRNA相互作用相互作用5.5.可变环上的核苷酸数目可以变动可变环上的核苷酸数目可以变动
35、6.T6.TC C环含有环含有T T和和( (假尿嘧啶）假尿嘧啶）7.7.含有修饰碱基含有修饰碱基 tRNA的二级结构的二级结构核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University tRNAtRNA的三级结构的三级结构核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University（三）核糖体（三）核糖体RNARNA占细胞占细胞RNARNA总量的总量的80%,80%,与蛋白质共同组成核糖体，与蛋白质共同组成核糖体，核糖体是进行核糖体是进行蛋白质生物合成蛋白质生物合成的场所的场所. .核酸的化学核酸的化学 School Ph
36、armacy of Yantai University 5S rRNA5S rRNA与与tRNAtRNA二级结构相似呈三叶草结构二级结构相似呈三叶草结构. .其其它它rRNA,rRNA,尤其大的尤其大的rRNArRNA分子分子, ,存在许多双螺旋区存在许多双螺旋区和突环区组成的区域和突环区组成的区域. .16S rRNA核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University 9090年代初年代初,Rich Jorgensen,Rich Jorgensen设想设想, ,将更将更多的色素基因注入植物体多的色素基因注入植物体, ,能使花朵的能使花朵的色彩更艳丽
37、色彩更艳丽, ,而结果出其预料而结果出其预料, ,转基因转基因的植株不仅没有新基因表达的植株不仅没有新基因表达, ,反而使原反而使原有的色素基因也受到了抑制有的色素基因也受到了抑制, ,当时称共当时称共抑制抑制(cosuppression).(cosuppression).（四）（四）RNAiRNAi核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University19951995年年,Guo ,Guo S S和和kemphueskemphues等等试试图图阻阻断断秀秀丽丽新新小小杆线虫杆线虫(C.elegans)(C.elegans)中的中的par-1par-1基
38、因的表达基因的表达. .设计：设计： 反义反义RNARNA 特异性地阻断特异性地阻断par-1par-1基因的表达基因的表达 正义正义RNARNA 以期观察到基因表达的增强以期观察到基因表达的增强. .结果结果: : 二二者者都都同同样样切切断断了了par-1par-1基基因因的的表表达达途途径径. .这这与与传传统统上上对对反反义义RNARNA技技术术的的解解释释不不相相符符合合. .该该研研究究小组一直没能给这个意外以合理解释小组一直没能给这个意外以合理解释. . 核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai UniversityRNAiRNAi的提出的提出v1
39、9981998年年2 2月月, ,Fire AFire A和和Mello CMello C首次揭开这个悬疑首次揭开这个悬疑. .v单单链链RNARNA注注射射线线虫虫时时发发现现, ,基基因因抑抑制制效效应应十十分分微微弱弱; ;而双链而双链RNARNA却能高效特异性阻断相应基因的表达却能高效特异性阻断相应基因的表达. .v他他们们证证实实, ,GuoGuo S S遇遇到到的的正正义义RNARNA抑抑制制基基因因表表达达的的现现象象, ,以以及及过过去去的的反反义义RNARNA技技术术对对基基因因表表达达的的阻阻断断, ,都都是是由由于于体体外外转转录录所所得得RNARNA中中污污染染了了微微
40、量量双双链链RNARNA而而引引起起. .v该该 小小 组组 将将 这这 一一 现现 象象 称称 为为 RNARNA干干 扰扰 ( (RNA RNA interferenceinterference, , 简称简称RNAiRNAi) ) 核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University RNAiRNAi(RNA interference)(RNA interference)是与靶基是与靶基因序列同源的双链因序列同源的双链RNA(dsRNA)RNA(dsRNA)所诱所诱导的一种特异性基因沉默现象导的一种特异性基因沉默现象. .核酸的化学核酸的化学 S
41、chool Pharmacy of Yantai UniversityRNAiRNAi广泛存在于自然界广泛存在于自然界随后随后,RNAi,RNAi现象被广泛地发现于真菌、拟南现象被广泛地发现于真菌、拟南芥、水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数芥、水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中真核生物中. .随着研究的不断深入随着研究的不断深入,RNAi,RNAi的机制正在被逐的机制正在被逐步阐明步阐明, ,而同时作为功能基因组研究领域中而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具的有力工具,RNAi,RNAi也越来越为人们所重视也越来越为人们所重视. . 核酸的化学核酸的化学 School Pharmac
42、y of Yantai University 第一步第一步( (起始阶段起始阶段) )是较长是较长dsRNAdsRNA在在ATPATP参与下参与下被被RNaseRNase样的特异核酸酶切割加工成样的特异核酸酶切割加工成2123nt2123nt的由正义和反义链组成的小干扰的由正义和反义链组成的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)RNA(small interfering RNA,siRNA) 果蝇中的果蝇中的Rnase Rnase 样核酸酶称为样核酸酶称为DicerDicer RNAiRNAi作用的简单模型作用的简单模型核酸的化学核酸的化学 School Pha
43、rmacy of Yantai University第二步第二步( (效应阶段效应阶段) )是是siRNAsiRNA在在ATPATP参与下被参与下被RNARNA解旋酶解旋成单链解旋酶解旋成单链, ,并由其中反义链指导形并由其中反义链指导形成成RNARNA诱导的沉默复合体诱导的沉默复合体(RNA-induced (RNA-induced silencing complex,silencing complex,RISCRISC). ). RISCRISC由由siRNAsiRNA、解旋酶、解旋酶、ATPATP、核酸内切酶、核酸外、核酸内切酶、核酸外切酶等多种成分组成切酶等多种成分组成. .活化的活化
44、的RISCRISC在单链在单链siRNAsiRNA引导引导下识别互补的下识别互补的mRNA,mRNA,并在并在RISCRISC中的核酸内切酶作用下中的核酸内切酶作用下切割靶切割靶mRNA,mRNA,最后可能再被核酸外切酶进一步降解最后可能再被核酸外切酶进一步降解, ,从而干扰基因表达从而干扰基因表达.核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai UniversityRNAiRNAi的放大效应机制的放大效应机制 siRNA siRNA不仅可引导不仅可引导RISCRISC切割靶
45、切割靶RNA,RNA,而且可作而且可作为引物在为引物在RNARNA依赖的依赖的RNARNA聚合酶聚合酶(RdRP)(RdRP)作用作用下以靶下以靶mRNAmRNA为模板合成新的为模板合成新的dsRNA.dsRNA. 新合成的长链新合成的长链dsRNAdsRNA同样可被同样可被RNaseRNase样核样核酸酶切割、降解而生成大量的次级酸酶切割、降解而生成大量的次级siRNA.siRNA.次级次级siRNAsiRNA又可进入合成又可进入合成- -切割的循环过程切割的循环过程, ,进一步放大进一步放大RNAiRNAi作用作用. .核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yanta
46、i UniversityRNAi RNAi 的特点的特点u转录后水平的基因沉默转录后水平的基因沉默u较高特异性较高特异性：能够非常特异地降解与之序：能够非常特异地降解与之序列相应的单个内源基因的列相应的单个内源基因的mRNAmRNA. .u高效性高效性：相对少量：相对少量的的dsRNAdsRNA就可以使相应的就可以使相应的基因表达受抑制基因表达受抑制. .u可遗传性及远距离效应可遗传性及远距离效应：RNAiRNAi基因表达的基因表达的效应可以突破细胞的界限效应可以突破细胞的界限, ,可传递给子一代可传递给子一代. .核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai Un
47、iversity基因治疗基因治疗：RNAiRNAi作用的高度特异性可特异地作用的高度特异性可特异地抑制致病的突变等位基因抑制致病的突变等位基因, ,但又不影响正常但又不影响正常的等位基因的等位基因. .肿瘤的基因治疗肿瘤的基因治疗：肿瘤是基因相互作用的基：肿瘤是基因相互作用的基因网络调控异常的结果因网络调控异常的结果研究基因的功能研究基因的功能：由于：由于RNAiRNAi可以特异性抑制可以特异性抑制特定的基因特定的基因, ,获得功能丧失获得功能丧失, ,因此可用于功能因此可用于功能基因组的研究基因组的研究( (类似类似Gene knock out).Gene knock out).RNAiRN
48、Ai技术的应用技术的应用核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University防御病毒的感染防御病毒的感染：RNAiRNAi具有对抗侵入性遗传具有对抗侵入性遗传因子因子( (如病毒如病毒) )的作用、打破其复制循环、的作用、打破其复制循环、减弱或消除其毒性作用减弱或消除其毒性作用. . （五）微小（五）微小RNARNA（miRNAmiRNA） 19-25nt19-25nt的单链的单链RNA,RNA,本身不编码任何蛋白，本身不编码任何蛋白，分布广分布广, ,种类多种类多. .与靶与靶mRNAmRNA的的3UTR3UTR结合结合, ,阻阻止翻译进行止翻译进行
49、. . 核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University第三节第三节 核酸的理化性质核酸的理化性质一一 核酸的分子大小核酸的分子大小核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University二二 核酸的溶解度与粘度核酸的溶解度与粘度溶解度溶解度: :DNADNA和和RNARNA均不溶于一般的有机溶剂均不溶于一般的有机溶剂, ,微微溶于水溶于水, ,但它们的钠盐在水中溶解度较大但它们的钠盐在水中溶解度较大粘度：粘度：分子量越大粘度也越大分子量越大粘度也越大: :分子比分分子比分子小子小, ,粘度也就小粘度也就小,
50、,生物分子的空间结构也影响粘度生物分子的空间结构也影响粘度: : 线形分子线形分子 无规线团分子无规线团分子 球形分子球形分子核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University三三核酸的酸碱性核酸的酸碱性为为两性电解质两性电解质, ,由于核酸分子中的磷酸是一由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸个中等强度的酸, ,而碱性（氨基）是一个弱而碱性（氨基）是一个弱碱碱, ,所以核酸的等电点比较低所以核酸的等电点比较低. .如如DNADNA的等电的等电点为点为4 44.5,RNA4.5,RNA的等电点为的等电点为2 22.52.5RNARNA的等电点比的等电
51、点比DNADNA低的原因低的原因:RNA:RNA分子中核分子中核糖基糖基2-OH2-OH通过氢键促进了磷酸基上质子通过氢键促进了磷酸基上质子的解离的解离. DNA. DNA没有这种作用没有这种作用. .室温条件下室温条件下,DNA,DNA在碱中变性但不水解在碱中变性但不水解,RNA,RNA水解水解核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University四四 核酸的紫外吸收核酸的紫外吸收嘌呤碱和嘧啶碱有共轭双键嘌呤碱和嘧啶碱有共轭双键, ,都能强烈吸收紫外都能强烈吸收紫外光光, ,最大吸收波长为最大吸收波长为260nm260nm核酸的化学核酸的化学 Scho
52、ol Pharmacy of Yantai University1.1.紫外分光光度法检测核酸的纯度紫外分光光度法检测核酸的纯度方法：通过测定波长在方法：通过测定波长在260nm260nm和和280nm280nm处吸光度的比处吸光度的比值值(A260(A260A280)A280)来估计核酸样品的纯度来估计核酸样品的纯度 DNADNA溶液：溶液：A260A260A280=1.8 A280=1.8 RNA RNA溶液：溶液：A260A260A280=2.0A280=2.0若样品中含有杂蛋白或苯酚若样品中含有杂蛋白或苯酚, ,则则A260/A280A260/A280比值明显降低比值明显降低核酸的化学
53、核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University2 2摩尔磷消光系数（摩尔磷消光系数（molar absorptivitymolar absorptivity）法）法一般天然一般天然DNA(P)DNA(P)为为6600,RNA6600,RNA为为7700770078007800增色效应增色效应: :当核酸变性或降解时光吸收值显著增加当核酸变性或降解时光吸收值显著增加减色效应减色效应: :核酸复性后核酸复性后, ,光吸收值又回复到原有水平光吸收值又回复到原有水平核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University五五核
54、酸的变性核酸的变性. .复性和杂交复性和杂交1.DNA1.DNA的变性的变性( (denaturationdenaturation):):在某些理化因素作用在某些理化因素作用下下,DNA,DNA分子内碱基对之间的氢键断裂分子内碱基对之间的氢键断裂, ,使规则有序的使规则有序的双螺旋结构变为不规则无序的单链线团样结构的过程双螺旋结构变为不规则无序的单链线团样结构的过程. .核酸一级结构核酸一级结构( (碱基顺序碱基顺序) )保持不变保持不变. .变性特征：变性特征：生物活性部分丧失、粘度下降、生物活性部分丧失、粘度下降、浮力密度升高、浮力密度升高、紫外吸收增加（增色效应）紫外吸收增加（增色效应）
55、变性因素变性因素: :加热加热pHpH（11.311.3或或5.05.0）变性剂（脲、甲酰胺、甲醛）变性剂（脲、甲酰胺、甲醛）核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University解链温度（解链温度（TmTm）: :使使50%50%的的DNADNA发生变性时的环境发生变性时的环境温度温度. .简单常用的计算方法：简单常用的计算方法： TmTm值值4*(G4*(GC)C)2*(A2*(AT)T) 如：如：ATGGTACATGACCTAGCTAAGCATGGTACATGACCTAGCTAAGC 其其Tm=4*10+2*12=64Tm=4*10+2*12=64
56、核酸的化学TmTm值的大小主要与下列因素有关值的大小主要与下列因素有关(1) DNA(1) DNA的均一性的均一性(2) G-C(2) G-C的相对含量的相对含量: : (G+C)%=(Tm-69.3)2.44 (G+C)%=(Tm-69.3)2.44(3)(3)介质离子强度低介质离子强度低,Tm,Tm低低. .(4)(4)高高pHpH下碱基去质子而丧失形成氢键的能力下碱基去质子而丧失形成氢键的能力(5)(5)变性剂如甲酰胺、尿素、甲醛等破坏氢键变性剂如甲酰胺、尿素、甲醛等破坏氢键, ,妨碍碱基堆积妨碍碱基堆积, ,使使TmTm下降下降核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of
57、 Yantai University2.DNA2.DNA的复性（的复性（renaturationrenaturation) )：在适当条件下在适当条件下, ,变性变性DNADNA的两条互补链再恢复成天然的双螺旋结构的过程的两条互补链再恢复成天然的双螺旋结构的过程. .影响复性的因素影响复性的因素: :温度温度 低于低于TmTm值值25 25 最佳最佳序列简单的分子复性快序列简单的分子复性快, ,如如poly(dT)poly(dT)和和poly(dA)poly(dA)DNADNA片段愈大片段愈大, ,扩散速度愈低扩散速度愈低, ,复性慢复性慢离子强度离子强度有利于复性有利于复性DNADNA浓度浓
58、度复性复性核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University3.3.核酸分子杂交（核酸分子杂交（hybridiazationhybridiazation）：）：来来源不同的两条单链核酸分子通过碱基互源不同的两条单链核酸分子通过碱基互补配对形成异源双链的过程补配对形成异源双链的过程. .核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University核酸分子杂交技术：核酸分子杂交技术：用标记的核酸探针用标记的核酸探针( (已已知序列知序列) )检测样品中未知的核酸序列的方法检测样品中未知的核酸序列的方法核酸的化学核酸的化学
59、 School Pharmacy of Yantai University探针探针: :放射性同位素或荧光标记的放射性同位素或荧光标记的DNADNA或或RNARNA片段片段 核酸分子杂交的应用：核酸分子杂交的应用：研究研究DNADNA分子中某一种基因的位置分子中某一种基因的位置确定两种核酸分子间的序列相似性确定两种核酸分子间的序列相似性检测某些专一序列在待检样品中存在与否检测某些专一序列在待检样品中存在与否是基因芯片技术的基础是基因芯片技术的基础 核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University常用的标记物：常用的标记物：（一）（一）放射性标记物放
60、射性标记物： 3232P P、3 3H H、3535S S、1414C C、125125I I、131131I I特性：特性：检测特异性强，灵敏度高检测特异性强，灵敏度高不影响碱基配对的特异性和稳定性不影响碱基配对的特异性和稳定性易造成放射性污染易造成放射性污染半衰期短，不能长时间存放半衰期短，不能长时间存放检测：检测：放射自显影检测杂交信号放射自显影检测杂交信号 放射线可以在放射线可以在X X射线片上成影射线片上成影核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University（二）非放射性标记物（二）非放射性标记物常用的标记物常用的标记物：生物素（：生物素（
61、biotinbiotin） 地高辛（地高辛（digoxigenindigoxigenin） 光生物素（光生物素（photobiotinphotobiotin） 优点：无环境污染，可较长时间贮存优点：无环境污染，可较长时间贮存 缺点：灵敏度较放射性探针差缺点：灵敏度较放射性探针差核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University非放射性探针检测方法：非放射性探针检测方法：不能直接检测，分两步：偶联反应和显色反应不能直接检测，分两步：偶联反应和显色反应偶联反应：利用抗原抗体反应偶联反应：利用抗原抗体反应核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy
62、 of Yantai University核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术一、类型：根据反应环境分为一、类型：根据反应环境分为1.1.固相杂交固相杂交：将需要杂交的一条核酸链先：将需要杂交的一条核酸链先 固定在固固定在固体支持物上，另一条核酸链游离在液体中。体支持物上，另一条核酸链游离在液体中。 固体支持物种类：固体支持物种类：硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜、尼龙膜、乳胶颗粒、尼龙膜、乳胶颗粒、 磁珠、微孔板等磁珠、微孔板等2.2.液相杂交：参与反应的两条核酸链都游离在液体中液相杂交：参与反应的两条核酸链都游离在液体中核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai Univ
63、ersitySouthernSouthern印迹法印迹法：将电泳分离后的：将电泳分离后的DNADNA片段片段从从凝胶转移到硝酸纤维素膜上凝胶转移到硝酸纤维素膜上, ,再进行杂交再进行杂交. . -1975 -1975年英国年英国E M SouthernE M Southern首创首创NorthernNorthern印迹法印迹法：将电泳分离后的：将电泳分离后的RNARNA吸印到吸印到纤维素膜上再进行分子杂交纤维素膜上再进行分子杂交. . -1977 -1977年年G.K.StarkG.K.Stark首创首创核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai Universi
64、ty二二.常用固相杂交类型常用固相杂交类型核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University附：蛋白质的免疫印迹技术（附：蛋白质的免疫印迹技术（western)western)待检分子：待检分子：蛋白蛋白杂交的方式：经电泳分离不同的蛋白，转杂交的方式：经电泳分离不同的蛋白，转印到硝酸纤维素膜上，用特定的抗体与印到硝酸纤维素膜上，用特定的抗体与蛋白杂交，检测特定的蛋白蛋白杂交，检测特定的蛋白所用抗体：所用抗体：1 1、一抗：针对待测分子的抗体、一抗：针对待测分
65、子的抗体2 2、二抗：针对一抗的抗体，标记有放射性、二抗：针对一抗的抗体，标记有放射性同位素或生物素同位素或生物素核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University第四节第四节 核酸的分离与含量测定核酸的分离与含量测定一一. .核酸的提取、分离和纯化核酸的提取、分离和纯化（一）核酸的分离、提取通则（一）核酸的分离、提取通则为了得到完整的大分子核酸为了得到完整的大分子核酸, ,一般要注意一般要注意3 3点点: :1 1保持低温（保持低温（0 044） 2 2防
66、止过酸、过碱，避免剧烈搅拌防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌 3 3防止核酸酶的作用防止核酸酶的作用核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University抑制抑制DNaseDNase： 可加柠檬酸钠、可加柠檬酸钠、EDTAEDTA等金属螯合剂；或加去污剂等金属螯合剂；或加去污剂 十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（SDSSDS）；或加蛋白变性剂）；或加蛋白变性剂抑制抑制RNaseRNase： （1 1）实验器皿高温）实验器皿高温, ,或高压灭菌或高压灭菌, ,不能高压灭菌的用不能高压灭菌的用 具用具用0.1%0.1%二乙基焦碳酸盐二乙基焦碳酸盐( (DEPC,di
67、ethyl pyrocarbonate) 处理处理. . （2 2）强的蛋白变性剂如硫氰酸胍、异硫氰酸胍等）强的蛋白变性剂如硫氰酸胍、异硫氰酸胍等 （3 3）核糖核酸酶阻抑蛋白）核糖核酸酶阻抑蛋白(RNasin)(RNasin)等等RNaseRNase的抑制剂的抑制剂 核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University二二. .核酸含量测定的原理核酸含量测定的原理（一）定磷法（一）定磷法RNARNA含含P P量为量为9.49.4；DNADNA含含P P量为量为9.99.9（二）定糖法（二）定糖法（三）紫外吸收法（三）紫外吸收法在波长在波长260nm2
68、60nm紫外线下紫外线下, ,吸光度为吸光度为1.001.00时时, ,相当于相当于 50g/mL 50g/mL的双链的双链DNA DNA 40g/mL 40g/mL的单链的单链DNADNA或或RNARNA 20g/mL 20g/mL的单链寡核苷酸的单链寡核苷酸核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University（三）凝胶电泳（三）凝胶电泳 核酸研究中最常用的方法核酸研究中最常用的方法 优点：简单、快速、灵敏、成本低优点：简单、快速、灵敏、成本低 通过凝胶电泳通过凝胶电泳: : （1 1）可进行核酸分离）可进行核酸分离, ,知道核酸的纯度知道核酸的纯度
69、. . （2 2）测定分子大小）测定分子大小. . （3 3）估计核酸的构象）估计核酸的构象. . 核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University凝胶电泳兼有分子筛效应和电荷效应凝胶电泳兼有分子筛效应和电荷效应 1 1琼脂糖凝胶电泳（琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis）琼脂糖凝胶电泳的迁移率主要与分子大小、琼脂糖凝胶电泳的迁移率主要与分子大小、胶浓度、核酸构象、电流等有关胶浓度、核酸构象、电流等有关. . 2 2聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳( (polyacrylamide gel electrophoresis） 用于分析用于分析RNARNA或或MrMr小于小于1000bp1000bp的的DNADNA片段片段 适用于大分子核酸适用于大分子核酸, ,一般用于一般用于DNADNA分析。分析。 BACK核酸的化学核酸的化学 School Pharmacy of Yantai University
