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1、紫外可见分光光紫外可见分光光度法度法n紫紫外外可可见见分分光光光光度度法法(UV-VIS)(UV-VIS)操操作作简简便便、快快速速、准准确确度度较较高高，同同时时由由于于仪仪器器价价格格相相对对较较低低，因因此此在在体体内内药药物物分分析析中应用广泛。中应用广泛。n但但由由于于该该方方法法不不具具备备分分离离能能力力，使使得得其其专专属属性性在在体体内内药药物物的的测测定定中中受受到到一一些些影影响响，但但如如能能配配合合适适当当的的分分离离手手段段，如如溶溶剂剂提提取取或或层层析析分分离离，或或采采用用一一些些特特殊殊的的分分离离测测试试手手段段仍仍可可以以使使专专属属性性得得到到大大大大
2、改改善善。因因此此当当体体内内药药物物浓浓度度达达到到比比ggmlml水水平平且且能能采采取取正正确确、合合理理的的分分离离手手段段时时，分分光光光度法仍然是一个可行的、较好的测定方法光度法仍然是一个可行的、较好的测定方法。原理：原理：原理：原理：n紫紫外外可可见见分分光光光光度度法法的的定定量量依依据据是是BeerBeerLambertLambert定定律律。A A-1gT-1gTECL,ECL,由由此此看看出出，吸吸收收度度与与浓浓度度(C)(C)或或液液层层厚厚(L)(L)成成正正比比关关系系，当当溶溶液液浓浓度度C C一定时，一定时，A A与与E E成正比成正比. .n因因此此在在定定
3、量量分分析析中中，尽尽可可能能选选E E值值较较大大的的波波长长处处测测定定以以提提高高测测定定的的灵灵敏敏度度，如如果果溶溶液液中中同同时时存存在在两两种种或或两两种种以以上上吸吸光光物物质质时时，只只要要共共存存物物不不互互相相影影响响也也不不改改变变各各自自本本身身的的吸吸收收系系数数，则则溶溶液液的的吸吸收收度度是是各各组组分分吸吸收收度度的的加加和和，各各组组分分的的吸吸收收度度由由各各自的浓度与吸收系数所决定。自的浓度与吸收系数所决定。n物物质质对对光光吸吸收收的的加加和和性性是是测测定定混混合合组组分分的的依依据据。当当溶溶液液中中有有干干扰扰测测定定的的物物质质存存在在时时，如
4、如不不采采用用特特殊殊测测定定技技术术将将干干扰扰组组分分消消除除，就就必必须须采采取取分分离离手手段消除干扰，否则无法得出被测药物的准确含量段消除干扰，否则无法得出被测药物的准确含量。常用样本处理方法：常用样本处理方法：常用样本处理方法：常用样本处理方法：n液液-液液萃萃取取 ：血血液液中中的的一一些些成成分分常常在在250一一270nm有有吸吸收收，如如不不经经处处理理会会对对测测定定造造成成干干扰扰，因因此此在在测测定定前前应应采采用用必必要要的的分分离离技技术术消消除除干干扰扰。液液液液萃萃取取技技术术在在分分光光光光度度法法中中应应用用较较多多，根根据据样样品品中中干干扰扰物物质质的
5、的多多少少及及所所用用有有机机溶溶剂剂分分离离能力的强弱，可采用一次或二次提取的方法。能力的强弱，可采用一次或二次提取的方法。n一一般般情情况况下下二二次次萃萃取取的的回回收收率率较较一一次次萃萃取取低低，但但样样本本净净化化好好，并并可可以以通通过过调调节节测测定定液液的的pH值值改改变变被被测测物物的的吸吸收收光光谱谱，使使之之避避开开干干扰扰，所所以以二二次次萃萃取取的的方方法法在在HPLC上上及及GC法法中中相相对对运运用用较较少少，而而在在紫紫外外-可可见见分分光光光光度度法法中中相相对对应用较多。应用较多。n在在应应用用紫紫外外可可见见分分光光光光度度法法测测定定体体内内药药物物分
6、分析析时时究究竟竟采采用用一一次次提提取取还还是是二二次次提提取取，应应根根据据被被测测药药物物浓浓度度、所所用用有有机溶剂提取能力的强弱、分析方法的专属性等全面考虑。机溶剂提取能力的强弱、分析方法的专属性等全面考虑。n萃萃取取后后化化学学衍衍生生化化：前前面面曾曾提提到到分分光光光光度度法法不不具具备备分分离离能能力力、在在休休内内药药物物的的测测定定中中如如采采用用化化学学衍衍生生化化技技术术可可以以改改变变被被测测物物的的结结构构并并使使光光谱谱发发生生变变化化，避避开开内内源源性性物物质质的的干干扰扰，提高测定方法的专属性、准确性及灵敏度。提高测定方法的专属性、准确性及灵敏度。 n固固
7、相相萃萃取取：20世世纪纪70年年代代初初开开始始应应用用，样样本本制制备备时时间间短短、所所需需样样本本量量少少、不不会会发发生生乳乳化化且且便便于于自自动动化化操操作作，所所以以近近几年发展很快。几年发展很快。n举举例例：固固相相萃萃取取-紫紫外外导导数数光光谱谱法法测测定定生生物物检检材材中中安安眠眠酮酮含量含量 仪器：日本岛律仪器：日本岛律250型紫外型紫外可见分光光度计可见分光光度计 方方法法：取取组组织织匀匀浆浆1g，2次次各各加加6高高氯氯酸酸5m1，振振摇摇，离离心心，倾倾出出并并合合并并上上清清液液。取取用用甲甲醇醇洗洗去去杂杂质质后后烘烘干干的的GDX403微微球球50mg
8、，加加甲甲醇醇约约0.3ml活活化化后后加加入入上上清清液液中中，振振荡荡30min后后将将微微球球滤滤集集于于150.5cm的的层层析析柱柱中中，用用水水30m1淋淋洗洗后后用用二二氯氯甲甲烷烷7mL洗洗脱脱，洗洗脱脱液液置置沸沸水水浴浴上上蒸蒸至至近近干干，残残留留物物用用0.1mol/L的的盐盐酸酸4ml溶溶解解，测测定定溶溶液液的的二阶导数光谱。二阶导数光谱。计算分光光度法计算分光光度法计算分光光度法计算分光光度法 n等吸收双波长消去法：等吸收双波长消去法：n原原理理：由由于于物物质质对对光光的的吸吸收收呈呈加加和和性性，当当测测定定混混合合物物时时，如如能能在在干干扰扰物物的的光光谱
9、谱上上选选择择吸吸收收度度相相等等的的两两波波长长1和和2，则则在在1和和2处处测测得得的的干干扰扰物物的的吸吸收收度度差差值值A=0；由由于于被被测测物物在在所所选选的的两两波波长长处处吸吸收收度度不不等等于于零零，因因此此在在这这两两波波长长处处测测得得的的吸吸收收度度差差值值A只只与与被被测测物物浓浓度度成成正正比比。应应用用等等吸吸收收双双波波长长消消去去法法时时，注注意意要要求求干干扰扰物物在在所所选选的的两两波波长长处处吸吸收收度度相相等等，而而被被测测物物在在这这两两波波长长处处的的A值值足足够够大大，这这样才能有较大的测定灵敏度。样才能有较大的测定灵敏度。 举例：双波长紫外分光
10、光度法测定氨茶碱血药浓度举例：双波长紫外分光光度法测定氨茶碱血药浓度 取取空空白白血血清清及及含含茶茶碱碱15gm1的的血血清清各各0. 5 m l, 按按样样品品处处理理方方法法操操作作, 提提取取液液在在分分光光光光度度计计上上扫扫描描得得各各自自的的图图谱谱, 从从图图谱谱上上看看出出,在在274 nm 处处,茶茶碱碱有有最最大大吸吸收收, 空空白白血血清清提提取取液液也也有有吸吸收收, 对对测测定定结结果果有有干干扰扰。经经测测定定空空白白血血清清在在274nm 与与298 nm 处处的的吸吸收收基基本本相相等等, 同同时时A = A 274-A 298与与血血清清中中茶茶碱碱有有良良
11、好好的的线线性性关关系系, 因因此此用用双双波波长长紫紫外外分分光光度法测定血中茶碱浓度光光度法测定血中茶碱浓度, 可消除空白血清的干扰。可消除空白血清的干扰。n导数光谱法：导数光谱法：n所所谓谓导导数数光光谱谱是是吸吸收收度度关关于于波波长长的的一一阶阶或或多多阶阶微微分分对对波波长的函数。长的函数。n为为了了与与经经典典的的紫紫外外分分光光光光度度法法区区别别，我我们们把把以以吸吸收收度度为为横横坐坐标标波波长长为为纵纵坐坐标标作作图图得得到到的的光光谱谱称称为为零零阶阶光光谱谱，把把以以吸吸收收度度的的变变化化(dA)对对波波长长变变化化(d)的的变变化化率率(dAd)对对波波长长作作图
12、图得得到到的的图图谱谱称称为为一一阶阶导导数数光光谱谱，以以此此类类推推可可得得到到更更高高阶阶数数的的导导数数光光谱谱。随随着着导导数数阶阶数数的的增增高高，峰峰的的个个数数也也增增多多，而而且且峰峰形形更更尖尖锐锐，原原函函数数上上的的一一些些特特征征，如如极极值值点点(峰峰或或谷谷)、拐拐点点等等在在各各阶阶导导数数图图像像上上都都有有相相对对应应的的更更明明确的显示，因此导数光谱可以提高分辨能力。确的显示，因此导数光谱可以提高分辨能力。n根根据据光光的的吸吸收收定定律律：ACL，一一阶阶导导数数dAdddCL 二二阶阶导导数数d2Ad2d2d2cL，依依次次类类推推，在在任任意意波波长
13、长处处，导导数数光光谱谱上上的的导导数数值值与与浓浓度度成成正正比比，这这就就是是导导数数光光谱谱定定量量的的理理论论依依据据据据。20世世纪纪60年年代代后后期期，有有了了双双波波长长分分光光光光度度计计，20世世纪纪70年年代代中中期期，微微处处理理机机被被装装配配到到了了分分光光光光度度计计上上，人人们们利利用用它它的的记记忆忆及及数数据据处处理理功功能能，可可以以直直接接描描绘绘出出一一阶阶、二二阶阶、三三阶阶、四四阶阶等等导导数数光光谱谱，这这样样就就使使得得导导数数光光谱谱的的应应用用得得到到较较快快的的发发展展。由由于于导导数数光光谱谱灵灵敏敏度度高高、分分辨辨能能力力好好，能能
14、消消除除杂杂质质干干扰扰，提提高高被被测测物物光光谱谱的的纯纯度度，作作为为一一种种紫紫外外分分光光光光度度法法的的定定量量方方法法，受受到到人人们越来越多的重视。们越来越多的重视。n差示分光光度法差示分光光度法：n差差示示分分光光光光度度法法消消除除干干扰扰是是基基于于利利用用化化学学反反应应或或改改变变溶溶液液pH值值，选选择择性性的的使使被被测测药药物物的的吸吸收收光光谱谱发发生生改改变变，而而干干扰扰物物质质不不受受化化学学反反应应或或溶溶液液的的pH值值改改变变的的影影响响，吸吸收收光光谱谱保保持持不不变变。这这样样当当样样品品池池与与参参比比池池装装有有同同样样浓浓度度的的被被测测
15、样样品品溶溶液液时时，干干扰扰物物的的吸吸收收差差值值总总是是零零，因因此此测测得得的的A值只与被测物浓度成正比。值只与被测物浓度成正比。n n举例：差示紫外分光光度法测定血清中苯巴比妥的浓度举例：差示紫外分光光度法测定血清中苯巴比妥的浓度举例：差示紫外分光光度法测定血清中苯巴比妥的浓度举例：差示紫外分光光度法测定血清中苯巴比妥的浓度 仪仪仪仪器器器器UV UV - - 120 120 紫紫紫紫外外外外分分分分光光光光光光光光度度度度计计计计( (日日日日本本本本岛岛岛岛津津津津) ) 精精精精取取取取PB PB 对对对对照照照照品品品品溶溶溶溶于于于于丙丙丙丙二二二二醇醇醇醇- - 水水水水
16、(6(6 4) 4) 的的的的溶溶溶溶液液液液中中中中配配配配制制制制成成成成1 1 mgmlmgml-1-1对对对对照照照照储储储储备备备备液液液液, ,取取取取储储储储备备备备液液液液配配配配制制制制20 20 、40 40 、60 60 、100100、200200、400400、600600、800g-1ml800g-1ml的的的的PB PB 系列对照溶液备用。系列对照溶液备用。系列对照溶液备用。系列对照溶液备用。 a: a: PB PB 游离酸游离酸游离酸游离酸 b:b: PB PB 单阴离子单阴离子单阴离子单阴离子 c:c:差示光谱差示光谱差示光谱差示光谱荧光分光光度法荧光分光光度
17、法 原理：原理：药药物物及及代代谢谢物物在在光光照照射射下下吸吸收收紫紫外外光光或或可可见见光光的的能能量量，使使外外层层电电子子由由基基态态跃跃迁迁到到较较高高能能级级的的激激发发态态。当当处处于于激激发发态态的的电电子子又又回回到到基基态态时时，可可将将这这部部分分能能量量以以光光子子形形式式发发射射出出而而产产生生荧荧光光。产产生生的的荧荧光光其其能能量量比比吸吸收收光光的的能能量量小小一一些些因此荧光的波长比照射光的波长要较长一些。因此荧光的波长比照射光的波长要较长一些。产生机理有：产生机理有：n药药物物分分子子直直接接与与斥斥电电子子基基团团(一一OH，一一NH2或或一一OCH3)联
18、联接接有有利利于于荧荧光光的的发发生生，而而与与吸吸电电子子基基团团(一一NO2，一一Br一一I，一，一CN或一或一COOH)联接则使荧光减弱。联接则使荧光减弱。n药药物物具具有有可可电电离离的的基基团团联联接接在在共共轭轭系系统统上上，则则pH值值的的选选择择将将影影响响测测定定的的灵灵敏敏度度和和选选择择性性。如如酚酚类类电电离离成成酚酚盐盐阴阴离离子子，使使荧荧光光增增强强；而而芳芳胺胺成成为为芳芳香香铵铵阳阳离离子子可可抑抑制制荧荧光光发发生。生。n药药物物分分子子结结构构中中共共轭轭体体系系增增加加双双键键，特特别别是是多多环环芳芳香香结结构构，可促使荧光增加。可促使荧光增加。n药药
19、物物分分子子结结构构中中的的芳芳环环杂杂原原子子(N、S、O属属斥斥电电子子基基)，具具有有荧荧光光性性能能，而而含含-NH2基基团团的的杂杂环环在在酸酸性性介介质质中中，由由于于N的质子化而使荧光强度增加。的质子化而使荧光强度增加。药物及代谢物的分子结构不同，所吸收光的波长药物及代谢物的分子结构不同，所吸收光的波长药物及代谢物的分子结构不同，所吸收光的波长药物及代谢物的分子结构不同，所吸收光的波长和发射的荧光波长也有所不同。利用这个待性，和发射的荧光波长也有所不同。利用这个待性，和发射的荧光波长也有所不同。利用这个待性，和发射的荧光波长也有所不同。利用这个待性，可以定性鉴别药物。可以定性鉴别
20、药物。可以定性鉴别药物。可以定性鉴别药物。 同一种分子结构的药物及代谢物，吸收同一波长同一种分子结构的药物及代谢物，吸收同一波长同一种分子结构的药物及代谢物，吸收同一波长同一种分子结构的药物及代谢物，吸收同一波长的光，则可发射出相同波长的荧光。若该药物及的光，则可发射出相同波长的荧光。若该药物及的光，则可发射出相同波长的荧光。若该药物及的光，则可发射出相同波长的荧光。若该药物及代谢物的浓度越大，则发射的荧光强度越强。利代谢物的浓度越大，则发射的荧光强度越强。利代谢物的浓度越大，则发射的荧光强度越强。利代谢物的浓度越大，则发射的荧光强度越强。利用这个性质，则可进行体液中药物浓度的定量测用这个性质
21、，则可进行体液中药物浓度的定量测用这个性质，则可进行体液中药物浓度的定量测用这个性质，则可进行体液中药物浓度的定量测定。定。定。定。 荧荧光光法法的的优优点点：测测定定灵灵敏敏度度高高，一一般般紫紫外外可可见见分分光光光光度度法法的的灵灵敏敏度度在在10-7g m1，而而荧荧光光分分光光光光度度法法的的灵灵敏敏度度可可达达10-12gml。虽虽然然能能发发荧荧光光的的物物质质数数量量不不多多，但但许许多多重重要要的的生生化化物物质质、药药物物及及其其代代谢谢物物或或致致癌癌物物质质都都有有荧荧光光现现象象。由由于于荧荧光光衍衍生生化化试试剂剂的的使使用用进进一一步步扩扩大大了了荧荧光光法法的的
22、应应用用范范围围，因因此此该该法法在在体体内内药药物物分分析析利利药药物物动动力力学学研研究究中中得得到到广广泛地应用。泛地应用。基本原理：基本原理：基本原理：基本原理：荧荧光光是是由由药药物物或或代代谢谢物物等等物物质质在在吸吸收收光光能能之之后后发发射射而而出出，因因此此溶溶液液的的荧荧光光强强度度和和该该溶溶液液吸吸收收光光能能的的程程度度以以及及溶溶液液中中荧荧光光物物质质的的荧荧光光量量子子效效率率有有关关。溶溶液液吸吸收收光光能能，即即被被入入射射光光激激发发后后，可可以以在在溶溶液液的的各各个个方方向向观观察察荧荧光光强强度度。由由于于激激发发光光的的一一部部分分被被溶溶液液吸吸
23、收收，一一部部分分被被透透透透过过过过。因因因因此此此此，在在在在透透透透射射射射光光光光的的的的方方方方向向向向观观观观测测测测荧荧荧荧光光光光是是是是不不不不适适适适宜宜宜宜的的的的，一一一一般般般般是是是是在在在在与与与与激激激激发发发发光光光光源源源源垂垂垂垂直直直直的方向观测荧光的强度。的方向观测荧光的强度。的方向观测荧光的强度。的方向观测荧光的强度。 根根据据Beer定定律律推推导导，在在浓浓度度低低时时，溶溶液液的的荧荧光光辐辐射射强强度度与与荧荧光光物物质质的的浓浓度度呈呈线线性性关关系系，可可用用下下式式表表示示： F=kC式式中中，F为为物物质质的的荧荧光光强强度度；k为为
24、常常数数：C为为溶溶液液中中荧荧光光物物质质的的浓浓度度。因因此此，荧荧光光法法定定量量的的依依据据是是荧荧光光强强度度与与浓浓度度呈呈线线性性关关系，实际测定的是荧光强度系，实际测定的是荧光强度F。 荧荧光光法法测测定定灵灵敏敏度度取取决决于于检检测测器器的的灵灵敏敏度度，目目前前所所用用的的荧荧光光检检测测器器即即使使极极微微弱弱的的荧荧光光也也能能测测到到，可可以以测测定定很很低低浓浓度度的溶液，所以荧光法的灵敏度很高。的溶液，所以荧光法的灵敏度很高。n n荧光法的定量方法荧光法的定量方法 n标标准准曲曲线线法法：用用已已知知量量的的标标准准物物质质经经过过和和供供试试品品进进行行相相同
25、同的的处处理理之之后后，配配成成一一系系列列浓浓度度不不问问的的标标准准溶溶液液在在测测定定条条件件相相同同的的情情况况下下分分别别测测定定其其荧荧光光强强度度。以以标标准准溶溶液液的的浓浓度度为为横横坐坐标标，以以相相应应的的荧荧光光强强度度为为纵纵坐坐标标，绘绘制制标标准准曲曲线线。然然后后在在相相同同条条件件下下测测定定样样品品溶溶液液的的荧荧光光强强度度，就就可可从从标标准准曲曲线线上上求求出出样样品品溶溶液液的的浓浓度度。如如果果要要求求精精确确测测定定时时可可用用回归直线方程计算样品溶液的浓度。回归直线方程计算样品溶液的浓度。n在在制制备备标标准准曲曲线线时时，常常采采用用标标准准
26、系系列列中中最最大大浓浓度度的的标标准准溶溶液液作作为为基基础础。将将空空白白溶溶液液的的荧荧光光强强度度读读数数调调至至0，将将该该标标准准溶溶液液的的荧荧光光强强度度的的读读数数调调至至100，然然后后测测定定标标准准系系列列中中其其他他各各个个标标准准溶溶液液的的荧荧光光强强度度。为为了了使使在在不不问问时时间间所所绘绘制制的的工工作作曲曲线线能能先先后后一一致致，在在每每次次测测绘绘标标准准曲曲线线时时均均采采用用同同一一标标准准溶溶液液对对仪仪器器进进行行校校正正。如如果果样样品品溶溶液液在在紫紫外外光光照照射射下下不不很很稳稳定定，则则必必须须改改用用另另一一种种稳稳定定，而而且且
27、其其发发射射光光谱与样品溶液的发射光谱相近似的标准溶液作为基础。谱与样品溶液的发射光谱相近似的标准溶液作为基础。n对照法：如果荧光的标准曲线通过零点，就可选择其线性对照法：如果荧光的标准曲线通过零点，就可选择其线性范围，用对照法进行测定。通常取已知量的纯净荧光物质，范围，用对照法进行测定。通常取已知量的纯净荧光物质，配制一标准溶液，使其浓度在线性范围之间，测定荧光强配制一标准溶液，使其浓度在线性范围之间，测定荧光强度度Fs，然后在相同条件下测定样品溶液的荧光强度然后在相同条件下测定样品溶液的荧光强度Fx。由由标准溶液的浓度和两个溶液的荧光强度比较，求得样品中标准溶液的浓度和两个溶液的荧光强度比
28、较，求得样品中荧光物质的含量。在空白溶液的荧光强度调不到荧光物质的含量。在空白溶液的荧光强度调不到0时，时，必须从必须从Fs与与Fx值中扣除空白溶液的荧光强度值中扣除空白溶液的荧光强度Fo，然后按下然后按下式计算：式计算：式中，式中，CxCx为样品溶液的浓度；为样品溶液的浓度；C sC s为标准品溶液的浓度。为标准品溶液的浓度。n n荧光分光光度法在体内药物分析中的应用：荧光分光光度法在体内药物分析中的应用：n n用荧光分光光度法测量冠心病患者血浆谷胱甘肽用荧光分光光度法测量冠心病患者血浆谷胱甘肽血血血血浆浆浆浆中中中中同同同同时时时时存存存存在在在在GSH GSH 和和和和GSSGGSSG半
29、半半半胱胱胱胱氨氨氨氨酸酸酸酸, , 先先先先直直直直接接接接测测测测血血血血浆浆浆浆中中中中GSHGSH含含含含量量量量, , 然然然然后后后后在在在在近近近近中中中中性性性性条条条条件件件件下下下下二二二二硫硫硫硫苏苏苏苏糖糖糖糖醇醇醇醇可可可可将将将将GSSG GSSG 还还还还原原原原为为为为GSH GSH , , 再再再再测测测测血血血血浆浆浆浆中中中中GSH GSH 总总总总含含含含量量量量, , 后后后后者者者者减减减减去去去去前前前前者者者者, , 即即即即为为为为血血血血浆浆浆浆中中中中GSSGGSSG含含含含量量量量。GSH GSH 同同同同时时时时含含含含有有有有伯伯伯伯
30、胺胺胺胺基基基基和和和和硫硫硫硫醇醇醇醇基基基基, , 在在在在p p H H 8-10 8-10 时时时时, ,可可可可与与与与邻邻邻邻苯苯苯苯二二二二甲甲甲甲醛醛醛醛的的的的两两两两个个个个醛醛醛醛基基基基缩缩缩缩合合合合成成成成可可可可发发发发强强强强荧荧荧荧光光光光的的的的物物物物质质质质异异异异吲吲吲吲哚哚哚哚。从从从从而而而而运运运运用用用用荧荧荧荧光光光光分分分分光光光光光光光光度度度度仪仪仪仪对对对对血血血血浆浆浆浆中中中中的的的的GSH GSH 进进进进行行行行定定定定量量量量。因因因因一一一一些些些些内内内内源源源源性性性性成成成成分分分分也也也也可可可可与与与与邻邻邻邻苯
31、苯苯苯二二二二甲甲甲甲醛醛醛醛反反反反应应应应生生生生成成成成发发发发荧荧荧荧光光光光的的的的产产产产物物物物, , 在在在在本本本本实实实实验验验验中中中中, , A A 管管管管样样样样品品品品用用用用N2N2乙乙乙乙基基基基马马马马来来来来酰酰酰酰亚亚亚亚胺胺胺胺来来来来封封封封闭闭闭闭GSH GSH 与与与与邻邻邻邻苯苯苯苯二二二二甲甲甲甲醛醛醛醛反反反反应应应应, , 因因因因而而而而可可可可以以以以认认认认为为为为A A 管管管管中中中中的的的的荧荧荧荧光光光光值值值值是是是是由由由由非非非非GSH GSH 产产产产生生生生的的的的, , 并并并并将将将将A A 管管管管作作作作为
32、为为为空空空空白白白白管管管管进进进进行行行行调调调调零零零零。由由由由于于于于在在在在p p H H 8-10 8-10 时时时时, , GSSGGSSG几几几几乎乎乎乎不不不不与与与与邻邻邻邻苯苯苯苯二二二二甲甲甲甲醛醛醛醛结结结结合合合合产产产产生生生生可可可可发发发发荧荧荧荧光光光光的的的的物物物物质质质质, , 因因因因而而而而B B 管管管管的的的的荧荧荧荧光光光光值值值值(fluorescent (fluorescent unites unites , , FU) FU) 反反反反映映映映血血血血浆浆浆浆GSH GSH 的的的的量量量量; ; 而而而而C C 管管管管减减减减去去
33、去去B B 管管管管所所所所得得得得的的的的FU FU 则则则则反反反反映映映映血血血血浆中浆中浆中浆中GSSGGSSG的量。确定波长，制作的量。确定波长，制作的量。确定波长，制作的量。确定波长，制作GSH GSH 和和和和GSSGGSSG的标准曲线的标准曲线的标准曲线的标准曲线n喂喂饲饲补补阳阳还还五五汤汤大大鼠鼠血血清清中中黄黄芪芪甲甲甙甙的的固固相相萃萃取取-化化学学衍衍生化生化-荧光分光光度法测荧光分光光度法测n仪器：仪器： 荧光分光光度计荧光分光光度计准准确确移移取取.mgml-1的的黄黄芪芪甲甲甙甙对对照照品品溶溶液液.ml于于5ml干干燥燥容容量量瓶瓶中中, 加加入入2%茴茴香香
34、酸酸乙乙醇醇溶溶液液0.6ml,再再加加入入72%硫硫酸酸溶溶液液0.8ml,摇摇匀匀,置置于于60水水浴浴中中反反应应30min.取取出出冷冷却却至至室室温温,用用无无水水乙乙醇醇定定容容至至刻刻度度,摇摇匀匀,在在RF-5000荧荧光光分分光光光光度度计计扫扫描描,得得黄黄芪芪甲甲甙甙的的激激发发光光谱谱和和发发射射光光谱谱.如如图图1.由由此此确确定定黄黄芪芪甲甲甙甙反反应应产产物物的的最最大大激激发发波波长长310nm,最最大大发发射射波波长长376nm.在在此此波波长长条条件件下下,测测定定黄黄芪芪甲甲甙甙反反应应产产物物的的荧荧光强度值光强度值,同时作空白校正同时作空白校正.n n
35、标标标标准准准准曲曲曲曲线线线线：移移移移取取取取1 1/ml/ml的的的的黄黄黄黄芪芪芪芪甲甲甲甲甙甙甙甙对对对对照照照照品品品品溶溶溶溶液液液液分分分分别别别别制制制制成成成成0.1,0.2,0.3,0.4,0.80.1,0.2,0.3,0.4,0.8和和和和1 1/ml/ml的的的的标标标标准准准准系系系系列列列列溶溶溶溶液液液液, ,各各各各取取取取0.05ml0.05ml于于于于5ml5ml量量量量瓶瓶瓶瓶中中中中, ,再再再再分分分分别别别别加加加加入入入入处处处处理理理理的的的的空空空空白白白白血血血血清清清清0.05ml, 0.05ml, 处处处处理理理理，测测测测定定定定荧荧荧荧光光光光强强强强度度度度，同同同同时时时时作作作作空空空空白白白白校校校校正正正正以以以以荧荧荧荧光光光光强强强强度度度度（Y Y）对对对对黄黄黄黄芪芪芪芪甲甲甲甲甙甙甙甙浓浓浓浓度度度度(X)(X)进进进进行行行行回回回回归归归归处处处处理理理理, ,得得得得标标标标准准准准曲曲曲曲线线线线的的的的线线线线性性性性回回回回归归归归方方方方程程程程为为为为Y=20.627X-1.8484,Y=20.627X-1.8484,相相相相关关关关系系系系数数数数r=0.9999, r=0.9999, 线线线线性性性性范范范范围围围围为为为为110 110 ggm1.m1.
