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1、真核表达系真核表达系统统酵母酵母丝丝状真菌状真菌昆虫昆虫哺乳哺乳动动物物细细胞胞转转基因基因动动物物植物反植物反应应器器. .酵母表达系酵母表达系统统的的优优缺点缺点遗传遗传背景清楚（基因背景清楚（基因组组是大是大肠肠杆菌的杆菌的3.5倍）倍）增殖快（增殖快（90min/代），培养容易，代），培养容易，产产量量较较高高易于研究突易于研究突变变与基因功能，如构建酵母人工与基因功能，如构建酵母人工染色体等染色体等可以可以进进行行转录转录和翻和翻译译后修后修饰饰加工加工提提纯纯工工艺艺复复杂杂，成本高，制品，成本高，制品纯纯度达不到要度达不到要求，制品免疫原性差，接种求，制品免疫原性差，接种剂剂量大
2、量大. .酵母酵母载载体的基本体的基本结结构构DNA复制起始区：复制起始区：2质质粒和自主复制序列粒和自主复制序列选择标记选择标记：营营养缺陷型和养缺陷型和显显性性选择选择（抗（抗药药）整合介整合介导导区：同源重区：同源重组组，决定整合位置和拷，决定整合位置和拷贝贝数数有有丝丝分裂分裂稳稳定区：帮助定区：帮助载载体平均分配体平均分配表达盒表达盒转录转录转录转录启启启启动动动动子子子子终终终终止子止子止子止子分泌信号序列分泌信号序列分泌信号序列分泌信号序列. .酵母表达系酵母表达系统统中中载载体的种体的种类类按按载载体在酵母中的复制形式分体在酵母中的复制形式分为为：YIp：酵母整合型酵母整合型载
3、载体体YRp：酵母自主复制型酵母自主复制型载载体体YCp：酵母含着酵母含着丝丝粒片段粒片段载载体体YEp：酵母附加体型酵母附加体型载载体体YAC：酵母人工染色体酵母人工染色体. .昆虫表达系昆虫表达系统统杆状病毒基因杆状病毒基因杆状病毒基因杆状病毒基因组组组组：闭环闭环闭环闭环双双双双链链链链DNADNA，88-166kb88-166kb启启启启动动动动子：杆状病毒科核多角体病毒的多角蛋白子：杆状病毒科核多角体病毒的多角蛋白子：杆状病毒科核多角体病毒的多角蛋白子：杆状病毒科核多角体病毒的多角蛋白强强强强启启启启动动动动子子子子表达系表达系表达系表达系统统统统杆状病毒表达系杆状病毒表达系杆状病毒
4、表达系杆状病毒表达系统统统统（BEVSBEVS）家蚕核型多角体病毒家蚕核型多角体病毒家蚕核型多角体病毒家蚕核型多角体病毒- -家蚕表达系家蚕表达系家蚕表达系家蚕表达系统统统统宿主：宿主：宿主：宿主：鳞鳞鳞鳞翅目、膜翅目、双翅目、鞘翅目、直翅目、翅目、膜翅目、双翅目、鞘翅目、直翅目、翅目、膜翅目、双翅目、鞘翅目、直翅目、翅目、膜翅目、双翅目、鞘翅目、直翅目、脉翅目、毛翅目的脉翅目、毛翅目的脉翅目、毛翅目的脉翅目、毛翅目的600600多种昆虫多种昆虫多种昆虫多种昆虫克隆基因方法：克隆基因方法：克隆基因方法：克隆基因方法：转转转转移移移移载载载载体体体体共共共共转转转转染染染染同源重同源重同源重同源
5、重组组组组空空空空斑斑斑斑筛选筛选筛选筛选纯纯纯纯化化化化重重重重组组组组病毒病毒病毒病毒. .杆状病毒表达系杆状病毒表达系统优统优点点容量大：能插入容量大：能插入12kb的外源基因的外源基因高表达：高表达：polh基因启基因启动动子是目前所知的最子是目前所知的最强强的真核启的真核启动动子；子；产产物物对对宿主影响小；宿主影响小；产产物可物可结结晶晶高效：可同高效：可同时时表达多个基因表达多个基因安全：杆状病毒安全：杆状病毒对对脊椎脊椎动动物无病原性物无病原性具加工修具加工修饰饰功能：昆虫功能：昆虫细细胞胞较较高等高等家蚕易家蚕易饲饲养养. .哺乳哺乳动动物物细细胞表达表达系胞表达表达系统统常
6、用宿主常用宿主细细胞胞哺乳哺乳动动物物细细胞常用胞常用载载体体真核真核细细胞表达元件胞表达元件哺乳哺乳动动物基因物基因转转移的移的遗传标记遗传标记基因表达的基因表达的检测检测方法方法. .哺乳哺乳动动物物细细胞表达的胞表达的优优点点重重组组DNA易易转转染，染，遗传稳遗传稳定，可重复定，可重复识别识别和去除内含子和去除内含子进进行翻行翻译译后修后修饰饰磷酸化、糖基化、二硫磷酸化、糖基化、二硫磷酸化、糖基化、二硫磷酸化、糖基化、二硫键键键键、寡聚体等的形成、寡聚体等的形成、寡聚体等的形成、寡聚体等的形成、高高高高级结级结级结级结构的正确折叠构的正确折叠构的正确折叠构的正确折叠产产品的构型正确率高
7、，可被改造成品的构型正确率高，可被改造成类类人体源人体源性，免疫源性好性，免疫源性好可分泌至培养基，提可分泌至培养基，提纯纯工工艺简单艺简单，成本低，成本低可用于基因治可用于基因治疗疗. .常用宿主常用宿主细细胞胞细细细细胞名称胞名称胞名称胞名称来源来源来源来源已投放已投放已投放已投放产产产产品品品品BHK-21BHK-21地鼠幼鼠地鼠幼鼠地鼠幼鼠地鼠幼鼠肾肾肾肾凝血凝血凝血凝血因子因子因子因子CHO-K1CHO-K1中国中国中国中国仓仓仓仓鼠卵巢鼠卵巢鼠卵巢鼠卵巢tPAtPA，因子，因子，因子，因子，EPOEPO，G-CSFG-CSF等等等等C127C127小鼠乳腺小鼠乳腺小鼠乳腺小鼠乳腺肿
8、肿肿肿瘤瘤瘤瘤GHGHMDCKMDCK长长长长耳狗耳狗耳狗耳狗肾脏肾脏肾脏肾脏兽兽兽兽用疫苗用疫苗用疫苗用疫苗NamalwaNamalwaBurkittBurkitt淋巴瘤病人的淋巴瘤病人的淋巴瘤病人的淋巴瘤病人的类类类类淋巴母淋巴母淋巴母淋巴母细细细细胞胞胞胞EPOEPO，LTLT，tPAtPA，IFNIFNVeroVero成年非洲成年非洲成年非洲成年非洲绿绿绿绿猴猴猴猴肾肾肾肾HBsAgHBsAg，GHGH鼠骨髓瘤鼠骨髓瘤鼠骨髓瘤鼠骨髓瘤细细细细胞胞胞胞骨髓瘤骨髓瘤骨髓瘤骨髓瘤tPAtPA，抗体，抗体，抗体，抗体COSCOSSV40SV40转转转转化的化的化的化的绿绿绿绿猴猴猴猴肾细肾细肾
9、细肾细胞胞胞胞CD34CD34，CD69CD69，TGFTGF. .真核真核细细胞表达元件胞表达元件原核原核DNA序列序列启启动动子子 增增强强子子 拼接信号拼接信号终终止子和多聚腺苷化信号止子和多聚腺苷化信号筛选标记筛选标记动动物病毒基因序列物病毒基因序列. .原核原核DNA序列序列原核复制子原核复制子抗生素抗性基因抗生素抗性基因多克隆位点多克隆位点. .启启动动子子真核启真核启真核启真核启动动动动子：子：子：子：RNARNA聚合聚合聚合聚合酶酶酶酶（）结结结结合并起合并起合并起合并起动转录动转录动转录动转录的的的的DNADNA序列序列序列序列一般包括一般包括一般包括一般包括转录转录转录转录
10、起始点及其上游起始点及其上游起始点及其上游起始点及其上游约约约约100-200100-200bpbp序列，包序列，包序列，包序列，包含有若干具有独立功能的含有若干具有独立功能的含有若干具有独立功能的含有若干具有独立功能的DNADNA序列元件，每个元件序列元件，每个元件序列元件，每个元件序列元件，每个元件约长约长约长约长7-307-30bp bp 核心启核心启核心启核心启动动动动子元件：子元件：子元件：子元件：RNARNA聚合聚合聚合聚合酶酶酶酶起始起始起始起始转录转录转录转录所必需的最所必需的最所必需的最所必需的最小小小小DNADNA序列，包括序列，包括序列，包括序列，包括转录转录转录转录起始
11、点及其上游起始点及其上游起始点及其上游起始点及其上游-25/-30-25/-30bpbp处处处处的的的的TATATATA盒。盒。盒。盒。单单单单独起作用独起作用独起作用独起作用时时时时只能确定只能确定只能确定只能确定转录转录转录转录起始位点和起始位点和起始位点和起始位点和产产产产生基生基生基生基础础础础水平的水平的水平的水平的转录转录转录转录上游启上游启上游启上游启动动动动子元件包括通常位于子元件包括通常位于子元件包括通常位于子元件包括通常位于-70-70bpbp附近的附近的附近的附近的CAATCAAT盒盒盒盒和和和和GCGC盒、以及距盒、以及距盒、以及距盒、以及距转录转录转录转录起始点更起始
12、点更起始点更起始点更远远远远的上游元件。与相的上游元件。与相的上游元件。与相的上游元件。与相应应应应的蛋白因子的蛋白因子的蛋白因子的蛋白因子结结结结合改合改合改合改变转录变转录变转录变转录效率。不同基因具有不效率。不同基因具有不效率。不同基因具有不效率。不同基因具有不同的上游启同的上游启同的上游启同的上游启动动动动子元件子元件子元件子元件组组组组成，其位置也不相同，即不成，其位置也不相同，即不成，其位置也不相同，即不成，其位置也不相同，即不同的基因表达分同的基因表达分同的基因表达分同的基因表达分别别别别有不同的有不同的有不同的有不同的调调调调控控控控 . .哺乳哺乳类类RNA聚合聚合酶酶启启动
13、动子子中常中常见见的元件的元件 元件名称元件名称元件名称元件名称共同序列共同序列共同序列共同序列结结结结合的蛋白因子合的蛋白因子合的蛋白因子合的蛋白因子名称名称名称名称 分子量分子量分子量分子量 结结结结合合合合DNADNA长长长长度度度度 TATA boxTATA boxTATAAAATATAAAATBP 30,000 TBP 30,000 10bp 10bpGC box GC box GGGCGGGGGCGGSP-1 105,000 SP-1 105,000 20bp 20bpCAAT box CAAT box GGCCAATCT GGCCAATCT CTF/NF1 60,000 CTF/
14、NF1 60,000 22bp 22bpOctamer Octamer ATTTGCAT ATTTGCAT Oct-1 76,000 Oct-1 76,000 20bp 20bpOct-2 53,000 Oct-2 53,000 23bp 23bpk k k k B BGGGACTTTCCGGGACTTTCCNFNFk k k k B 44,000 B 44,000 10bp 10bpATFATFGTGACGTGTGACGTAFT ? 20bpAFT ? 20bp. .常用启常用启动动子子Rous肉瘤启肉瘤启动动子（子（RSV）巨巨细细胞病毒启胞病毒启动动子（子（CMV）SV40启启动动子子.
15、 .增增强强子子增增强强子：是一种能子：是一种能够够提高提高转录转录效率的效率的顺顺式式调调控元件，最早是在控元件，最早是在SV40病毒中病毒中发现长约发现长约200bp的一段的一段DNA，可使旁可使旁侧侧的基因的基因转录转录提高提高100倍，其后在多种真核生物、甚至在倍，其后在多种真核生物、甚至在原核生物中都原核生物中都发现发现了增了增强强子子增增强强子通常占子通常占100-200bp长长度，也和启度，也和启动动子子一一样样由若干由若干组组件构成，其基本核心件构成，其基本核心组组件常件常为为8-12bp，可以可以单单拷拷贝贝或多拷或多拷贝贝串串连连形式形式存在存在 . .增增强强子的作用特点
16、子的作用特点 提高同一提高同一提高同一提高同一链链链链上基因上基因上基因上基因转录转录转录转录效率，可效率，可效率，可效率，可远远远远距离起作用，距离起作用，距离起作用，距离起作用，通常距离通常距离通常距离通常距离1-41-4kbkb、但但但但远远远远至至至至3030kbkb仍能仍能仍能仍能发挥发挥发挥发挥作用，在作用，在作用，在作用，在基因的上游或下游都能起作用基因的上游或下游都能起作用基因的上游或下游都能起作用基因的上游或下游都能起作用与其序列的正反方向无关与其序列的正反方向无关与其序列的正反方向无关与其序列的正反方向无关要有启要有启要有启要有启动动动动子才能子才能子才能子才能发挥发挥发挥
17、发挥作用。但增作用。但增作用。但增作用。但增强强强强子子子子对对对对启启启启动动动动子没子没子没子没有有有有严严严严格的格的格的格的专专专专一性，同一增一性，同一增一性，同一增一性，同一增强强强强子可以影响不同子可以影响不同子可以影响不同子可以影响不同类类类类型型型型启启启启动动动动子的子的子的子的转录转录转录转录增增增增强强强强子的作用机理子的作用机理子的作用机理子的作用机理虽虽虽虽然然然然还还还还不明确，但与其他不明确，但与其他不明确，但与其他不明确，但与其他顺顺顺顺式式式式调调调调控元件一控元件一控元件一控元件一样样样样，必，必，必，必须须须须与特定的蛋白与特定的蛋白与特定的蛋白与特定的
18、蛋白质质质质因子因子因子因子结结结结合后合后合后合后才能才能才能才能发挥发挥发挥发挥增增增增强强强强转录转录转录转录的作用的作用的作用的作用增增增增强强强强子一般具有子一般具有子一般具有子一般具有组织组织组织组织或或或或细细细细胞特异性，胞特异性，胞特异性，胞特异性，许许许许多增多增多增多增强强强强子子子子只在某些只在某些只在某些只在某些细细细细胞或胞或胞或胞或组织组织组织组织中表中表中表中表现现现现活性，是由活性，是由活性，是由活性，是由这这这这些些些些细细细细胞胞胞胞或或或或组织组织组织组织中具有特异性蛋白中具有特异性蛋白中具有特异性蛋白中具有特异性蛋白质质质质因子所决定的因子所决定的因子
19、所决定的因子所决定的 . .常用增常用增强强子子LTR：Rous肉瘤病毒基因肉瘤病毒基因长长末端重复序列末端重复序列人人类类巨巨细细胞病毒增胞病毒增强强子子SV40病毒增病毒增强强子子. .终终止信号和止信号和poly A信号信号真核基因真核基因转录转录的的终终止信号与机制止信号与机制还还不明确不明确poly A增加增加mRNA的的的的稳稳定性定性多聚腺苷化所需的两种序列多聚腺苷化所需的两种序列位于位于位于位于poly Apoly A下游下游下游下游GUGU丰富区或丰富区或丰富区或丰富区或U U丰富区丰富区丰富区丰富区位于位于位于位于poly Apoly A上游上游上游上游11-3011-30
20、bpbp处处处处的的的的5-5-AAUAAAAAUAAASV40 poly A信号信号. .遗传遗传性性标记标记胸苷激胸苷激酶酶基因（基因（tk）选择选择系系统统二二氢氢叶酸叶酸还还原原酶酶基因（基因（dhfr）选择选择系系统统新霉素抗性基因（新霉素抗性基因（neo）选择选择系系统统氯氯霉素乙霉素乙酰转酰转移移酶酶基因（基因（cat）选择选择系系统统. .胸苷激胸苷激酶酶（TK）基因）基因选择选择系系统统TK是核苷酸是核苷酸补补救合成途径的一个关救合成途径的一个关键键酶酶内源性缺陷内源性缺陷tk的宿主的宿主细细胞胞小鼠小鼠LMTK细细胞胞HAT选择选择法法H H：次黄次黄次黄次黄嘌嘌嘌嘌呤；呤
21、；呤；呤；补补补补救合成三种核苷酸的原料救合成三种核苷酸的原料救合成三种核苷酸的原料救合成三种核苷酸的原料A A：氨基喋呤；抑制四氨基喋呤；抑制四氨基喋呤；抑制四氨基喋呤；抑制四氢氢氢氢叶酸合成叶酸合成叶酸合成叶酸合成T T：胸苷；胸苷；胸苷；胸苷；补补补补救合成救合成救合成救合成dTTPdTTP的原料的原料的原料的原料tk细细胞的胞的鉴别鉴别与与获获得：得：5-溴脱氧核糖尿苷溴脱氧核糖尿苷（BUdR）筛选筛选. .二二氢氢叶酸叶酸还还原原酶酶（DHFR）基因）基因选择选择系系统统DHFR：真核真核细细胞生物合成核苷酸的关胞生物合成核苷酸的关键键酶酶，功能是催化二功能是催化二氢氢叶酸叶酸还还原
22、成四原成四氢氢叶酸叶酸筛选剂筛选剂：叶酸：叶酸类类似物似物氨基喋呤或氨甲喋氨基喋呤或氨甲喋呤呤dhfr缺陷型缺陷型细细胞胞CHO细细胞胞正常正常细细胞可通胞可通过过提高氨甲喋呤提高氨甲喋呤浓浓度度筛选筛选突突变变型型dhfr基因的基因的导导入入扩扩大大筛选筛选宿主宿主细细胞的胞的范范围围. .新霉素抗性基因新霉素抗性基因选择选择系系统统新霉素（新霉素（neo）：）：即即G418，一种氨基糖苷一种氨基糖苷类类抗生素，影响抗生素，影响80S核糖体功能核蛋白核糖体功能核蛋白质质的的合成合成新霉素抗性基因新霉素抗性基因编码编码3-磷酸磷酸转转移移酶酶降解降解G418适用于所有的真核适用于所有的真核细细
23、胞胞. .氯氯霉素乙霉素乙酰转酰转移移酶酶（CAT）基因）基因选择选择系系统统CAT：大大肠肠杆菌杆菌Tn9转转座子座子编码编码的催化的催化氯氯霉霉素乙素乙酰酰化反化反应应的蛋白的蛋白质质真核真核细细胞缺乏胞缺乏CAT导导入入CAT可作可作为报为报告基因告基因常用于瞬常用于瞬时时表达研究表达研究. .表位表位标记标记表位：抗原决定簇即抗原分子于一特定抗体表位：抗原决定簇即抗原分子于一特定抗体结结合的化学基合的化学基团团，一般由少至几个氨基酸，一般由少至几个氨基酸的多的多肽组肽组成成用于重用于重组组DNA技技术术的示踪、分析、的示踪、分析、纯纯化化（亲亲和）和）优优点点用一种抗体可用一种抗体可用
24、一种抗体可用一种抗体可鉴别鉴别鉴别鉴别不同重不同重不同重不同重组组组组蛋白蛋白蛋白蛋白不影响蛋白功能不影响蛋白功能不影响蛋白功能不影响蛋白功能有利于研究蛋白功能有利于研究蛋白功能有利于研究蛋白功能有利于研究蛋白功能常用表位：常用表位：6His；FLAG；LZ等等. .构建含表位的重构建含表位的重组组体体使用常用密使用常用密码码子子注意克隆位点（限制性注意克隆位点（限制性酶酶切位点）相符切位点）相符5端加上起始密端加上起始密码码子子ATG3端加上端加上终终止密止密码码子子可插入蛋白可插入蛋白酶酶切位点基因，以利于切位点基因，以利于产产生天然生天然蛋白蛋白其他常其他常规规构建构建载载体的注意点体的
25、注意点. .真核表达真核表达载载体体质质粒：真核表达元件、真核抗性粒：真核表达元件、真核抗性病毒病毒载载体：改建后体：改建后SV40SV40病毒病毒病毒病毒腺病毒腺病毒腺病毒腺病毒反反反反转录转录转录转录病毒病毒病毒病毒痘苗病毒痘苗病毒痘苗病毒痘苗病毒. .病毒基因病毒基因组组的的结结构特点构特点病毒基因病毒基因病毒基因病毒基因组组组组大小相差大小相差大小相差大小相差较较较较大大大大, ,与与与与细细细细菌或真核菌或真核菌或真核菌或真核细细细细胞相比，病毒的胞相比，病毒的胞相比，病毒的胞相比，病毒的基因基因基因基因组组组组很小很小很小很小 病毒基因病毒基因病毒基因病毒基因组组组组可以由可以由可
26、以由可以由DNADNA组组组组成，也可以由成，也可以由成，也可以由成，也可以由RNARNA组组组组成成成成 多数多数多数多数RNARNA病毒的基因病毒的基因病毒的基因病毒的基因组组组组是由是由是由是由连续连续连续连续的核糖核酸的核糖核酸的核糖核酸的核糖核酸链组链组链组链组成成成成 基因重叠即同一段基因重叠即同一段基因重叠即同一段基因重叠即同一段DNADNA片段能片段能片段能片段能够编码够编码够编码够编码两种甚至三种蛋白两种甚至三种蛋白两种甚至三种蛋白两种甚至三种蛋白质质质质分子分子分子分子 病毒基因病毒基因病毒基因病毒基因组组组组的大部分是用来的大部分是用来的大部分是用来的大部分是用来编码编码
27、编码编码蛋白蛋白蛋白蛋白质质质质的的的的 病毒基因病毒基因病毒基因病毒基因组组组组DNADNA序列中功能上相关的蛋白序列中功能上相关的蛋白序列中功能上相关的蛋白序列中功能上相关的蛋白质质质质的基因或的基因或的基因或的基因或rRNArRNA的基因往往的基因往往的基因往往的基因往往丛丛丛丛集在基因集在基因集在基因集在基因组组组组的一个或几个特定的部位的一个或几个特定的部位的一个或几个特定的部位的一个或几个特定的部位, ,形成一个功能形成一个功能形成一个功能形成一个功能单单单单位或位或位或位或转录单转录单转录单转录单元元元元 除了反除了反除了反除了反转录转录转录转录病毒以外，一切病毒基因病毒以外，一
28、切病毒基因病毒以外，一切病毒基因病毒以外，一切病毒基因组组组组都是都是都是都是单单单单倍体，每个倍体，每个倍体，每个倍体，每个基因在病毒基因在病毒基因在病毒基因在病毒颗颗颗颗粒中只出粒中只出粒中只出粒中只出现现现现一次一次一次一次 噬菌体（噬菌体（噬菌体（噬菌体（细细细细胞病毒）的基因是胞病毒）的基因是胞病毒）的基因是胞病毒）的基因是连续连续连续连续的；而真核的；而真核的；而真核的；而真核细细细细胞病毒的胞病毒的胞病毒的胞病毒的基因是不基因是不基因是不基因是不连续连续连续连续的的的的 . .病毒病毒载载体体优优点点真核真核细细胞可胞可识别识别的启的启动动子子报报告基因告基因可持可持续续复制（感
29、染周期）复制（感染周期）部分部分载载体可整合入基因体可整合入基因组组部分部分载载体本身体本身带带有完整的复制及表达元件有完整的复制及表达元件部分部分载载体具有宿主体具有宿主细细胞特异性胞特异性识别识别识别识别受体受体受体受体假病毒假病毒假病毒假病毒颗颗颗颗粒粒粒粒. .猿猴空泡病毒（猿猴空泡病毒（SV40）种属分种属分种属分种属分类类类类：乳多空病毒科多瘤病毒属：乳多空病毒科多瘤病毒属：乳多空病毒科多瘤病毒属：乳多空病毒科多瘤病毒属双双双双链链链链共价共价共价共价闭闭闭闭合合合合环环环环状状状状DNADNA（cccDNAcccDNA），），），），5243bp5243bp2020面体立体面体立
30、体面体立体面体立体对对对对称称称称结结结结构，直径构，直径构，直径构，直径4545nmnm以以以以EcoRlEcoRl内切内切内切内切酶酶酶酶切点作切点作切点作切点作为为为为0 0点分成点分成点分成点分成100100等分，等分，等分，等分，OriOri点是点是点是点是DNADNA双向复制的起双向复制的起双向复制的起双向复制的起绐绐绐绐点点点点早期早期早期早期编码进编码进编码进编码进程是逆程是逆程是逆程是逆时钟时钟时钟时钟方向，在病毒方向，在病毒方向，在病毒方向，在病毒DNADNA自制前，自制前，自制前，自制前，编码编码编码编码的蛋白的蛋白的蛋白的蛋白质质质质( (大大大大T T、小小小小T T
31、抗原抗原抗原抗原) )与与与与诱发诱发诱发诱发宿主宿主宿主宿主细细细细胞的胞的胞的胞的转转转转化有关化有关化有关化有关晚期晚期晚期晚期编码编码编码编码区区区区进进进进程程程程为顺时钟为顺时钟为顺时钟为顺时钟方向，是在病毒方向，是在病毒方向，是在病毒方向，是在病毒DNADNA复制复制复制复制开始以后，开始以后，开始以后，开始以后，编码编码编码编码的蛋白的蛋白的蛋白的蛋白质为质为质为质为三种病毒壳体蛋白三种病毒壳体蛋白三种病毒壳体蛋白三种病毒壳体蛋白VP1VP1、VP2VP2和和和和VP3VP3，这这这这些蛋白是病毒的些蛋白是病毒的些蛋白是病毒的些蛋白是病毒的结结结结构蛋白，不参与构蛋白，不参与构
32、蛋白，不参与构蛋白，不参与细细细细胞的胞的胞的胞的转转转转化化化化过过过过程程程程. . .SV40感染感染细细胞模式胞模式感染形式：随宿主的不同感染形式：随宿主的不同产产生的效生的效应应不同不同许许许许可性可性可性可性细细细细胞胞胞胞裂解性感染（猿猴裂解性感染（猿猴裂解性感染（猿猴裂解性感染（猿猴细细细细胞）胞）胞）胞）非非非非许许许许可性可性可性可性细细细细胞胞胞胞整合入染色体（整合入染色体（整合入染色体（整合入染色体（啮齿动啮齿动啮齿动啮齿动物物物物细细细细胞）胞）胞）胞）半半半半许许许许可性可性可性可性细细细细胞胞胞胞既不整合也不裂解（人既不整合也不裂解（人既不整合也不裂解（人既不整合
33、也不裂解（人细细细细胞）胞）胞）胞）. .SV40载载体体类类型型取代型重取代型重组组病毒病毒去掉晚期区一段去掉晚期区一段去掉晚期区一段去掉晚期区一段DNADNA，外源基因可插入外源基因可插入外源基因可插入外源基因可插入需需需需辅辅辅辅助病毒感染助病毒感染助病毒感染助病毒感染可形成病毒可形成病毒可形成病毒可形成病毒颗颗颗颗粒粒粒粒重重组组病毒病毒-质质粒粒载载体体保留病毒复制相关序列保留病毒复制相关序列保留病毒复制相关序列保留病毒复制相关序列插入插入插入插入细细细细菌菌菌菌质质质质粒序列，可在大粒序列，可在大粒序列，可在大粒序列，可在大肠肠肠肠杆菌种复制增殖杆菌种复制增殖杆菌种复制增殖杆菌种复
34、制增殖不形成病毒不形成病毒不形成病毒不形成病毒颗颗颗颗粒粒粒粒. .SV40及衍生及衍生载载体的体的优优点点可在多种可在多种细细胞中表达胞中表达基因基因组组DNA、cDNA均可表达均可表达SV40的复制起始点的复制起始点广泛宿主范广泛宿主范围围的启的启动动子子多聚多聚A信号信号DNA拼接供体和信号（剪接内含子）拼接供体和信号（剪接内含子）部分部分载载体含有体含有报报告基因告基因. .感染宿主范感染宿主范围围有限有限复制只能在猿猴复制只能在猿猴细细胞中胞中载载体体DNA分子量小，容量小分子量小，容量小在用在用辅辅助病毒混合感染助病毒混合感染时时，有野生化危，有野生化危险险SV40及衍生及衍生载载
35、体的缺点体的缺点. . .痘苗病毒痘苗病毒双双链链DNA病毒病毒180kb，编码编码200种左右的蛋白种左右的蛋白可独立的在可独立的在细细胞胞质质中复制中复制转录转录. .痘苗病毒痘苗病毒载载体体优优越性越性宿主范宿主范围围广泛广泛容量大容量大插入的外源基因可达插入的外源基因可达25kb瞬瞬时时表达表达无致癌性无致癌性本身即需接种本身即需接种可作可作为为重重组组活疫苗的活疫苗的载载体体. .痘苗病毒痘苗病毒载载体的缺点体的缺点分子量大，操作分子量大，操作较较困困难难无剪接功能无剪接功能不能插入含内含子的基因不能插入含内含子的基因外源基因必外源基因必须须插入非必需区插入非必需区. .构建重构建重
36、组组痘苗病毒流程痘苗病毒流程tk基因插入基因插入质质粒粒tk基因内插入痘病毒早期启基因内插入痘病毒早期启动动子子接上多克隆位点接上多克隆位点接上外源基因接上外源基因野毒株感染野毒株感染细细胞胞导导入重入重组载组载体体同源重同源重组组含外源基因的含外源基因的tk基因取代基因取代筛选筛选含外源基因的重含外源基因的重组组病毒病毒感染敏感宿主感染敏感宿主细细胞表达外源基因胞表达外源基因. .腺病毒腺病毒AdAd病毒病毒病毒病毒颗颗颗颗粒的直径粒的直径粒的直径粒的直径为为为为70-9070-90nmnm，呈呈呈呈2020面体立体面体立体面体立体面体立体对对对对称型，核心外称型，核心外称型，核心外称型，核
37、心外层层层层的壳体由的壳体由的壳体由的壳体由252252个壳粒个壳粒个壳粒个壳粒亚单亚单亚单亚单位位位位组组组组成成成成双股双股双股双股线线线线型型型型DNADNA，DNADNA约约约约占病毒重量的占病毒重量的占病毒重量的占病毒重量的11-14%11-14%不同不同不同不同亚亚亚亚型型型型AdAd病毒的病毒的病毒的病毒的DNADNA的的的的G+C%G+C%含量不同，与其含量不同，与其含量不同，与其含量不同，与其致瘤性能致瘤性能致瘤性能致瘤性能强强强强弱有关弱有关弱有关弱有关Ad2Ad2基因基因基因基因组组组组的早期的早期的早期的早期转录转录转录转录区有区有区有区有6 6个独立的区域个独立的区域
38、个独立的区域个独立的区域: : IA(EIA)IA(EIA)、EIBEIB、E2(E2AE2(E2A和和和和E2B)E2B)、E3E3、E4E4Ad2Ad2基因基因基因基因组约长组约长组约长组约长3636kbkb，EIAEIA和和和和EIBEIB与与与与Ad2Ad2的启的启的启的启动动动动和和和和转转转转化化化化细细细细胞密切有关胞密切有关胞密切有关胞密切有关腺病毒腺病毒腺病毒腺病毒虽虽虽虽然分布广泛，其中某些然分布广泛，其中某些然分布广泛，其中某些然分布广泛，其中某些亚亚亚亚型型型型对动对动对动对动物具物具物具物具强强强强致瘤性，但是从致瘤性，但是从致瘤性，但是从致瘤性，但是从A A组组组组
39、到到到到E E组组组组，迄今尚未，迄今尚未，迄今尚未，迄今尚未证证证证明与人明与人明与人明与人类类类类肿肿肿肿瘤有病因学上的瘤有病因学上的瘤有病因学上的瘤有病因学上的联联联联系系系系 . .腺病毒腺病毒载载体体容量容量较较大：可插入大：可插入7kb易培养、易培养、纯纯化化复制与复制与转录转录依依赖赖与宿主聚合与宿主聚合酶酶不整合不整合释释放壳体蛋白，引起免疫反放壳体蛋白，引起免疫反应应. .基因的基因的导导入方法入方法光穿孔法：激光；光穿孔法：激光；光穿孔法：激光；光穿孔法：激光；悬悬悬悬浮浮浮浮细细细细胞胞胞胞冲冲冲冲击击击击波：活体局部的基因波：活体局部的基因波：活体局部的基因波：活体局部
40、的基因转转转转移移移移基因基因基因基因枪枪枪枪法：即微粒法：即微粒法：即微粒法：即微粒轰击轰击轰击轰击；动动动动物物物物细细细细胞，更适用于植胞，更适用于植胞，更适用于植胞，更适用于植物物物物细细细细胞胞胞胞穿孔法：脉冲穿孔法：脉冲穿孔法：脉冲穿孔法：脉冲电场电场电场电场；CytomixCytomix缓缓缓缓冲液；冲液；冲液；冲液；70%70%细细细细胞胞胞胞死亡死亡死亡死亡时时时时效率最高效率最高效率最高效率最高磷酸磷酸磷酸磷酸钙钙钙钙共沉淀法共沉淀法共沉淀法共沉淀法脂脂脂脂质质质质体法：体法：体法：体法：LipofectinLipofectin；阳离子阳离子阳离子阳离子抗体抗体抗体抗体转转
41、转转染法：抗染法：抗染法：抗染法：抗CD3CD3，CD34CD34或表面免疫求蛋白或表面免疫求蛋白或表面免疫求蛋白或表面免疫求蛋白其他：超声波法；微注射法原生其他：超声波法；微注射法原生其他：超声波法；微注射法原生其他：超声波法；微注射法原生质质质质体融合法；反体融合法；反体融合法；反体融合法；反转录转录转录转录病毒感染法病毒感染法病毒感染法病毒感染法. .表达表达产产物的物的检测检测技技术术Western印迹法印迹法免疫学方法免疫学方法抗原抗原-抗体反抗体反应应荧荧光光显显微微镜镜法法表位表位标记标记的抗体与直接抗的抗体与直接抗体体进进行行荧荧光光标记标记免疫学方法免疫学方法. .Weste
42、rn印迹法印迹法蛋白蛋白样样品制品制备备 SDS-PAGE（按分子量大按分子量大小）小）电转电转移移一抗（特异性）一抗（特异性）二抗二抗显显色色敏感度：敏感度：1-51-5ngng. .样样品的制品的制备备裂解裂解细细胞胞电电泳加泳加样缓样缓冲液裂解冲液裂解细细胞（煮沸胞（煮沸5-10min）抽提抽提细细胞蛋白（超声）胞蛋白（超声）. .SDS-PAGE丙丙烯酰烯酰胺和胺和N，N-亚亚甲双丙甲双丙烯酰烯酰胺交胺交联联，形成一定孔径的分离介形成一定孔径的分离介质质，孔径大小由，孔径大小由浓浓度决定，具有分子度决定，具有分子筛筛效效应应在不在不连续连续的的缓缓冲系冲系统统，具有，具有浓缩浓缩效效应
43、应蛋白蛋白质质本身的本身的电电荷效荷效应应SDS：阴离子去阴离子去污剂污剂，与蛋白，与蛋白质结质结合合SDS浓浓度大于度大于0.05%时时，使，使样样品中的蛋白品中的蛋白质质带带同同样样密度的密度的电电荷荷电电泳泳时时使蛋白迁移只与分子量有关，且呈使蛋白迁移只与分子量有关，且呈线线性（性（对对数分子量与迁移率），可数分子量与迁移率），可测测定分子定分子量量. .电转电转移移支持介支持介质质：重氮：重氮苄苄氧甲基氧甲基纸纸（DBP纸纸）、）、阴离子化尼阴离子化尼龙龙膜、硝酸膜、硝酸纤维纤维素膜（素膜（NC）蛋白蛋白质带负电质带负电，向正极迁移，向正极迁移凝胶考凝胶考马马斯亮斯亮兰兰染色，染色，检
44、查转检查转移是否完全移是否完全膜膜丽丽春春红红染色染色标记标记分子量位置分子量位置. .靶蛋白的免疫学靶蛋白的免疫学检测检测封封闭闭非特异性非特异性结结合位点，脱脂奶粉或血清白合位点，脱脂奶粉或血清白蛋白蛋白第一抗体：具有特异性，最好氏多抗或抗血第一抗体：具有特异性，最好氏多抗或抗血清清标记标记的第二抗体：同位素的第二抗体：同位素标记标记；碱性磷酸；碱性磷酸酶酶（AKP）标记标记；辣根；辣根过过氧化物氧化物酶酶（HRP）标记标记注意封注意封闭闭非特异性位点非特异性位点注意抗体注意抗体浓浓度：尤其是一抗度：尤其是一抗浓浓度度. .显显色反色反应应AKP催化催化5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚磷酸
45、与氮磷酸与氮蓝蓝四四唑唑发发生反生反应应，产产生深生深蓝蓝色色HRP催化催化3,3-二氨基二氨基联联苯胺与苯胺与H2O2反反应产应产生棕色条生棕色条带带，易褪色，注意保存，易褪色，注意保存结结果果. .转转基因基因动动物物概念：以概念：以动动物个体物个体为为基因受体的基因表达技基因受体的基因表达技术术，并由于，并由于这这种外源基因的种外源基因的导导入而入而产产生可生可以以遗传遗传的的变变异异这这些些遗传遗传改改变变包括：包括：外源外源外源外源DNADNA至少整合到一条染色体上至少整合到一条染色体上至少整合到一条染色体上至少整合到一条染色体上由于外源由于外源由于外源由于外源DNADNA的插入使任
46、一基因的插入使任一基因的插入使任一基因的插入使任一基因发发发发生改生改生改生改变变变变由于外源由于外源由于外源由于外源DNADNA的插入使染色体的插入使染色体的插入使染色体的插入使染色体发发发发生重排生重排生重排生重排有意有意有意有意识识识识的的的的导导导导入可以持久存在的入可以持久存在的入可以持久存在的入可以持久存在的遗传实遗传实遗传实遗传实体体体体. .植物生物反植物生物反应应器器生物反生物反应应器：一种定向的生器：一种定向的生产产系系统统，是，是为获为获取某种取某种产产品而定向构建和改造的装置，品而定向构建和改造的装置，这这种装置是最复种装置是最复杂杂最高等的生命系最高等的生命系统统特点：自特点：自组织组织，自复制，自，自复制，自调节调节，自适，自适应应优优点点无无无无污污污污染，可持染，可持染，可持染，可持续发续发续发续发展展展展操作操作操作操作简单简单简单简单灵活灵活灵活灵活成本低廉成本低廉成本低廉成本低廉可直接食用可直接食用可直接食用可直接食用稳稳稳稳定，便于定，便于定，便于定，便于储储储储藏和运藏和运藏和运藏和运输输输输. .
