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1、实实 验验 六六重组克隆子的鉴定重组克隆子的鉴定（菌落（菌落PCRPCR技术）技术）从本节课起，开始考察同学们的实验操作从本节课起，开始考察同学们的实验操作从本节课起，开始考察同学们的实验操作从本节课起，开始考察同学们的实验操作1. 1. 无菌操作：无菌操作：酒精灯的合理使用，保持枪头盒，酒精灯的合理使用，保持枪头盒，EPEP管盒的无菌，各种溶液不被污染。管盒的无菌，各种溶液不被污染。 2. 2. 独立完成实验：独立完成实验：不要随意走动串门，不要相互加不要随意走动串门，不要相互加各种溶液，不要让其他同学帮自己该做的实验。各种溶液，不要让其他同学帮自己该做的实验。3. 3. 及时做好标记：及时
2、做好标记：标记规范合理，不要搞错样品和标记规范合理，不要搞错样品和材料。材料。4. 4. 及时改正错误：及时改正错误：对于某些操作的错误，及时改正。对于某些操作的错误，及时改正。5. 5. 合理规范使用实验器材：合理规范使用实验器材：包括移液器，各种仪器包括移液器，各种仪器等。等。 实验管(1#,2#,3#) 阴性对照管(-) ddH2O 17.5L 17.5L 10xbuffer 2.5 L 2.5 L 2.0mMdNTPs 2.0 L 2.0 L Primer1 1.0 L 1.0 L Primer 2 1.0 L 1.0 L Template DNA (细枪头粘菌) Taq 1.0 L
3、1.0 L 反应总体积 25 L 25 L在在0.2ml 0.2ml EpEp管管( (标记标记) )中建立中建立25254=1004=100 l l 反应体系，再分反应体系，再分装到装到PCRPCR小管中，最后加不同的模板小管中，最后加不同的模板DNADNA（菌），混匀。（菌），混匀。细枪头粘菌：镊子取细枪头细枪头粘菌：镊子取细枪头,枪头粘枪头粘1个菌落个菌落,然后置入然后置入EP管管,用手转动枪头几圈用手转动枪头几圈,弃枪头。弃枪头。(在平板上做好标记在平板上做好标记)循环扩增：按下述程序进行扩增循环扩增：按下述程序进行扩增 95 预变性预变性 5 min 94 变性变性 45 sec 5
4、0 退火退火 45 sec 72 延伸延伸 45 sec 72 延伸延伸 5 min 30 cycles背景理论知识背景理论知识Section 1重组子鉴定可从以下水平进行：重组子鉴定可从以下水平进行：DNADNA水平：水平： 快速抽提酶切分析快速抽提酶切分析 原位杂交原位杂交 SouthernSouthern杂交杂交 DNADNA顺序分析顺序分析 PCRPCR检测检测mRNAmRNA水平：水平： RNARNA杂交杂交 反转录反转录-PCR-PCR蛋白质水平：免疫沉淀检测法蛋白质水平：免疫沉淀检测法功能水平：功能水平： 抗性反应抗性反应 显色反应显色反应 lPCR技术的发明PCR的发明是DNA
5、操作技术的革命美国Mullis教授 开汽车时的联想 逶迤崎岖的山路DNA双螺旋 行驶的汽车一小段DNA引物 1988年发明了PCR技术 1993年获得诺贝尔奖6.1.1 6.1.1 实实 验验 目目 的的学习学习PCRPCR体外扩增体外扩增DNADNA原理及引物设计的原原理及引物设计的原则则掌握掌握PCRPCR的基本操作步骤的基本操作步骤学习和掌握菌落学习和掌握菌落PCRPCR检测重组克隆子的方法检测重组克隆子的方法了解扩增过程中各因素对扩增结果的影响了解扩增过程中各因素对扩增结果的影响 聚合酶链式反应聚合酶链式反应Polymerase Chain Reaction, PCRPolymeras
6、e Chain Reaction, PCR在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增一段目的基因的技术。6.1.26.1.2【实验原理实验原理】以单链以单链DNADNA为模板、为模板、4 4种种dNTPdNTP为底物为底物, ,在模在模板板3 3末端引物存在的条件下末端引物存在的条件下, ,利用酶进利用酶进行互补链的延伸。经行互补链的延伸。经变性、退火变性、退火和和延伸延伸多次循环能使微量的模板多次循环能使微量的模板DNADNA得到极大程得到极大程度的扩增。度的扩增。6.1.26.1.2【实验原理实验原理】 模板模板DNADNA 引物引物: :与被分离的目的基因两条链各自与被分离的目的基因两条链各自
7、5 5端端 序列相互补序列相互补DNADNA（2020个左右碱基的短个左右碱基的短DNADNA单链单链) ) TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶 dNTPdNTP（dATPdATP, , dTTPdTTP, , dGTPdGTP和和dCTPdCTP） 反应缓冲液反应缓冲液典型典型PCRPCR反应体系的组成反应体系的组成6.1.26.1.2【实验原理实验原理】变性：变性：双链双链DNADNA解链解链成为单链成为单链DNADNA退火：退火：部分引物与模部分引物与模板的单链板的单链DNADNA的特定的特定互补部位相配对和互补部位相配对和结合结合延伸：延伸：以目的基因为以目的基因为模板模板, ,合成
8、互补的新合成互补的新DNADNA链链 ( (延伸时间：延伸时间：1kb/min)1kb/min)每一轮聚合酶链式反应可每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍使目的基因片段增加一倍3030轮循环可获得轮循环可获得 2 23030(1.07(1.0710109 9) )个基因片段个基因片段6.1.3 PCR6.1.3 PCR方法方法发展发展传统的传统的PCRPCR定量定量PCR(PCR(测定测定mRNAmRNA含量含量) )半定量半定量PCR (RT-PCR)PCR (RT-PCR)反向反向PCR(PCR(扩增未知序列扩增未知序列) ) 巢式巢式PCRPCR定点诱变和定点诱变和DNADNA测
9、序分析的测序分析的PCRPCR技术技术基础研究基础研究遗传病家系分析遗传病家系分析传染病诊断传染病诊断古生物及进化分析古生物及进化分析法医鉴定和考古学研究法医鉴定和考古学研究6.1.4 PCR6.1.4 PCR方法方法应用应用6.1.5 6.1.5 成功成功PCRPCR的的特点特点特异性：高度特异地产生一个扩增带特异性：高度特异地产生一个扩增带有效性：高效率，较少的循环获得较多的有效性：高效率，较少的循环获得较多的 扩增产物扩增产物忠实性：体现在由忠实性：体现在由DNADNA聚合酶诱导的错配率聚合酶诱导的错配率非常低非常低两个关键两个关键一、正确的引物设计一、正确的引物设计1.1.引物长度和引
10、物长度和GC%GC%含量含量 15-60 bp，40%-60%2.2.TmTm值：值： Tm=4(G+C)+2(A+T ) Ta=Tm - 53.3.引物的端部引物的端部 3 3端起始碱基决定特异性，错配延伸效率端起始碱基决定特异性，错配延伸效率 T T G=CG=CAA 5 5端碱基可呈游离状态，可被修饰（如加酶端碱基可呈游离状态，可被修饰（如加酶切位点，引入突变位点，插入启动子序列等）切位点，引入突变位点，插入启动子序列等） 4. 4. 引物无回文对称结构（发夹结构）引物无回文对称结构（发夹结构）5. 5. 引物自身不能配对引物自身不能配对 5 5-AGCT3-AGCT3 3 3TCGA-
11、5TCGA-5 引物二聚体（反应底物，与靶序列引物二聚体（反应底物，与靶序列竞争酶和竞争酶和dNTPdNTP）6. 6. 二引物间不能配对二引物间不能配对7. 7. 二引物的二引物的TmTm值相近值相近二、二、PCRPCR反应条件反应条件模板：模板： 质粒质粒DNADNA，扩增后的扩增后的DNADNA，cDNA cDNA ，基因组基因组DNADNA（机械剪切或稀有限制酶酶切），单链和双链，机械剪切或稀有限制酶酶切），单链和双链， 拷贝数拷贝数10102 2-10-105 5引物：引物： 常用浓度常用浓度0.1-0.5uM, 0.1-0.5uM, 分装小管保存分装小管保存dNTPdNTP 20-
12、200uM 20-200uM，4 4种种dNTPdNTP终浓度相等终浓度相等MgMg2+2+浓度浓度 0.5-2.5mM0.5-2.5mMpHpH半衰期半衰期 92.592.5 2h2h 95 95 40min 40min 97.5 97.5 5-6min 5-6min错误参入率错误参入率: : 每每2x102x104 4核苷酸中有一个核苷酸中有一个 无无3 3-5-5外切酶活性外切酶活性, ,无校对活性无校对活性3 3端加端加poly(dApoly(dA),),非模板依赖碱基非模板依赖碱基,T,T载体载体100100 L L反应体积中用量反应体积中用量0.5-5U0.5-5U最适反应温度最适
13、反应温度: 72: 726.1.6 6.1.6 TaqTaq酶酶(DNA(DNA聚合酶聚合酶) )PCRPCR反应的忠实性反应的忠实性 TaqTaq酶没有酶没有3 3-5-5的外切活性而不能自行的外切活性而不能自行校正，从而导致错掺校正，从而导致错掺l测序、定点诱变和克隆测序、定点诱变和克隆l减少错掺的对策：减少错掺的对策： 加入加入TaqTaq酶后迅速反应，避免低温下进酶后迅速反应，避免低温下进行的链延伸；酶浓度不可过大；行的链延伸；酶浓度不可过大；dNTPdNTP 不可不可过浓；过浓；MgMg2+2+浓度适中浓度适中6.1.7 PCR6.1.7 PCR平台效应平台效应定义：定义：PCRPC
14、R进行到一定次数后产物的积累由指数进行到一定次数后产物的积累由指数方式方式 向线性方式变化或反应根本停止。向线性方式变化或反应根本停止。原因：原因：1.1.酶的热失活酶的热失活2.2.抑制酶活的物质抑制酶活的物质3.3.dNTPdNTP的稳定性的稳定性4.4.非特异性片段的竞争非特异性片段的竞争5.5.模板的自身退火模板的自身退火6.6.酶与酶与dNTPdNTP的的相对减少相对减少6.1.8 6.1.8 容易污染容易污染PCRPCR反应的灵敏度高反应的灵敏度高, ,极易产生假阳性结果极易产生假阳性结果( (一一定要做阴性对照定要做阴性对照) )污染来源：污染来源： 样品污染即样品间的交叉污染样
15、品污染即样品间的交叉污染 产物污染产物污染 其它污染：环境污染和实验使用的器材试剂其它污染：环境污染和实验使用的器材试剂防治方法：防治方法：短波紫外线照射短波紫外线照射3030分钟；分钟；器皿类可用稀酸碱泡，使碱基脱嘌呤；器皿类可用稀酸碱泡，使碱基脱嘌呤；PCRPCR管、管、枪头等一次性使用；枪头等一次性使用；试剂湿热灭菌后小管分装；试剂湿热灭菌后小管分装；加模板加模板DNADNA后盖紧盖子，打开盖子前离心甩下小后盖紧盖子，打开盖子前离心甩下小液滴，再慢慢打开，防止开盖过快，形成气溶液滴，再慢慢打开，防止开盖过快，形成气溶胶。胶。每次反应都应设立阳性，阴性对照。每次反应都应设立阳性，阴性对照。
16、实验操作实验操作Section 26.2.1 6.2.1 实验材料实验材料仪器：仪器：PCRPCR扩增仪扩增仪 琼脂糖凝胶电泳系统琼脂糖凝胶电泳系统材料：材料： DNADNA模板模板 4 4种种dNTPdNTP 引物引物1 1，2 2 TaqTaq酶酶1 1、DNADNA模板的制备模板的制备( (挑取细菌沉淀挑取细菌沉淀) )2 2、引物设计与合成、引物设计与合成( (教师已做教师已做) )3 3、PCRPCR扩增扩增GFPGFP基因基因4 4、琼脂糖电泳检测、琼脂糖电泳检测6.2.2【实验步骤】1 1、DNADNA模板的制备模板的制备质粒质粒DNADNA扩增后的扩增后的DNADNAcDNAc
17、DNA基因组基因组DNA(DNA(机械剪切或稀有限制酶酶切机械剪切或稀有限制酶酶切) )重组细菌重组细菌( (本次试验本次试验DH5a/pET28a-EGFPDH5a/pET28a-EGFP) )单链和双链,拷贝数102-1052 2、本次实验引物的设计与合成、本次实验引物的设计与合成P1 XhoI5GC CTC GAG CTT GTA CAG CTC GTC CAT G3 P2 EcoRI5GC GAA TTC GTG AGC AAG GGC GAG G3上海申工生物技术有限公司3 3、PCRPCR扩增扩增GFPGFP基因基因 实验管(1#,2#,3#) 阴性对照管(-) ddH2O 17.
18、5L 17.5L 10xbuffer 2.5 L 2.5 L 2.5mMdNTPs 2.0 L 2.0 L Primer1 1.0 L 1.0 L Primer 2 1.0 L 1.0 L Template DNA (细枪头粘菌) Taq 1.0 L 1.0 L 反应总体积 25 L 25 L混合于EP管中且混匀,Short离心4 4、琼脂糖电泳检测、琼脂糖电泳检测制胶制胶: : 配置配置25ml 1%25ml 1%琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶(2(2人配一块胶人配一块胶, ,使用使用1111个小齿的梳子个小齿的梳子) )。（不知道如何配置的同学问老师）。（不知道如何配置的同学问老师）上样电泳上样电泳
19、: : 1. A1(1#) 10 1. A1(1#) 10 l l 2. A1(2#) 10 2. A1(2#) 10 l l 3. A1(3#) 10 3. A1(3#) 10 l l 4. A1(-) 10 4. A1(-) 10 l l 5. DNA 5. DNA Marker 5 Marker 5 l l 6. A2(1#) 10 6. A2(1#) 10 l l 7. A2(2#) 10 7. A2(2#) 10 l l 8. A2(3#) 10 8. A2(3#) 10 l l 9. A2(-) 10 9. A2(-) 10 l l电泳电泳:110V:110V电泳电泳30min30min。所有样品各加入所有样品各加入 2 2 l l 6 6loading bufferloading buffer，混匀后再上样。混匀后再上样。负极负极正极正极MarkerA1A2避避 免免 污污 染染低低 温温 操操 作作正确选择温度正确选择温度正确设置程序正确设置程序注意事项注意事项lPCRPCR中如果出现非特异的条带，可能是哪中如果出现非特异的条带，可能是哪 些方面出现问题，应该如何调整？些方面出现问题，应该如何调整？思思 考考 题题下下 次次 实实 验验重组克隆子的重组克隆子的酶切鉴定酶切鉴定开始工作吧！开始工作吧！LETS BEGIN NOW！
