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1、基因克隆步骤完整版基因克隆步骤完整版1 1 总总 RNARNA 提取提取(1)(1) 液氮研磨或冰上匀浆实验材料；先将液氮研磨或冰上匀浆实验材料；先将 1ml Trizol1ml Trizol加到离心管中待用加到离心管中待用(2)(2) 将研磨好的样品加到离心管中混匀，室温放置将研磨好的样品加到离心管中混匀，室温放置 5 min5 min；打开离心机预冷；打开离心机预冷(3)(3) 加加 200 200 L L 氯仿，振荡氯仿，振荡 15 sec15 sec，室温放置，室温放置 3 min3 min，分层；，分层；(4) 4(4) 4o oC C，12,00012,000g g，离心，离心 1
2、5 min15 min；(5)(5) 取上清，加取上清，加 500500 LL 异丙醇，混匀，室温放置异丙醇，混匀，室温放置 10 min10 min；(6) 4(6) 4o oC C，12,00012,000g g，离心，离心 10 min10 min；(7)(7) 弃上清，加弃上清，加1 mL75%1 mL75%乙醇，漂浮洗涤沉淀，振荡充分；再用乙醇，漂浮洗涤沉淀，振荡充分；再用100%100%乙醇乙醇清洗清洗(8) 4(8) 4o oC C，7,5007,500g g，离心，离心 5 min5 min；(9)(9) 弃上清，弃上清， 离心，离心， 用枪吸取多余液体，用枪吸取多余液体， 放
3、在超净台里干燥后，放在超净台里干燥后， 加加 5050 LL DEPC DEPC水，水，8080o oC C 保存。保存。此操作中所用到的器皿均需经过此操作中所用到的器皿均需经过 DEPCDEPC 灭活灭活 RNARNA 酶处理。提取的总酶处理。提取的总 RNARNA需经需经 RNARNA 电泳检测质量，并用紫外分光光度计测定浓度。电泳检测质量，并用紫外分光光度计测定浓度。ODOD260260值为核酸的吸值为核酸的吸收值，收值，ODOD280280值为蛋白的吸收值，值为蛋白的吸收值，ODOD260/280260/280值在值在 1.8-2.01.8-2.0 间一般说明该核酸蛋白含间一般说明该核
4、酸蛋白含量在允许的范围内，量在允许的范围内，可正常使用；可正常使用；此外还有此外还有 ODOD230230值为多糖和酚类的吸收值，值为多糖和酚类的吸收值，比比较干净的核酸较干净的核酸 ODOD260/230260/230值能达到值能达到 2.22.2 左右。左右。RNARNA 浓度计算公式：总浓度计算公式：总 RNARNA 浓度浓度（ g/mLg/mL）=A=A260260 稀释倍数稀释倍数 4040。(2) 16(2) 16o oC C 反应反应 3030 分钟，所得产物保存于分钟，所得产物保存于4 4o oC C 冰箱备用。冰箱备用。4.34.3 连接产物转化连接产物转化 E.coliE.
5、coli DH5DH5(1)(1) 将将 5 5 L L 连接产物加入到连接产物加入到 100100L LE.coliE.coli DH5DH5 感受态细胞中，轻轻旋转离感受态细胞中，轻轻旋转离心管混匀内容物，冰上静置心管混匀内容物，冰上静置 30 min30 min；(2) 42(2) 42o oC C 水浴热激转化水浴热激转化 90 sec90 sec，立即放回冰上，放置，立即放回冰上，放置 3 min3 min；(3)(3) 每管加入每管加入 500 500 L LBL LB 培养基（室温放置）培养基（室温放置） ，3737o oC 160-180 rpmC 160-180 rpm 振荡
6、培养振荡培养45-60 min45-60 min，使菌体复苏并表达抗性基因；，使菌体复苏并表达抗性基因；(4)(4) 在含有在含有 AmpAmp（100 100 g/mLg/mL）的选择性平板上加入）的选择性平板上加入 60-100 60-100 L L 菌液，用无菌液，用无菌涂布棒轻轻涂布均匀后，用菌涂布棒轻轻涂布均匀后，用 ParafilmParafilm 膜封好；膜封好；(5)(5) 将培养皿正放，将培养皿正放，3737o oC C 约约 5050 minmin，待液体全部吸收后，倒置平板继续培，待液体全部吸收后，倒置平板继续培养养 10-16 h10-16 h。4.44.4 转化子的筛
7、选及鉴定转化子的筛选及鉴定(1)(1) 用无菌枪头挑取用无菌枪头挑取 LBLB 平板上平板上 3-53-5 个单菌落，分别接种到个单菌落，分别接种到 3.5 mL LB3.5 mL LB 液体液体培养基中（含培养基中（含 100 100 g/mL Ampg/mL Amp） ，3737o oC C，165rpm165rpm 振荡培养振荡培养 10-12 h10-12 h；(2)(2) 用用 5 5 L L 菌液做模板，进行菌液做模板，进行PCRPCR 鉴定（鉴定（50 50 L L 体系）体系） ，操作步骤同，操作步骤同3 3。阳。阳性菌液由性菌液由 InvitrogenInvitrogen 生物公司测序鉴定，余下的菌液生物公司测序鉴定，余下的菌液 4 4o oC C 保存备用；保存备用；(3)(3) 测序结果在测序结果在 GenbankGenbank 数据库中进行比对分析。数据库中进行比对分析。
