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1、微生物的实验室培养微生物的实验室培养(上课上课)微生物的类群微生物的类群原生生物：原生生物：原核生物原核生物:真菌真菌:病毒病毒:如酵母菌如酵母菌单细胞的动植物单细胞的动植物如草履虫、单细胞藻类等如草履虫、单细胞藻类等无细胞结构无细胞结构真核细胞真核细胞细菌、蓝藻细菌、蓝藻原核细胞原核细胞请你判断以下材料或用具是否需要消毒或请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1 1） 培养细菌用的培养基与培养皿培养细菌用的培养基与培养皿（2 2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管玻棒、试管、烧瓶和吸管（3 3） 实验操作者的双手实验操作者的双手2.2
2、.无菌范围：无菌范围：实验操作空间消毒实验操作空间消毒操作者的手、衣着消毒操作者的手、衣着消毒实验用具灭菌实验用具灭菌实验操作过程实验操作过程二二. .无菌技术：无菌技术：防止外来杂菌的污染防止外来杂菌的污染1.1.消毒与灭菌：消毒与灭菌：酒精灯旁操作酒精灯旁操作超净工作台超净工作台有些细菌在一定的条件下，细胞里面形有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的成一个椭圆形的休眠体休眠体，叫做芽孢。，叫做芽孢。芽芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸细菌的芽孢，煮沸3 3小时以
3、后才死亡。小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌孢又可以萌发，形成一个细菌细菌、原生动物、真菌和植物细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖作用的等产生的一种有繁殖作用的生生殖细胞殖细胞。能直接发育成新个体。能直接发育成新个体。 单个单个或少数菌体或少数菌体2.2.特征：特征：大小、形状、光泽度、大小、形状、光泽度、颜色、透明度等。颜色、透明度等。3.3.功能：功能：1.1.定义：定义：菌落菌落鉴定菌种鉴定菌种的重要依据的重要依据固体固体培养基上培养基
4、上大量繁殖大量繁殖子细胞群体子细胞群体1000ml1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方牛肉膏蛋白胨培养基的配方H2O 定容至定容至1000mlNacl 5g蛋白胨蛋白胨 10g牛肉膏牛肉膏 5g琼脂琼脂20.0g三三. .大肠杆菌的纯化培养：大肠杆菌的纯化培养：制备牛肉膏蛋白胨固体培养基制备牛肉膏蛋白胨固体培养基1.1.计算：计算：培养基用量培养基用量依配方计算各成分的用量依配方计算各成分的用量2.2.称量：称量：3.3.溶化：溶化：牛肉膏黏稠，用称量纸称取牛肉膏黏稠，用称量纸称取牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖牛肉膏、称量纸牛肉膏、称量纸 、少量水加热溶解、少
5、量水加热溶解 取纸取纸蛋白胨、蛋白胨、NaClNaCl琼脂琼脂 补水定容补水定容4.4.调调pHpH、分装、封口：、分装、封口：5.5.灭菌：灭菌：6.6.倒平板：倒平板：培养基、培养皿培养基、培养皿分散成单个细胞分散成单个细胞, ,形成单个菌落形成单个菌落倒平板倒平板约约50防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染灼烧灭菌，灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基防止瓶口的微生物污染培养基 1. 1.培养基灭菌后，需要冷却到培养基灭菌后，需要冷却到50 50 左左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？养基的
6、温度？ 答：答：可以用手触摸盛有培养基的锥形可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。时，就可以进行倒平板了。2.2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？ 答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。微生物污染培养基。3.3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？平板冷凝后，为什么要将平板倒置？4.4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培
7、养微生物吗？为什么？培养微生物吗？为什么？ 答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。 答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此之间的培养基上滋生，因此最好不要用最好不要用这个平这个平板培养微生物。板培养微生物。二二. .大肠杆菌的纯化培养：大肠杆菌的纯化培养：制备牛肉膏
8、蛋白胨固体培养基制备牛肉膏蛋白胨固体培养基纯化大肠杆菌：纯化大肠杆菌：平板划线法：平板划线法：菌种菌种划划3 3个平板个平板1 1个不划线个不划线1.1.纯化大肠杆菌的方法：纯化大肠杆菌的方法：平板划线法平板划线法和稀释涂布平板法和稀释涂布平板法接种环接种环防止划破培养基防止划破培养基（重复实验）（重复实验）（空白对照）（空白对照）平板划线法平板划线法 平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离
9、到由分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体。1 1、为什么在操作的第一步以及每次划线之前、为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？要灼烧接种环吗？为什么？操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物可能存在的微生物污染培养物杀死杀死上次残留的菌种上次残留的菌种，保证使下一次划线时，保证使下一次划线时，菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增
10、加，使每次划线时菌种的数目逐渐线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。减少，以便得到菌落。及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。环境和感染操作者。 2.2.在灼烧接种环之后，为什么要等在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。答：以免接种环温度太高，杀死菌种。 3.3.在作第二次以及其后的划线操作时，在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线为什么总是从上一次划线的末端开始划线？ 答：划线后，线条末端细菌的数目比答：划线后，线条末
11、端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。来的菌落。6 6支试管，分别加入支试管，分别加入9ml9ml无菌水无菌水1ml1011ml1021ml1031ml1041ml1051ml106稀释涂布平板法：稀释涂布平板法：a.a.梯度稀释菌液：梯度稀释菌液：菌液菌液微量微量 移移液器液器浸浸稀释涂布平板法：稀释涂布平板法：a.a.梯度稀释菌液：梯度稀释菌液：b.b.涂布平板：涂布平板：不超过
12、不超过0.1ml0.1ml各梯度分别涂布各梯度分别涂布3个平板个平板1 1个不涂布作空白对照个不涂布作空白对照滴滴灼灼涂涂稀稀释释10103 3倍倍稀稀释释10104 4倍倍稀稀释释10105 5倍倍稀释涂布法稀释涂布法 稀释涂布法是将菌液进行一系列梯度稀释，稀释涂布法是将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。养基的表面，进行培养。 涂布平板的所有操作都应在火焰附涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第菌操作要求，想一想，第
13、2 2步应如何进行步应如何进行无菌操作？无菌操作？应从操作的各个细节保证应从操作的各个细节保证“无菌无菌”。例如：酒精灯与培养皿的距离要合适、例如：酒精灯与培养皿的距离要合适、 吸管头不要接触任何其他物体、吸管头不要接触任何其他物体、 吸管要在酒精灯火焰周围等等。吸管要在酒精灯火焰周围等等。3平板划平板划线法和稀法和稀释涂布平板法的比涂布平板法的比较优点点缺点缺点适用范适用范围平板划平板划线分离法分离法可以可以观察菌落特察菌落特征，征，对混合菌混合菌进行分离行分离不能不能计数数适用于好氧菌适用于好氧菌稀稀释涂布涂布平板法平板法可以可以计数，可以数，可以观察菌落特征察菌落特征吸收量吸收量较少、少
14、、较麻麻烦，平板，平板不干燥效果不不干燥效果不好，容易蔓延好，容易蔓延适用于适用于厌氧菌氧菌和兼性和兼性厌氧菌氧菌平板划线法：平板划线法：二二. .大肠杆菌的纯化培养：大肠杆菌的纯化培养：制备牛肉膏蛋白胨固体培养基制备牛肉膏蛋白胨固体培养基纯化大肠杆菌：纯化大肠杆菌：1.1.接种：接种：稀释涂布平板法：稀释涂布平板法：2.2.培养：培养：将将接种后接种后的培养基和一个的培养基和一个未接种未接种的培养基的培养基放入放入3737恒温箱中培养恒温箱中培养12h12h24h24h后，后，观察并记录观察并记录稀稀释释10103 3倍倍稀稀释释10104 4倍倍稀稀释释10105 5倍倍（三）菌种的保藏：
15、（三）菌种的保藏：1.1.临时保藏：临时保藏： 试管固体斜面培养基上，试管固体斜面培养基上，培养长成菌落培养长成菌落44冰箱保存冰箱保存2.2.长期保存：长期保存：菌种易被污染、变异菌种易被污染、变异甘油管藏甘油管藏1ml1ml甘油（灭菌）甘油（灭菌）1ml1ml菌液菌液2020搁置斜搁置斜面面四、课题成果评价四、课题成果评价 （一）培养基的制作是否合格（一）培养基的制作是否合格 如果未接种的培养基在恒温箱中保温如果未接种的培养基在恒温箱中保温1 12 d2 d后后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。新制备。 （二）接种操作是
16、否符合无菌要求（二）接种操作是否符合无菌要求 如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。再次练习。 （三）是否进行了及时细致的观察与记录（三）是否进行了及时细致的观察与记录 培养培养12 h12 h与与24 h24 h后的大肠杆菌菌落的大小会有后的大肠杆菌菌落
17、的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。这一步的要求主要是培养学察到其他一些细微的变化。这一步的要求主要是培养学生良好的科学态度与习惯。生良好的科学态度与习惯。微微生生物物的的培培养养基础基础知识知识实验操作实验操作结果分析与评价结果分析与评价培养基培养基定义：定义：分类：分类：人们按照微生物对营养物质的人们按照微生物对营养物质的不同需求，配置出供其生长繁不同需求，配置出供其生长繁殖的营养物质殖的营养物质固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基无菌技术无菌技术培养微生物的操作中，所有防培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法止杂菌污染的方法定义：定义：消毒与灭菌消毒与灭菌常用灭菌方法常用灭菌方法制备牛肉膏蛋白胨固体培养基制备牛肉膏蛋白胨固体培养基纯化大肠杆菌纯化大肠杆菌课堂小结课堂小结试试
