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1、 流流式式细细胞胞术术(flow (flow cytometry cytometry FCM)FCM)是是利利用用流流式式细细胞胞仪仪对对生生物物颗颗粒粒( (红红细细胞胞、白白细细胞胞、各各类类组组织织细细胞胞、血血小小板板、微微生生物物等等) )以以及及人人工工合合成成微微球球的的多多种种物物理理和和生生物物学学特特性性进进行行定定量量分分析析，并并能能对特定细胞群体加以分选的细胞参量分析技术。对特定细胞群体加以分选的细胞参量分析技术。流式细胞术的概念 FCM的工作原理的工作原理1. 1.液流系统：细胞悬液被吸入检测室后，在鞘液液流系统：细胞悬液被吸入检测室后，在鞘液液流系统：细胞悬液被吸
2、入检测室后，在鞘液液流系统：细胞悬液被吸入检测室后，在鞘液 (sheath)(sheath)的约束下，通过喷嘴，使其形成的约束下，通过喷嘴，使其形成的约束下，通过喷嘴，使其形成的约束下，通过喷嘴，使其形成单细胞悬液单细胞悬液单细胞悬液单细胞悬液。2. 2.光学系统：光学系统：光学系统：光学系统： 激光是较常用的光源激光是较常用的光源激光是较常用的光源激光是较常用的光源, , 稳定性好、单色性好。稳定性好、单色性好。稳定性好、单色性好。稳定性好、单色性好。 散射光和荧光信号被收集、处理、转化为数字信号。散射光和荧光信号被收集、处理、转化为数字信号。散射光和荧光信号被收集、处理、转化为数字信号。散
3、射光和荧光信号被收集、处理、转化为数字信号。3. 3.数据处理系统：对实验数据分析、存储、显示。数据处理系统：对实验数据分析、存储、显示。数据处理系统：对实验数据分析、存储、显示。数据处理系统：对实验数据分析、存储、显示。具有智能化、自动化特点。具有智能化、自动化特点。具有智能化、自动化特点。具有智能化、自动化特点。Flow CellInjector TipFluorescenceFluorescencesignalssignalsFocused laserFocused laserbeambeamSheath fluidFCM检测信号l散射光信号 前向散射光（foword scatter,
4、FS）：在激光束正前方的检测器，用于检测细胞或其他粒子物体的表面属性，如大小、形状等。 侧向散射光（side scatter， SS）：与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器，主要用于检测细胞内部结构属性，可获得细胞内超微结构和颗粒性质的参数。l荧光信号FCM检测信号l散射光信号 前向散射光（foword scatter, FS）：在激光束正前方的检测器，用于检测细胞或其他粒子物体的表面属性，如大小、形状等。 侧向散射光（side scatter， SS）：与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器，主要用于检测细胞内部结构属性，可获得细胞内超微结构和颗粒性质的参数。l荧光信号荧光信号l每种荧光染料都
5、有特定的激发波长和发射波长，流式细胞仪利用不同波长的光学滤片来检测这些特定发射波长的光学信号。l 长通滤片允许长于设定波长的光通过 短通滤片允许短于设定波长的光通过 带通滤片允许一定带宽波长的光通过 二向色性滤片当以 45o 角放置滤片时,该滤片可以通过一定波长的光,同时也可以阻断并折射该波长以下的光 免疫荧光标记l直接免疫荧光染色法：选用单克隆荧光抗体是直接针对细胞表面抗原特异性标志的单一抗体,如抗CD3-FITC、CD4-PE、CD8-PeCy5。l间接免疫荧光染色法：选用特异性McAb与相应抗原结合后，再用荧光素标记的第二抗体进行染色。l双标记或多标记分析：目前使用的流式细胞仪能用一个激
6、光束检测三色甚至四色激发荧光信号。检测时需注意荧光补偿。常用免疫荧光染料组合 流式细胞仪的基本功能流式细胞仪的基本功能细胞表型分析细胞表型分析细胞表型分析细胞表型分析( (包括细胞膜、胞浆内蛋白包括细胞膜、胞浆内蛋白包括细胞膜、胞浆内蛋白包括细胞膜、胞浆内蛋白表达及核膜成份分析表达及核膜成份分析表达及核膜成份分析表达及核膜成份分析) ) cellular phenotypecellular phenotypeDNADNA含量及细胞周期分析含量及细胞周期分析含量及细胞周期分析含量及细胞周期分析DNA content analysisDNA content analysis细胞分选细胞分选细胞分选
7、细胞分选cell sortingcell sorting自自自自身身身身免免免免疫疫疫疫性性性性疾疾疾疾病病病病相相相相关关关关HLAHLA抗抗抗抗原原原原分分分分析析析析、自自自自身身身身抗抗抗抗体体体体的的的的检检检检测测测测：如如如如用用用用Hep-2Hep-2细细细细胞胞胞胞检检检检测测测测抗抗抗抗核核核核抗体。抗体。抗体。抗体。 临床免疫学临床免疫学临床免疫学临床免疫学 临床血液学临床血液学临床血液学临床血液学 临床肿瘤学临床肿瘤学临床肿瘤学临床肿瘤学 血栓与止血血栓与止血血栓与止血血栓与止血 骨髓和器官移植骨髓和器官移植骨髓和器官移植骨髓和器官移植 基础医学研究基础医学研究基础医学
8、研究基础医学研究流式细胞术的临床应用 FCM FCM FCM FCM在临床血液学中的应用在临床血液学中的应用在临床血液学中的应用在临床血液学中的应用1.1.1.1.白血病的白血病的白血病的白血病的MICMICMICMIC分型分型分型分型 MorphologyMorphologyMorphologyMorphology Immunology Immunology Immunology Immunology Cytogenetics Cytogenetics Cytogenetics Cytogenetics 白白白白血血血血病病病病分分分分型型型型是是是是选选选选择择择择化化化化疗疗疗疗方方方方
9、案案案案和和和和判判判判断断断断预预预预后后后后的的的的重重重重要要要要依依依依据据据据。白白白白血血血血病病病病免免免免疫疫疫疫分分分分型型型型是是是是MICMICMICMIC分分分分型型型型的的的的重重重重要要要要组组组组成成成成部部部部分分分分，也也也也是是是是对对对对FABFABFABFAB分分分分型型型型的的的的补补补补充充充充，对对对对白白白白血血血血病病病病的的的的诊诊诊诊断断断断、治治治治疗疗疗疗策策策策略略略略制制制制定定定定、预预预预后后后后判判判判断断断断及及及及对白血病发病机制的研究都具有重要作用。对白血病发病机制的研究都具有重要作用。对白血病发病机制的研究都具有重要作
10、用。对白血病发病机制的研究都具有重要作用。免疫分型的临床意义 弥补弥补FABFAB分型的不足分型的不足 诊断其他血液系统肿瘤诊断其他血液系统肿瘤 诊诊断断仅仅表表达达个个别别非非本本系系列列相相关关抗抗原原的的急急性性 白白血血病病（LYLY+ +AMLAML、MYMY+ +ALLALL） 急性双系或双表型白血病的诊断急性双系或双表型白血病的诊断 骨骨髓髓增增生生异异常常综综合合征征（MDSMDS）免免疫疫表表型型分分析析的的临临床床意义意义 免免疫疫分分型型对对鉴鉴别别慢慢性性淋淋巴巴细细胞胞增增生生性性疾疾病病各各亚亚型型亦亦有肯定的诊断价值有肯定的诊断价值白血病的多药耐药白血病的多药耐药
11、 (Multidurg (Multidurg Resistant MDR)Resistant MDR) 多药耐药的特点表现在细胞一旦产生对某多药耐药的特点表现在细胞一旦产生对某种药物的耐受性，同时对另外一些在结构和功种药物的耐受性，同时对另外一些在结构和功能上完全不同的药物也产生耐受性，这些能上完全不同的药物也产生耐受性，这些MDRMDR相关药物多为一些大分子的天然药物。相关药物多为一些大分子的天然药物。 FCMFCM检检测测白白血血病病细细胞胞多多药药耐耐药药(multidrug (multidrug resistannt,MDR)resistannt,MDR)基基因因编编码码的的糖糖蛋蛋白
12、白P- P- gpgp的临床意义的临床意义: 成人白血病成人白血病P-gpP-gp表达与预后的关系表达与预后的关系 成成人人ALL ALL P-gpP-gp表表达达与与形形态态学学、免免疫疫表表型型的关系的关系 AML P-gpAML P-gp表达与免疫分型的关系表达与免疫分型的关系FCMFCM检测白血病微小残留病变检测白血病微小残留病变(MRD):(MRD):急性白血病经治疗后达临床完全缓解，但此时体内仍残留106108白血病细胞，这些细胞是白血病复发的根源。检测骨髓或外周血细胞两种抗原的表达，如CD19/TdT, CD22/TdT, CD10/TdT, CD7/TdT, CD5/TdT,
13、CD13/TdT, CD33/TdT CD34/TdT。 FCM FCM在血栓与止血中的应用在血栓与止血中的应用在血栓与止血中的应用在血栓与止血中的应用1. 1.血小板糖蛋白血小板糖蛋白血小板糖蛋白血小板糖蛋白 血小板质膜糖蛋白血小板质膜糖蛋白血小板质膜糖蛋白血小板质膜糖蛋白GPGPa a a a ：CDw49b GPCDw49b GPa a a a： CD61CD61GPGPb b b b ：CD42b GPCD42b GP： CD36CD36GPGPc c c c ：CDw49f GPCDw49f GP： CD42aCD42aGPGPa a a a ：CD29 GPCD29 GPb b b
14、 b： CD41CD41GPGPaaaa：CD31CD31 血小板颗粒血小板颗粒血小板颗粒血小板颗粒颗粒、颗粒、颗粒、颗粒、 颗粒和颗粒和颗粒和颗粒和颗粒颗粒颗粒颗粒2. 2.活化血小板检测活化血小板检测活化血小板检测活化血小板检测 CD62PCD62P， CD63CD63 GP GP b/b/a(CD41a(CD41/ / / /61)61) GP GP(CD36)(CD36)(CD36)(CD36) GP GP GP GP-Ib (CD42a-Ib (CD42a-Ib (CD42a-Ib (CD42a/ / / /CD42b)CD42b)CD42b)CD42b) Thrombospondi
15、n Thrombospondin Thrombospondin Thrombospondin（TSPTSPTSPTSP）, , , ,凝血酶敏感蛋白凝血酶敏感蛋白凝血酶敏感蛋白凝血酶敏感蛋白 血小板内钙离子血小板内钙离子血小板内钙离子血小板内钙离子3. 3.遗传性血小板功能缺陷性疾病诊断遗传性血小板功能缺陷性疾病诊断遗传性血小板功能缺陷性疾病诊断遗传性血小板功能缺陷性疾病诊断 巨血小板综合症巨血小板综合症巨血小板综合症巨血小板综合症(BSS)(BSS)GP Ib-GP Ib-(CD42a(CD42a(CD42a(CD42a/ / / /CD42b)CD42b)CD42b)CD42b)缺陷或缺乏
16、缺陷或缺乏缺陷或缺乏缺陷或缺乏 血小板无力症血小板无力症血小板无力症血小板无力症(CT)(CT)(CT)(CT)GP GP GP GP b/b/a(CD41a(CD41/ / / /61)61)缺陷或缺乏缺陷或缺乏缺陷或缺乏缺陷或缺乏 血小板活化标志物在缺血性脑血管疾病中研究：血小板活化标志物在缺血性脑血管疾病中研究： 1.脑缺血患者急性期血小板CD62p、CD63测定2.缺血性脑血管患者CD62p、CD54、CD49测定3.缺血性脑血管患者CD62p、TSP、CD54测定脑缺血患者急性期脑缺血患者急性期CD62 pCD62 p、CD63CD63测定测定 FCM FCM在骨髓和器官移植中的应用
17、在骨髓和器官移植中的应用在骨髓和器官移植中的应用在骨髓和器官移植中的应用 骨髓或脐血的祖干细胞细胞测定骨髓或脐血的祖干细胞细胞测定骨髓或脐血的祖干细胞细胞测定骨髓或脐血的祖干细胞细胞测定移植前配型移植前配型移植前配型移植前配型移植后的免疫监测移植后的免疫监测移植后的免疫监测移植后的免疫监测淋巴细胞及活化淋巴细胞亚群淋巴细胞及活化淋巴细胞亚群淋巴细胞及活化淋巴细胞亚群淋巴细胞及活化淋巴细胞亚群粘附分子粘附分子粘附分子粘附分子FCM FCM 测定测定CD34+CD34+细胞的绝对计数方法（细胞的绝对计数方法（ISHAGEISHAGE方案）方案）FCM FCM 测定测定CD34+CD34+细胞的绝对
18、计数方法的原理细胞的绝对计数方法的原理 由由于于HSCHSC细细胞胞胞胞浆浆中中无无颗颗粒粒或或颗颗粒粒极极少少，因因此此SSCSSC较较低低，而而HSCHSC属属于于小小至至中中等等度度大大小小的的细细胞胞，故故其其在在FSCvs FSCvs SSCSSC点点图图中中位位于于大大颗颗粒粒淋淋巴巴细细胞胞或或单单核核细细胞胞与与细细胞胞碎碎片片之之间间。同同时时CD34CD34抗抗原原表表达达阳阳性性而而CD45CD45抗抗原原表表达达弱弱阳阳性性，利利用用CD34/CD45CD34/CD45双双标标记记和和FLOWCOUNTFLOWCOUNT可可直直接接绝绝对对计计数数。CD34+CD34+
19、细细胞胞的的绝绝对对计计数数= =区区域内细胞数域内细胞数FlowCountFlowCount应用浓度应用浓度/ /区域内的区域内的FlowConutFlowConut数数试剂试剂(1).StemTrol (1).StemTrol 用用于于CD34CD34+ + 细细胞胞绝绝对对计计数数内内参照参照(2).CD45-FITC (2).CD45-FITC (3).CD34-PE (3).CD34-PE (4).IgG1-FITC (4).IgG1-FITC (5).FlowCount(5).FlowCount荧光微球一瓶荧光微球一瓶 方法方法（1 1）标标记记3 3支支试试管管：Tube1(Tr
20、ol/45/34)Tube1(Trol/45/34)加加10 10 ul ul CD45-CD45-FITCFITC、10 10 ul ul CD34-PE CD34-PE ；Tube2(45/34)Tube2(45/34)加加10 10 ul ul CD45-CD45-FITCFITC、10 10 ul ul CD34-PE CD34-PE ；Tube3(Trol/45/34)Tube3(Trol/45/34)加加10 10 ul ul CD45-FITCCD45-FITC、10 10 ul ul IgG1-PEIgG1-PE；三三管管都都加加50 50 ulul待待检检标标本本。然然后后在
21、在Tube1Tube1、中中加加入入10 10 ul ul StemTrolStemTrol。混混匀匀后后室室温温避避光光15min,Q-Prep15min,Q-Prep溶血。溶血。（2 2）振振荡荡混混匀匀FlowCountFlowCount，加加100 100 ul ul FlowCountFlowCount到到三三反反应应管管，注注意意不不要要带带入入气气泡泡，并并混混匀匀。上上机机前前必必须须重重复复振振荡荡混混匀一次。匀一次。（3 3）上上FCMFCM分分析析，并并计计算算各各类类CD34CD34+ + 细细胞胞，包包括括内内参照及全血标本。参照及全血标本。（4 4）StemTrol
22、StemTrol结结果果经经标标准准化化因因子子（100 100 ul/20 ul/20 ul=5ul=5）校校正正，与与StemTrolStemTrol提提供供的的标标准准值值比比较较，差差异异在在 15%15%以以内内通通过过。这这样样Tube2Tube2测测得得的的CD34CD34+ + 细细胞胞数数为为待待检检标标本本的的绝绝对对CD34CD34+ + 细细胞胞数数。Tube1Tube1的的计计数数值值包包括括 StemTrol+HSPCS+StemTrol+HSPCS+碎碎 片片 ， Tube2Tube2的的 计计 数数 值值 包包 括括HSPCS+HSPCS+碎碎片片，Tube3T
23、ube3的的计计数数值值为为碎碎片片。（Tube1Tube1Tube2Tube2）的的计计数数值值标标准准化化因因子子为为StemTrolStemTrol的的质质控控值值，（Tube2-Tube3Tube2-Tube3）的计数值）的计数值标准化因子为标准化因子为HSPCSHSPCS。CD34+CD34+造血干祖细胞测定的临床应用造血干祖细胞测定的临床应用（1 1）PBSCPBSC采采集集前前 CD34CD34阳阳性性细细胞胞动动员员有有效效性性的的监监测测：可可以以指指导导临临床床制制定定采采集集计计划划。一一般般来来说说，外外周周静静脉脉血血有有核核细细胞胞中中CD34CD34十十细细胞胞达
24、达到到0 01010以以上上时时，可可以以考考虑虑行行PBSCPBSC单单采采术术。否则，应继续动员。否则，应继续动员。（2 2）各各种种造造血血干干细细胞胞移移植植物物的的CD34CD34十十细细胞胞剂剂量量控控制制： BMTBMT、 PBSCTPBSCT的的CD34CD34十十细细胞胞剂剂量量在在2 210106 6/Kg/Kg，有有报报道道采采用用精精确确的的 CD34CD34十十细细胞胞测测定定方方法法， CD34CD34十十细细胞胞剂剂量量可可小小至至0 05 5 10105 5kgkg也也能能植植活活。脐脐血血干干细细胞胞移移植植时时， CD34CD34十十细细胞胞剂剂量量可可少少
25、至至BMTBMT或或PBSCPBSC的十分之一，即的十分之一，即2x102x105 5kgkg。（3 3）化化疗疗强强弱弱的的掌掌握握：化化疗疗后后血血象象的的恢恢复复快快慢慢取取决决于于化化疗疗对对造造血血干干祖祖细细胞胞损损伤伤的的程程度度， CD34CD34十十细细胞胞的的测测定定可可以以判判断断化化疗疗的的强强度度。要要求求化化疗疗强强度度控控制制在在杀杀伤伤一一定定比比例例而而非非所所有有CD34CD34十细胞为度。十细胞为度。（4 4）贫贫血血的的鉴鉴别别( (如如再再障障、缺缺铁铁性性贫贫血血等等) )：如如果果再再障障的的原原因因属属于于干干细细胞胞受受累累，则则CD34CD3
26、4十十细细胞胞可可以以明明显显降降低低 ( (0 01010。缺铁性贫血时，。缺铁性贫血时， CD34CD34十细胞数量应在正常范围之内。十细胞数量应在正常范围之内。（5 5）基基因因治治疗疗： CD34CD34十十的的HSCHSC作作为为缺缺陷陷基基因因的的靶靶细细胞胞有有它它独独特特的的优优点点，因因为为HSCHSC具具有有自自我我更更新新的的能能力力，因因此此，缺缺陷陷基基因因导导入入此此类类细细胞胞后后能能维维持持终终身身，从从而而彻彻底底治治愈愈疾疾病病。显显然然， C034C034十十HSCHSC的精确测定显得非常重要。的精确测定显得非常重要。细胞凋亡检测细胞凋亡检测DNA 含量分析含量分析 凋亡的细胞因核酸内切酶的活性增强，使DNA分裂成一些小片段，这些小片段因细胞膜的通透性的增加而漏出胞外，使凋亡细胞的 DNA含量相对减少，因此在DNA的直方图上出现一个位于 G1峰左侧的小峰（亚G1峰），称为AP峰。由于亚G1峰是DNA断裂后胞浆内含量减少的结果，因此在评价细胞早期凋亡时，该指标不够灵敏。温馨提示：本PPT课件下载后，即可编辑修改，也可直接使用。（希望本课件对您有所帮助）
