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1、细胞因子及免疫细胞功能检测细胞因子及免疫细胞功能检测(jin c)方法简介方法简介刘素侠刘素侠山东大学山东大学(shn dn d xu)(shn dn d xu)医学院免疫学医学院免疫学研究所研究所2011-2-23第一页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用内内 容容细胞因子检测的常用方法细胞因子检测的常用方法免疫免疫(miny)(miny)细胞功能的常用检测方法细胞功能的常用检测方法第二页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用一、免疫学检测一、免疫学检测(jin c)的基本原理的基本原理抗原与抗体反应抗原与抗体反应(fnyng)的的特异性特异性是各种免疫学是各种免疫学检测技术的基本原理
2、检测技术的基本原理第三页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用第四页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用二、细胞因子检测二、细胞因子检测(jin c)方法方法细胞因子的临床意义细胞因子的临床意义常规测定法常规测定法 胞内细胞因子检测方法胞内细胞因子检测方法细胞因子检测的主要临床细胞因子检测的主要临床(ln chun)(ln chun)应用应用 第五页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用（一）细胞因子的临床意义细胞因子的临床意义细胞因子与疾病细胞因子与疾病：正常情况下，细胞因子表：正常情况下，细胞因子表达和分泌受机体的严格调控，在病理状态下达和分泌受机体的严格调控，在病理状态下细胞因子
3、会出现异常性表达，表现细胞因子会出现异常性表达，表现(bioxin)(bioxin)为为细胞因子及其受体的缺陷，细胞因子表达过细胞因子及其受体的缺陷，细胞因子表达过高，以及可溶性细胞因子受体的水平增加等。高，以及可溶性细胞因子受体的水平增加等。 细胞因子与治疗细胞因子与治疗：重组细胞因子做为生物应：重组细胞因子做为生物应答调节剂。已批准生产：答调节剂。已批准生产：IFN-IFN-、，EpoEpo，GM-CSFGM-CSF，G-CSFG-CSF，IL-2IL-2，正在进行临床，正在进行临床试验的：试验的：IL-1IL-1、3 3、4 4、6 6、1111，M-CSFM-CSF，SCFSCF，TG
4、F-TGF-等等 第六页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用（二）常规检测（二）常规检测(jin c)方法方法分子生物学测定法分子生物学测定法 生物生物(shngw)(shngw)活性检测法活性检测法 免疫化学测定法免疫化学测定法 第七页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用1.1.分子生物学测定法分子生物学测定法是测定细胞因子是测定细胞因子mRNA的表达水平，主要有的表达水平，主要有两种方法：两种方法：分子分子(fnz)杂交技术杂交技术多聚酶链反应技术（多聚酶链反应技术（PCR）第八页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用分子杂交分子杂交(zjio)技术技术制备细胞因子的基因探针；制
5、备细胞因子的基因探针；Northern 杂交或细胞原位杂交；杂交或细胞原位杂交；优点：高度敏感和高度特异；优点：高度敏感和高度特异；缺点：操作较繁琐缺点：操作较繁琐 测定结果只能代表细胞因子基因的表测定结果只能代表细胞因子基因的表达达(biod)(biod)，而不能代表活性细胞因子的水平。，而不能代表活性细胞因子的水平。 第九页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用多聚酶链反应技术多聚酶链反应技术(jsh)（PCR）PCR（polymerase chain reaction)技术，是一种高技术，是一种高效的基因体外扩增技术；效的基因体外扩增技术；将细胞因子产生细胞的将细胞因子产生细胞的RNA
6、提取出来，再经逆转录合提取出来，再经逆转录合成成cDNA，以，以cDNA为模板，在细胞因子引物的引导下，为模板，在细胞因子引物的引导下，即可进行即可进行PCR扩增；扩增；优点优点(yudin)：灵敏度高：灵敏度高 操作简便操作简便缺点：缺点：测定结果只能代表细胞因子基因的表达，而不能代测定结果只能代表细胞因子基因的表达，而不能代表活性细胞因子的水平。表活性细胞因子的水平。 第十页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用PCR原理原理(yunl)PCR是体外酶促合成特异DNA片段的方法。由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环(xnhun)进行，使目的DNA得以迅速扩增。由变性
7、-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：dsDNA ssDNA退火(复性)：模板DNA与引物的互补配对延伸：DNA模板与引物按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新DNA 链新链又可成为下次循环的模板,可将待扩目的基因扩增放大几百万倍第十一页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用5353变性变性(binxng)退火退火(tu hu)延伸延伸(ynshn)第二循环第二循环dsDNAssDNA加入引物加入引物5335dNTP, Taq酶酶535533355355第十二页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用反转录反转录(zhun l)PCR（Reverse transcription
8、 PCR，RT-PCR)第十三页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用RTPCR第十四页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用RT-PCR反应反应(fnyng)过程过程反转录(zhun l)PCR： mRNA-cDNA-PCR抽提RNA 反转录合成cDNAPCR 扩增第十五页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用RT反应反应(fnyng)体系体系模板：总RNA，mRNA引物：随机(su j)引物，Oligo(dT)，基因特异性引物（GSP)逆转录酶：AMV M-MLV Quant Reverse Transcriptase第十六页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用PCR反应(fny
9、ng)体系模板：逆转录产物cDNA目的(md)基因特异性引物；反应混合液：dNTP，Taq聚合酶，Mg+第十七页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用RT-PCR反应反应(fnyng)产物检测产物检测凝胶电泳分析凝胶电泳分析：初步判断产物的特异性。酶切分析：对扩增产物进行鉴定、对靶基因分型及进行变异性研究。分子杂交：检测产物特异性，分析碱基突变核酸核酸(h sun)序列分析（测序序列分析（测序）：是检测PCR产物特异性的最可靠方法第十八页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用实时荧光实时荧光(ynggung)定量定量PCR(Fluorescence Quantified real time
10、 PCR)与常规与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效相比，它具有特异性更强、有效解决解决PCR污染问题、自动化程度高等特点污染问题、自动化程度高等特点(tdin)，目前已得到广泛应用。，目前已得到广泛应用。第十九页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用（1）原理原理(yunl)(yunl)实时荧光定量实时荧光定量PCR技术是指在技术是指在PCR反应反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个累实时监测整个PCR进程，最后通过标准进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析曲线对未知模板进行定量分析(dnglingfnx)的的方法。方法。 第二十页
11、，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用1) 常用名词常用名词(mng c)概念概念扩增曲线(qxin)荧光阈值Ct值第二十一页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用扩增曲线扩增曲线(qxin)第二十二页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用设定设定(sh dn)荧光域值荧光域值PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号；荧光域值的设置是3-15个循环的荧光信号的标准差的10倍，即：threshold = 10 SDcycle 3-15 意义：大于荧光背景值和阴性对照荧光最高值，进入(jnr)指数期的最初阶段；真正荧光信号：荧光信号大于阈值第二十三页，共一百一十五页。流式细胞术的原
12、理和应用荧光荧光(ynggung)阈值阈值（threshold）第二十四页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用Ct值值Ct值的含义是：扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的域值时所需要的循环次数(csh)C代表Cycle（循环数） t代表threshold （荧光域值）第二十五页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用Ct值的确定值的确定(qudng)横坐标：PCR循环数纵坐标：荧光信号强 度黑线：荧光域值红线：无模板 -域值下一 直线绿线 ：样品(yngpn)Ct值=17（第17个循环时，荧光信号强度达到域值）第二十六页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用Ct值与起始值与起始(q
13、sh)模板的关系模板的关系 研究研究(ynji)表明，每个表明，每个模板的模板的Ct值与该模板值与该模板的起始拷贝数的对数的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始存在线性关系，起始拷贝数越多，拷贝数越多，Ct值越值越小。小。 利用已知起始拷贝数利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准的标准品可作出标准曲线曲线第二十七页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用（2）常用）常用(chn yn)标记方法标记方法非特异性荧光标记： SYBR Green I特异性荧光标记： TaqMan Probe； 分子(fnz)信标第二十八页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用SYBR Green I染料染料(rnli
14、o)法法SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域(qy)的具有绿色激发波长的染料。第二十九页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用SYBR Green I染料染料(rnlio)法原理法原理第三十页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用注意事项注意事项因为SYBR Green I可以与所有(suyu)dsDNA结合而激发荧光，因此，如果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体，也可以同时被检测，将导致结果不准确；关键：设计特异性引物关键：设计特异性引物！第三十一页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用结果判定结果判定(pndng)融解曲线融解曲线第三十二页，共一百一十五
15、页。流式细胞术的原理和应用第三十三页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用（3）qPCR结果分析结果分析相对相对(xingdu)定量解析定量解析第三十四页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用1 1）相对）相对(xingdu)(xingdu)定量的必要性定量的必要性第三十五页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用必须用内对照必须用内对照(duzho)基因（管家基因）进基因（管家基因）进行校正行校正第三十六页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用2 2）管家基因筛选）管家基因筛选(shixun)(shixun)管家基因：维持细胞生命活动代谢所必须的基因，如GAPDH, beta-Acti
16、n, 18s rRNA等；筛选方法： 根据(gnj)文献提供； 通过具体实验。第三十七页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用3 3）分析方法）分析方法双标准(biozhn)曲线法2 - Ct法（Ct值比较法）第三十八页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用1 1）双标准）双标准(biozhn)(biozhn)曲线法曲线法通过标准曲线对对照样品、待测样品目的基因及管家基因进行定量(dngling)，然后根据公式计算相对值，即为相对表达量。公式： 校正值(zhn zh)目的基因定量结果管家基因定量结果相对值待测样品校正值对照样品校正值=校正值=目的基因定量结果校正值=管家基因定量结果目的基因
17、定量结果校正值=对照样品校正值待测样品校正值对照样品校正值=待测样品校正值对照样品校正值相对值=待测样品校正值对照样品校正值第三十九页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用第四十页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用优缺点优缺点优点：分析简单，实验优化相对简单；优点：分析简单，实验优化相对简单；缺点：对每一个缺点：对每一个(y )基因，每一轮实验均需基因，每一轮实验均需要做标准曲线；要做标准曲线；应用：基因表达调控研究应用：基因表达调控研究第四十一页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用2 2） 2 - Ct法法第四十二页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用2 - Ct法：假设目的
18、基因、对照基因扩增效率假设目的基因、对照基因扩增效率均是均是100% Ct（处理前/对照组）=18-17=1 Ct（处理后/实验组）=16-17.4=-1.4 Ct= Ct（处理后）-Ct（处理前)=-2.4 比率(bl)（处理后/处理前）= 2 - Ct=2 - -2.4 =5.3结论：JUN处理后表达水平是处理前的5.3倍修正：扩增效率不是1，而是E， 2 - Ct可修正为（1+E） - Ct第四十三页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用优点优点(yudin)特异性好；简单、安全、自动化程度(chngd)高；速度快、高通量；线性关系好、线性范围宽第四十四页，共一百一十五页。流式细胞术的
19、原理和应用2. 生物生物(shngw)活性检测法活性检测法 测定细胞因子的生物学活性：刺激细胞增殖、维持细胞生长(shngzhng)和存活、抑制细胞生长(shngzhng)、溶解或杀灭细胞、抗病毒、促进细胞趋化、刺激细胞生成集落等活性；指示细胞：多选用造血系统或淋巴系统细胞，最好用依赖性细胞株细胞；显示细胞反应：用3H-胸腺嘧啶核苷参入，或用四唑盐转化引致的颜色反应。 第四十五页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用（1）依赖性细胞株）依赖性细胞株 一些肿瘤细胞株必须依赖于细胞因子方能在体外增殖，如DTLL细胞株依赖IL-2；FDC-PL细胞株依赖于小鼠IL-3；TF-1细胞株依赖于人IL-
20、3和人GM-CSF，因而可利用这些(zhxi)依赖细胞株检测相应的细胞因子；优点：敏感性高，特异性强；缺点：应用有限。 第四十六页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用（2）功能）功能(gngnng)检测检测 利用一些细胞因子的功能特性，可建立(jinl)相应的活性测定方法，如干扰素的抑制病毒感染效应，肿瘤坏死因子对L929细胞的杀伤作用等。优点：敏感性高；缺点：特异性不够，容易受一些扰因素的影响。 第四十七页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用A. 增殖增殖(zngzh)或增殖或增殖(zngzh)抑制法抑制法 其基本原理是应用某一细胞因子能特异地刺激或抑制某些(mu xi)指示细胞的增
21、殖，通过3H-TdR掺入或MTT法显色，反映待检细胞因子的活性水平。 第四十八页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用B. 集落形成集落形成(xngchng)法法 其基本原理是应用骨髓干细胞体外半固体培养系统，根据不同造血因子能诱导干细胞或定向造血祖细胞形成某一种(y zhn)或某些种类细胞的集落，通过对形成集落形态学、酶学鉴定，计算不同种类集落形成的数量和比例，反映待测标本中CSF的种类和活性水平。 第四十九页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用C. 直接直接(zhji)杀伤靶细胞杀伤靶细胞 细胞因子TNF-、TNF-具有直接杀伤某些肿瘤细胞的作用，采用TNF敏感的细胞株如小鼠成纤维细
22、胞株L929，以WEHI164亚克隆13（鼠纤维肉瘤细胞系）作为指示细胞，通过(tnggu)3H-TdR释放法或染料染色等可检测待检样品中TNF的活性水平。 第五十页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用D. 抗病毒效应抗病毒效应(xioyng)靶细胞受某些病毒感染后可发生明显病变和死亡，干扰素可保护靶细胞免受病毒的攻击；常用的病毒是水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus, VSV），敏感的指示细胞为喉癌的上皮细胞株Hep2和羊膜(yngm)的上皮细胞WISH，通过干扰素（IFN-、IFN-、IFN-）抑制病毒致病变的程度，计算出待测样品中IFN的活性单位。 第
23、五十一页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用E. 趋化作用趋化作用(zuyng)IL-8对多形核细胞、淋巴细胞具有趋化作用，可用小室法或软琼脂(qingzh)趋化法，PMN或淋巴细胞作为指示细胞，以细胞趋化的程度来反映样品中IL-8活性水平。 第五十二页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用F. 抗体抗体(kngt)形成法形成法IL-6可在体外刺激某些B淋巴细胞系产生(chnshng)和分泌免疫球蛋白；指示细胞：分泌IgG的ARH-77、CESS 分泌IgM的SKW6.CL-4方法：在一定条件下，待检样品中IL-6水平与培养细胞上清IgG或IgM水平正相关，通过标准IL-6的对照可推算出
24、待检样品中IL-6的活性。 第五十三页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用IL-2的诱生及生物的诱生及生物(shngw)活性测定（试验四）活性测定（试验四）第五十四页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用 一般一般(ybn)方法方法 细胞因子敏感的细胞株 细胞因子的标准品及待测品指示剂：MTT，3H-TdR酶联免疫吸附测定仪测定OD值绘制标准曲线(qxin)标准品50%最大OD值找出与标准品50%最大OD值相对应的标准品稀释度(S)找出与标准品50%最大OD值相对应的待测品稀释度(A)待测品单位数=S/A标准品单位第五十五页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用稀释(xsh)度OD值
25、1/8 1/4 S 1/2 A 1100%OD50%OD标准(biozhn)品待测品第五十六页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用对生物学活性测定法的评价对生物学活性测定法的评价(pngji)优点：灵敏度高； 测定的是有生物活性的细胞因子缺点：维持靶细胞株，操作繁杂和难定量(dngling) 特异性差 实验周期较长 易受其它因素的影响 第五十七页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用3. 免疫化学测定法免疫化学测定法 用来检测细胞因子蛋白质的抗原特性，利用抗体对抗原表位的识别，测定的是可溶性细胞因子的抗原性。基本原理是细胞因子（或受体）与相应的特异性抗体（单克隆抗体或多克隆抗体）结合，通
26、过同位素、荧光素或酶等标记技术加以放大(fngd)和显示，从而定性或定量显示细胞因子（或受体）的水平。免疫标记技术免疫标记技术 第五十八页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用RadioimmunoassayImmunofluorescence 酶免疫分析酶免疫分析酶免疫分析酶免疫分析 (EIA)：ELISAELISA：体液中的细胞因子：体液中的细胞因子：体液中的细胞因子：体液中的细胞因子 免疫组织化学免疫组织化学免疫组织化学免疫组织化学 ELISPOT：分泌：分泌：分泌：分泌(fnm)(fnm)细胞因子的细胞因子的细胞因子的细胞因子的T T细胞（频率）细胞（频率）第五十九页，共一百一十五页
27、。流式细胞术的原理和应用第六十页，共一百一十五页。60流式细胞术的原理和应用（三）胞内细胞因子检测（三）胞内细胞因子检测(jin c)方方法法测定的是细胞因子的前体分子，是单一(dny)细胞行为；一般要用先活化细胞，使之合成欲测细胞因子。在活化过程中加入蛋白质运输抑制物，如莫能菌素(monensin)和布雷菲尔德菌素A，阻止了细胞因子分泌，提高了胞内检测的阳性率；检测方法：ELISPOT 荧光标记：荧光显微镜或FCM 第六十一页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用活化剂活化剂活化(huhu)T细胞：除特异性抗原外，主要植物血凝素(PHA)、巴豆酯(PMA)、离子霉素（ionomycin）、
28、钙离子载体A23187、T细胞受体抗体或CD3的抗体等；活化B细胞：特异性抗原，脂多糖（LPS）、金黄色葡萄球菌肠内毒素A、B细胞受体抗体；活化单核细胞：LPS和某些细胞因子。 第六十二页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用人外周血单个核细胞人外周血单个核细胞IL-17A流式检测流式检测(jin c)方法方法 第六十三页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用人外周血单个核细胞（PBMC ）的分离；调整细胞浓度接种24孔板或96孔板；加入Brefeldin A，PMA和ionomycin （离子霉素 ），进行细胞培养；一定(ydng)时间后，收集细胞进行表面抗原染色（如CD4或CD8）、固
29、定和通透、细胞内细胞因子染色、流式细胞仪测定和结果分析。 第六十四页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用(1) 抗凝抗凝静脉血静脉血(2) 加等加等量量(dn lin)NS(4) 密度梯度离心密度梯度离心(lxn)血浆血浆分离液分离液RBCPBMCPMN(3) 混匀后，缓慢混匀后，缓慢(hunmn)加于分离加于分离液上液上第六十五页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用 图图1. 表达表达IL-17和和IFN- 的的CD4+T细胞细胞(xbo)分析分析 图图2. CD4+T细胞表达转录因子细胞表达转录因子(ynz)FoxP3的检测的检测第六十六页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用（
30、四）细胞因子检测（四）细胞因子检测(jin c)的临床的临床应用应用 机体免疫状态的评估； 疾病预后及治疗监测指标(zhbio)； 病理变化和损伤机理研究； 辅助诊断。 第六十七页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用三、常用免疫三、常用免疫(miny)(miny)细胞功能检测细胞功能检测方法方法评价机体的特异性和非特异性免疫评价机体的特异性和非特异性免疫(miny)功能功能第六十八页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用内容内容(nirng) 淋巴细胞的功能检测淋巴细胞的功能检测 T T细胞功能检测细胞功能检测 B B细胞功能检测细胞功能检测 NK NK细胞功能检测细胞功能检测吞噬细胞功
31、能检测吞噬细胞功能检测免疫细胞功能检测的临床免疫细胞功能检测的临床(ln chun)(ln chun)应用应用 第六十九页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用（一）淋巴细胞功能（一）淋巴细胞功能(gngnng)检测检测淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实验；验；体内实验主要是间接了解体内实验主要是间接了解(lioji)淋巴细胞对抗淋巴细胞对抗原、半抗原或有丝分裂原的应答反应；原、半抗原或有丝分裂原的应答反应；体外实验主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分体外实验主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂原刺激后的增殖反应、细胞毒性试验及淋裂原刺激后的增殖反应、细胞毒性
32、试验及淋巴细胞分泌产物的测定巴细胞分泌产物的测定第七十页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用淋巴细胞淋巴细胞T细胞：介导细胞免疫细胞：介导细胞免疫(miny)B细胞：介导体液免疫细胞：介导体液免疫NK细胞：固有免疫细胞：固有免疫 第七十一页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用第七十二页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用1. T细胞细胞(xbo)功能检测功能检测体外实验：T细胞增殖试验细胞增殖试验T细胞分泌功能测定细胞分泌功能测定(cdng)T细胞介导的细胞毒试验细胞介导的细胞毒试验. 体内试验体内试验第七十三页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用（1）T淋巴细胞增殖淋巴细胞增
33、殖(zngzh)试验试验A.A.原理原理(yunl)(yunl)：淋巴细胞淋巴细胞DNA合成合成(hchng)分化分化母细胞母细胞刺激物刺激物细胞变大细胞变大细胞浆扩大细胞浆扩大空泡空泡核仁明显核仁明显核染色质疏松核染色质疏松第七十四页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用 未转化和转化淋巴细胞的形态特征未转化和转化淋巴细胞的形态特征转化的淋巴细胞转化的淋巴细胞未转化的淋巴细胞未转化的淋巴细胞淋巴母细胞淋巴母细胞 过渡型过渡型细胞大小细胞大小( (直径直径m)m)12122020121216166 68 8核大小、染色质核大小、染色质增大、疏松增大、疏松增大、疏松增大、疏松不增大、密集不增大
34、、密集核仁核仁清晰、清晰、1 14 4个个有或无有或无无无有丝分裂有丝分裂有或无有或无无无无无胞质、着色胞质、着色增多、嗜碱增多、嗜碱增多、嗜碱增多、嗜碱极少、天青色极少、天青色浆内空泡浆内空泡有或无有或无有或无有或无无无伪足伪足有或无有或无有或无有或无无无第七十五页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用第七十六页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用B. 刺激物刺激物特异性刺激物： 异种(y zhn)抗原：破伤风类毒素、链球菌激酶、纯化蛋白衍生物（purifiedproteinderivative，PPD）和白色念珠菌 同种组织抗原：HLA非特异性刺激物： PHA： 人人T细胞细胞 Co
35、nA：小鼠：小鼠T细胞细胞 PWM： T、 B细胞细胞 LPS： B细胞细胞第七十七页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用T细胞细胞(xbo)非特异性抗原刺激非特异性抗原刺激淋巴淋巴(ln b)母细胞母细胞化化模拟特异性抗原刺激下模拟特异性抗原刺激下模拟特异性抗原刺激下模拟特异性抗原刺激下T细胞的分裂、增殖过程细胞的分裂、增殖过程细胞的分裂、增殖过程细胞的分裂、增殖过程反映反映反映反映T T细胞功能和机体细胞免疫水平细胞功能和机体细胞免疫水平第七十八页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用常用常用(chn yn)方法方法形态形态形态形态(xngti)(xngti)计数计数计数计数法法法法
36、同位素掺入法同位素掺入法CCK-8CCK-8法法法法MTTMTT法法法法FCMFCM法法法法, , 第第4 4次实验次实验(shyn)(shyn)第七十九页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用形态形态(xngti)计数法计数法外周血或分离外周血或分离(fnl)的淋巴细胞的淋巴细胞PHA涂片涂片(t pin)染色染色共培养共培养形态学观察形态学观察计算转化率计算转化率第八十页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用第八十一页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用方法方法(fngf)评价评价优点：简便易行，普通光学显微镜便能观察优点：简便易行，普通光学显微镜便能观察(gunch)(gunch
37、)结果。结果。缺点：是依靠肉眼观察形态学变化，判断结缺点：是依靠肉眼观察形态学变化，判断结果易受主观因素影响，重复性和准确性较差。果易受主观因素影响，重复性和准确性较差。第八十二页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用同位素掺入法同位素掺入法外周血或分离外周血或分离(fnl)的淋巴细胞的淋巴细胞PHA共培养共培养DNA合成合成(hchng)增加增加3H-TdR3H掺入到掺入到DNA中中液体液体(yt)闪烁仪检测信闪烁仪检测信号号第八十三页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用SIPHA刺激管刺激管cpm均值均值(jn zh)/对照管对照管cpm均值均值优点：敏感性高，客观性强，重复性好。优
38、点：敏感性高，客观性强，重复性好。缺点缺点(qudin)：但需一定设备条件，同时还存：但需一定设备条件，同时还存在放射性核素污染问题在放射性核素污染问题。第八十四页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用CCK8法法 (Cell Counting Kit 8)外周血或分离外周血或分离(fnl)的淋巴细胞的淋巴细胞PHA共培养共培养DNA合成合成(hchng)增加增加CCK-8存活存活细胞细胞(xbo)内线粒体脱氢还原酶内线粒体脱氢还原酶还原还原CCK-8水溶性、黄色甲躦颗粒水溶性、黄色甲躦颗粒光密度值光密度值酶标仪第八十五页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用MTT法法CFSE染色检测染色
39、检测(jin c)淋巴细胞增殖淋巴细胞增殖第八十六页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用(2) T细胞分泌细胞分泌(fnm)功能测定功能测定体外培养的体外培养的T细胞经各种丝裂原或抗原刺激细胞经各种丝裂原或抗原刺激后后,分泌各种细胞因子分泌各种细胞因子,可借助免疫学、细胞可借助免疫学、细胞生物学及分子生物学技术分别检测细胞因子生物学及分子生物学技术分别检测细胞因子含量、生物学活性或基因表达水平，以反映含量、生物学活性或基因表达水平，以反映(fnyng)T细胞功能。细胞功能。第八十七页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用(3)T细胞细胞(xbo)介导的细胞介导的细胞(xbo)毒实毒实验验
40、T细胞介导的细胞毒性是致敏的T细胞再次遇相应靶细胞抗原，可表现出对靶细胞的破坏和溶解作用。评价机体细胞免疫水平；测定肿瘤患者CTL杀伤肿瘤细胞的能力，常作为判断预后和观察疗效的指标之一；选用适当的靶细胞，常用可传代的已建株的人肿瘤细胞如人肝癌、食管癌、胃癌等细胞株，经培养(piyng)后制成单个细胞悬液，按一定比例与受检的淋巴细胞混合，共温一定时间，观察肿瘤细胞被杀伤情况。第八十八页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用A.原理原理(yunl)：靶细胞抗原靶细胞抗原(kngyun)(kngyun)T细胞细胞(xbo)观察杀伤活力观察杀伤活力致敏致敏CTL靶细胞靶细胞第八十九页，共一百一十五页
41、。流式细胞术的原理和应用形态学方法：淋巴细胞形态学方法：淋巴细胞+肿瘤细胞肿瘤细胞 计数残留肿瘤细胞计数残留肿瘤细胞同位素法同位素法 ：淋巴细胞（：淋巴细胞（CTL）+含含51Cr 的肿瘤细胞的肿瘤细胞 肿瘤细胞破坏肿瘤细胞破坏 51Cr 释放释放 测定测定(cdng)射线射线B.方法方法(fngf)意义：意义： 肿瘤患者肿瘤患者CTL杀伤杀伤(shshng)肿瘤细胞的能力肿瘤细胞的能力 第九十页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用图图15-2 T15-2 T细胞细胞毒试验示意图细胞细胞毒试验示意图第九十一页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用（4 4）体内）体内(t ni)(t ni
42、)试验试验特异性抗原特异性抗原(kngyun)皮肤试验皮肤试验PHA皮肤试验皮肤试验第九十二页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用2. B细胞细胞(xbo)功能检测功能检测B细胞增殖能力的试验细胞增殖能力的试验B细胞抗体形成功能细胞抗体形成功能(gngnng)的检测的检测体内试验体内试验第九十三页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用(1) B细胞细胞(xbo)增殖能力检测增殖能力检测抗抗IgM细菌细菌(xjn)脂多糖脂多糖SPAB细胞细胞(xbo)增殖增殖形态学形态学3 3H HTdRTdR掺入法掺入法第九十四页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用（2）体外抗体）体外抗体(kngt
43、)形成细胞检测形成细胞检测微量溶血分光光度法测定抗体形成微量溶血分光光度法测定抗体形成(xngchng)细细胞胞QHS 溶血空斑实验 PFC液相小室法液相小室法 固相琼脂法固相琼脂法ELISPOT检测特异性抗体形成细胞功能 第九十五页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用溶血溶血(rn xu)空斑试验空斑试验又称为又称为PFC（Plaque forming cell）测定技术，是一种体外检测(jin c)单个抗体形成细胞（浆细胞）的方法。 分为直接溶血空斑试验和间接溶血空斑试验 ；直接溶血空斑试验：测定产生 IgM 型抗体的细胞，只加细胞和补体 ；间接溶血空斑试验：检测产生 IgG 或 Ig
44、A的细胞，加靶细胞、显斑剂、补体；显斑剂：抗各类 Ig 高纯度的抗血清第九十六页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用原理原理(yunl)将经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞与一定量的绵羊红细胞（靶细胞）混合，在补体将经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞与一定量的绵羊红细胞（靶细胞）混合，在补体参与下，使抗体形成细胞周围参与下，使抗体形成细胞周围(zhuwi)(zhuwi)结合了抗体分子的羊红细胞溶解形成肉眼可结合了抗体分子的羊红细胞溶解形成肉眼可见的溶血空斑。见的溶血空斑。 第九十七页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用溶血空斑试验主要用于测定药物和手术等因溶血空斑试验主要用于测定药物和手术等因素素
45、(yn s)对体液免疫功能的影响对体液免疫功能的影响;评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗体的评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗体的能力。能力。第九十八页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用B细胞抗体细胞抗体(kngt)形成功能的检测形成功能的检测 酶联免疫斑点法酶联免疫斑点法第九十九页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用该方法既可检测抗体分泌细胞该方法既可检测抗体分泌细胞(xbo)，又可检，又可检测抗体分泌量。测抗体分泌量。优点：优点：稳定、特异、抗原用量少；稳定、特异、抗原用量少；可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量；可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量；可检测组
46、织切片中分泌抗体的单个细胞。可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。第一百页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用(4)(4)体内体内(t ni)(t ni)实验实验体内抗体产生的特异性抗原体内抗体产生的特异性抗原(kngyun)有白喉类毒素、破伤风有白喉类毒素、破伤风类毒素、多价肺炎链球菌菌苗等。类毒素、多价肺炎链球菌菌苗等。将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免疫后疫后1周、周、2周、周、3周分别采血，分离血清，测定受检者周分别采血，分离血清，测定受检者免疫前后相应抗体的效价，判断受检者体内免疫前后相应抗体的效价，判断受检者体内B细胞的功细胞
47、的功能。能。第一百零一页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用染色染色(rns)(rns)计数计数离心离心(lxn)取上清取上清测测LDH或或AKP离心取沉淀离心取沉淀测活细胞测活细胞(xbo)荧光荧光测发光强度测发光强度测测CPM值值形态法形态法酶释法酶释法荧光法荧光法同位素法同位素法化学发光法化学发光法3、NK细胞活性测定细胞活性测定靶靶细细胞胞溶溶解解常用靶细胞常用靶细胞: K562细胞株第一百零二页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用（二）吞噬细胞功能（二）吞噬细胞功能(gngnng)检测检测吞噬细胞的吞噬活动大体分为吞噬细胞的吞噬活动大体分为趋化趋化、吞噬吞噬和和胞内杀灭胞内杀
48、灭作用作用(zuyng)(zuyng)三个阶段，据此建立相应三个阶段，据此建立相应的检测方法的检测方法中性粒细胞功能检测技术中性粒细胞功能检测技术巨噬细胞功能检测技术巨噬细胞功能检测技术第一百零三页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用1.1.中性中性(zhngxng)(zhngxng)粒细胞的功能检测粒细胞的功能检测细胞趋化功能的检测细胞趋化功能的检测(jin c)(jin c)吞噬和杀菌功能的检测吞噬和杀菌功能的检测第一百零四页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用(1) 细胞细胞(xbo)运动功能运动功能趋化功能检测趋化功能检测原理原理(yunl)(yunl)：第一百零五页，共一百一
49、十五页。流式细胞术的原理和应用方法方法(fngf)(fngf)：琼脂糖平板琼脂糖平板(pngbn)(pngbn)法法 滤膜渗透法（滤膜渗透法（Boyden 小室法）小室法）第一百零六页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用(2)(2)吞噬和杀菌功能吞噬和杀菌功能(gngnng)(gngnng)测定测定显微镜检查法：显微镜检查法：第一百零七页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用NBT还原还原(hun yun)试验试验硝基蓝四氮唑，又称四唑氮蓝(nitroblue tetrazolium, NBT)，是一种水溶性的淡黄色活性染料，可被中性粒细胞的酶还原为非水溶性的蓝黑色甲月替(Formaza
50、n)颗粒,沉淀于胞浆内；细菌、真菌和寄生虫感染时，中性白细胞还原NBT的能力增高；病毒性感染或非感染性疾病则不增高；NBT还原试验作为诊断全身性感染的一种辅助方法，并作为判定嗜中性白细胞杀菌功能的指标，以诊断吞噬(tnsh)功能缺陷症。第一百零八页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用2、巨噬细胞功能、巨噬细胞功能(gngnng)检测检测炭粒廓清试验炭粒廓清试验： 正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90%炭粒，炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除脾巨噬细胞约吞噬清除10%炭粒。据此给小炭粒。据此给小鼠定量静脉注射印度墨汁鼠定量静脉注射印度墨汁(炭粒悬液炭粒悬液)，间隔，间隔一
51、定时间反复取静脉血，测定血中炭粒的浓一定时间反复取静脉血，测定血中炭粒的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速度，判断度，根据血流中炭粒被廓清的速度，判断(pndun)巨噬细胞的功能。巨噬细胞的功能。第一百零九页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用（2 2）吞噬吞噬(tnsh)(tnsh)功能检测功能检测巨噬细胞对颗粒性抗原物质(wzh)具有很强的吞噬功能，常用鸡红细胞(CRBC)、白色念珠菌、酵母细胞等作为吞噬颗粒，用斑蟊敷贴法收集人巨噬细胞或从腹腔渗出液获得鼠巨噬细胞。第一百一十页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用（3）巨噬细胞溶酶体酶的测定）巨噬细胞溶酶体酶的测定(cdng) 酸性磷酸
52、酶的测定酸性磷酸酶的测定 硝酸铅法硝酸铅法 偶氮法偶氮法非特异性酯酶的测定非特异性酯酶的测定 常用常用(chn yn)-萘醋酸法萘醋酸法第一百一十一页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用（4 4）细胞毒作用）细胞毒作用(zuyng)(zuyng)测定测定用用IFN-激活小鼠巨噬细胞，观察其对激活小鼠巨噬细胞，观察其对125I-UdR标记标记(bioj)的的DBA/2小鼠肥大细胞瘤小鼠肥大细胞瘤P815的杀伤活性。的杀伤活性。第一百一十二页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用（三）临床（三）临床(ln chun)应用应用反映机体免疫功能状态。反映机体免疫功能状态。肿瘤、免疫缺陷病等疾病的
53、诊断和疾病预后肿瘤、免疫缺陷病等疾病的诊断和疾病预后监测。监测。组织器官移植后对受者的细胞免疫学功能监组织器官移植后对受者的细胞免疫学功能监测则有利于排斥反应的早期发现，以便及时测则有利于排斥反应的早期发现，以便及时(jsh)采取有效措施。采取有效措施。第一百一十三页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用thank you第一百一十四页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用内容(nirng)总结细胞因子及免疫细胞功能检测方法简介。mRNA-cDNA-PCR。Ct值=17（第17个循环时，荧光信号强度达到域值）。结果判定融解曲线。（3）qPCR结果分析相对定量解析。优点：分析简单，实验(shyn)优化相对简单。结论：JUN处理后表达水平是处理前的5.3倍。待测品单位数=S/A标准品单位。未转化和转化淋巴细胞的形态特征。微量溶血分光光度法测定抗体形成细胞QHS。溶血空斑实验(shyn) PFC液相小室法第一百一十五页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用
