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1、1-20 度冻存 1 年是没有问题的，当然越低越好。但是冻存后，用蛋白酶K 法，红细胞不易裂解，必须采用特殊方法裂解。2建议裂解红细胞后再冻存于80 度。因为冻融后红细胞会裂解，而且红细胞会增加蛋白污染，影响 DNA 抽提3我们实验室加ACD 抗凝血液，保存保存 3 年了，抽提DNA 没问题（我们是先离心后分层保保存存，以便后续试验） ！血 DNA 提取技术分离外周血白细胞提取方法：试验步骤：1、取人肘静脉血 5ml，EDTA抗凝，2500rpm 离心 10min。2、小心吸取上层血浆，分装到3 个 0.5ml 离心管中。3、在血细胞中加入 3 倍体积的溶血液，摇匀，冰浴15min。4、250
2、0rpm 离心 10min，弃上清。5、加入 10ml 溶血液，摇匀，冰浴 15min。6、3000rpm 离心 10min，弃上清。7、倒置离心管，去掉残液。8、得白细胞，80?C 冻存。试验要求：血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h，4放置不超过 5h，以防白细胞自溶。氯仿法抽提外周血白细胞基因组DNA：试验试剂：Ligsisbuffer：133mMNH4ClNHCl7.12g0.9mMNH4HCO3NH4HCO30.071g0.1mMEDTA0.5mMEDTA0.2ml ；最后加灭菌去离子水至 1000ml，高压灭菌。ACD 抗凝剂：柠檬酸 1.68g 柠檬酸钠 4.62g 葡
3、萄糖 5.15g；最后加灭菌去离子水至 350ml，高压灭菌。提取缓冲液（Extractionbuffer） ：10mMTrisCl(PH=8.0)1MTris.Cl(PH=8.0)1ml0.1mMEDTA(PH=8.0)0.5mMEDTA(PH=8.0)20ml0.5%SDS10%SDS0.5ml；最后加灭菌去离子水至 100ml，高压灭菌试验步骤：1、在 500l 抗凝血中加入 ligsisbuffer1000l，充分颠混至清亮。以 4000rpm，离心 5min。弃上清液。2、沉淀中加入 ligsisbuffer1500l，充分匀浆。以 6000rpm，离心 5min。3、彻底弃去上清，
4、加入 extractionbuffer500l（裂解细胞） ，混匀置于 37，水溶 1h。4、加入 8l 的蛋白酶 K，颠混，37过夜（或 55，3h，但是 37效果要好些） 。5、每管加入 450l 饱和酚（取溶液下层）缓慢摇晃10min，以 5500rpm，离心 15min。6、取上清，每管加入250l 饱和酚和 250l 氯仿异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。7、取上清，每管加入 500l 氯仿异戊醇，摇匀 10min，以 5500rpm，离心 15min。8、取上清，每管加50l 的 3M 的 NaAC，适量无水乙醇（预冷）至满，摇匀放入 -20保保存存 2h
5、以上。9、以 12000rpm，离心 20min。去上清，加入 70乙醇 500l，以 12000rpm，离心 5min，去上清，5060干燥。10、加入 50l 灭菌去离子水，转弹，混匀。NaI 提取法提取外周血白细胞基因组：实验步骤：1、取外周抗凝血（全血）100ul 于 eppendorf 管中，12000rpm 离心 12min。2、弃上清，加双蒸水 200ul 溶解，摇匀 20s。3、混匀后加 6MNaI 溶液 200ul，摇匀 20s。4、加入氯仿/异戊醇（24：1）400ul，边加边摇，摇匀 20s，12000rpm 离心 12min。5、取上层液350ul，加入另一新eppen
6、dorf 管中，加0.6 倍体积异丙醇，摇匀20s，室温放置15min，静置后的反应体系 15000rpm 离心 12min，使沉淀紧贴 eppendorf 管壁。6、弃异丙醇，加 70乙醇 1ml（不振动） ，以 15000rpm 离心 12min。7、弃乙醇，敞开 eppendorf 管盖，烘干（37恒温箱）后，加 1xTE 溶液 30ul，溶解 DNA12h 以上，制成的 DNA 液-20冰箱保存保存备用。从外周血提取 DNA 是一个经常遇到的问题， 当然可以用试剂盒提取， 不过代价还是有点大，并且不方便，定试剂总要等上几天，如果血液标本不稀缺资源，不妨用一些简便方法提取。方法一(1)
7、取抗凝血 5ml 在沉淀中加入 15ml PBS，混匀，离心 2000r/min10min。(2) 将血浆转至新的试管中，-70保存保存。(3) 将血细胞转入另一支试管中(10ml 或 50ml)加入尽可能多的冷的蒸馏水混匀。(4) 将其插入冰内 510min 或放入-2015min。(5) 将上述混合液从冰中或-20取出放至室温，离心 2000r/min20min。弃上清，收集沉淀。(7) 在沉淀中加入 15ml PBS，混匀，离心 2000r/min10min。此步骤重复 3 次至沉淀为淡红色或白色。将沉淀转入小管，加少量PBS，每分钟 5000r/min 离心 5min，去上清。(9)沉
8、淀-70保存保存。常用的外周血白细胞基因提取方法：试验原理：苯酚/氯仿提取 DNA 是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解，在蛋白酶 K、EDTA 的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使 DNA 从核蛋白中游离出来。DNA 易溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团， 也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层， 使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。 当有机溶液存在时， 蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。离心后有机溶剂在试管底层(有机相)，DNA 存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间。酚-氯
9、仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质。氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去 DNA 溶液中的酚。抽提后的 DNA 溶液用 2 倍体积的无水乙醇在1/103mol/LNaCl 存在下沉淀 DNA， 回收 DNA 用 70%乙醇洗去 DNA 沉淀中的盐， 真空干燥，用 TE 缓冲液溶解 DNA 备用。试验步骤：1、将 1mlEDTA抗凝贮冻血液于室温解冻后移入 5ml 离心管中，加入 1ml 磷酸缓冲盐溶液（PBS） ，混匀，3500rpm 离心 15min,倾去含裂解红细胞的上清。重复一次。用 0.7mlDNA提取液混悬白细胞沉淀，37水浴温育 1h。2、将上述DNA 提取液混悬白细胞，37水浴
10、温育 1h 后，加入1mg/ml 蛋白酶 K0.2ml,至终浓度为 100-200ug/ml,上下转动混匀，液体变粘稠。 50水浴保温 3h，裂解细胞，消化蛋白。保温过程中，应不时上下转动几次，混匀反应液。3、反应液冷却至室温后，加入等体积的饱和酚溶液，温和地上下转动离心管 5-10min，直至水相与酚相混匀成乳状液。5000rpm 离心 15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。 重复酚抽提一次。 加等体积的氯仿： 异戊醇 （24： 1） ， 上下转动混匀， 5000rpm离心 15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复一次。4、加入 1/5 体积
11、的 3mol/LNaAc 及 2 倍体积的预冷的无水乙醇，室温下慢慢摇动离心管，即有乳白色云絮状 DNA 出现。 用玻璃棒小心挑取云絮状的DNA， 转入另一 1.5ml 离心管中，加 70%乙醇 0.2ml，以5000rpm 离心 5min。洗涤DNA，弃上清，去除残留的盐。重复一次。室温挥发残留的乙醇，但不要让 DNA 完全干燥。加 TE 液 20ul 溶解 DNA,置于摇床平台缓慢摇动，DNA 完全溶解通常需 12-24h。制成的 DNA 液-20冰箱保存保存备用。真核细胞 DNA 的制备一般真核细胞基因组DNA 有 107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温 保存保存的组织细胞中提取
12、，常是采用在EDTA以及 SDS 等试剂存在下用蛋白酶K 消化细胞，随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA 不仅经酶切后可用于Southern 分析，还可用于PCR 的模板、文库构建等实验。根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的 DNA 提取方法大体类似，但都应考虑以下两个原则：1、防止和抑制 DNase 对 DNA 的降解。2、尽量减少对溶液中DNA 的机械剪切破坏。试剂准备：1、TE:10mMTris-HCl(pH7.8);1mMEDTA(pH8.0) 。2、TBS:25mMTris-HCl(pH7.4);200mMNaCl;5mMKCl。3、裂解缓冲液：250mMSDS;使
13、用前加入蛋白酶 K 至 100mg/ml。4、20%SDS5、2mg/ml 蛋白酶 K6、Tris 饱和酚（pH8.0） 、酚/氯仿（酚氯仿=11） 、氯仿7、无水乙醇、75%乙醇试验步骤：材料处理：1、新鲜或冰冻组织处理：1)取组织块 0.3-0.5cm3,剪碎，加 TE0.5ml，转移到匀浆器中匀浆。2)将匀浆液转移到 1.5ml 离心管中。3)加 20%SDS25ml，蛋白酶 K(2mg/ml)25ml，混匀。4)60C 水浴 1-3hr。2、培养细胞处理：1)将培养细胞悬浮后，用TBS 洗涤一次。2)离心 4000g5min，去除上清液。3)加 10 倍体积的裂解缓冲液。4)50-55
14、C 水浴 1-2hr。DNA 提取：1、加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀3min。2、离心 5000g10min，取上层水相到另一 1.5ml 离心管中。3、加等体积饱和酚，混匀，离心5000g10min，取上层水相到另一管中。4、加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心5000g10min，取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。5、加等体积氯仿，轻轻混匀，离心5000g10min，取上层水相到另一管中。6、加 1/10 体积的 3M 醋酸钠（pH5.2）和 2.5 倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。7、待絮状物出现后，离心5000g5min，弃上清液。8、沉淀用 75
15、%乙醇洗涤，离心 5000g3min，弃上清液。9、室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加50-100mlTE 溶解过夜。、 全血的采集保存保存和 DNA 的提取I.用 含抗凝剂的采血管进行采血，抗凝剂一般有EDTA和肝素，EDTA更好一些，不会影响下游的反应，如果没有采血管，也可以自己添加抗凝剂EDTA，提前准 备 0.04M 的EDTA 溶液，每 5ml 的血液中加入 0.4ml 配好的 EDTA 溶液，颠倒混匀即可。保存保存于-20至-80，一般 2-3 年内均可以提取，保存保存时间越短，提取的质量越高，最好在 2 个月内提取。II.DNA 提取方法的选择：全血提取试剂盒一般有离心柱和溶液型
16、两种（比如Qiagen、Promega、Bioteke；摒弃酚氯仿手提的方法，时间长毒性大） ，原理及步骤基本相同。虽然各公司推出了 N 多型号，让人不知如何去选择，但从原理 和操作步骤看，基本就是离心柱和溶液型两种。一般来说，离心柱（DP1801）的提取纯度高一些， 但是处理量小（0.1-1ml） 、得率略低；溶液型 （DP2101 或 DP2201）的提取量大（1-10ml）得率也高于离心柱。医院的血液标本一般在 2ml 以上，一般选择溶液型的方法提取.在说到国产和 进口差别的时候，很多人以为进口一定比国产的好， 我们觉得没有最好，只有更好！在不断的进行试验优化之后，全血基因组 DNA 提
17、取试剂盒 DP2101 或 DP2201 开创了第三代技术，不需要蛋白酶K消化，进口的都是要借助蛋白酶K 的啊！DP2101 或 DP2201 减少了蛋白酶 K 现配现用的麻烦和消化的时 间，而且提取量和稳定性更好。III.非抗凝血（凝固血）能否提取？答案是肯定的，而且一点都不麻烦，提取效果和抗凝血没有差别！在你找遍了进口的所有品牌都找不到后，回过头来您才发现原来他就在身边，百泰克的凝固血基因组DNA 提取试剂盒已经有很多忠实的用户。下在是网上找的一般保存下在是网上找的一般保存 DNADNA的方法的方法DNA 在如下情况下稳定：（1）中性 pH，（2）低温，可以储存于-20 度冰箱，（3）暗处
18、（避免紫外线），（4）合适的盐浓度（比如 100mmol/LNaCl），（5）无物理剪切。在 DNA 操作中应该降低 DNase 对于 DNA 的降解， 大部分 DNase 降解 DNA 时要有二价阳离子（如Mg2+，Ca2+），可以加入EDTA 进 DNA 溶液。还有要避免来自细菌和土壤溶液的污染物，其中很可能有 DNase。有三种缓冲溶液可用于溶解或保存 DNA:(1)TET10E1:10mmol/L Tris.HCl(pH=8.0),1mmol/LEDTA(pH=8.0)；(2)0.1*TE(用于酶促反应）；(3)T50ET50E:50mmol/L Tris.HCl(pH=8.0),1mmol/LEDTA(pH=8.0)。用于溶解pH 不稳定的 DNA。降解的问题跑胶就很容易判断了，保存的 TE 或者 ddH2O 都要灭菌的，不然冻-20 还是容易降解。
