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1、DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.酶联免疫斑点酶联免疫斑点E Enzyme nzyme L Linked inked I ImmunommunoSPOTSPOT达科为生物技术有限公司达科为生物技术有限公司朱义鑫朱义鑫2005.11.30Elispot实验结果（透明板）实验结果（透明板）U-Cytech 公司公司 Elispot实验结果（实验结果（PVDF板）板）U-Cytech 公司公司达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.1.1.ELISPOTELISPOT技术起源与发展技术起源与发展2.2.细胞与细胞因子细胞与细胞因子3.3.ELIS
2、POTELISPOT技术原理技术原理4.4.ELISPOT ELISPOT 和和 ELISAELISA的区别的区别5.5.ELISPOTELISPOT的优点的优点第一部分：前言第一部分：前言达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.19831983年年, , Czerkinsky&SedgwickCzerkinsky&Sedgwick ：计数分泌抗体的：计数分泌抗体的 B B 细胞；细胞；19851985年，年，MoreMore：NCNC板，改进显色底物，不再需要琼脂糖凝胶板，改进显色底物，不再需要琼脂糖凝胶; ;19881988年，年，CzerkinskyCz
3、erkinsky et.alet.al.: .: 首次将应用扩展到细胞因子检测首次将应用扩展到细胞因子检测领域，领域，T cell IFN-; ; 同年业发展出双色标记技术；同年业发展出双色标记技术；19951995年，年，SchielenSchielen et.alet.al.: .: 首次将首次将PVDFPVDF膜板引入膜板引入ELISPOTELISPOT19971997年，年，GuiGui et.alet.al. .：发展出计算机辅助的斑点技术技术。：发展出计算机辅助的斑点技术技术。1.ELISPOT1.ELISPOT技术起源与发展技术起源与发展达科为生物达科为生物DAKEWE BIOT
4、ECH COMPANY Ltd.T T细胞在免疫系统中起着关键性的作用，尤其是起免疫调节细胞在免疫系统中起着关键性的作用，尤其是起免疫调节作用的辅助细胞作用的辅助细胞ThTh。它们参与了细胞免疫。它们参与了细胞免疫(Th1)(Th1)和体液免疫和体液免疫(Th2)(Th2)抗原或者有丝分裂原刺激抗原或者有丝分裂原刺激T T细胞、单核细胞、单核/ /巨噬细胞分泌细胞因巨噬细胞分泌细胞因子子 Th1 cells IFN-,IL-2 Th2 cells IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13 Tc cells IFN-, TNF-, 颗粒粒酶酶B，穿孔素，穿孔素 单
5、核单核/ /巨噬细胞巨噬细胞 TNF-a, IL-1b, IL-6, IL-10, IL-12 细细胞胞因因子子的的分分泌泌以以及及对对效效应应细细胞胞的的调调节节构构成成了了一一个个精精确确的的免免疫系统调节网络。疫系统调节网络。2.2.细胞与细胞因子细胞与细胞因子达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.用抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以斑点显色的方式将其表现出来。3.ELISPOT3.ELISPOT技术原理技术原理达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.4.ELISPOT 4.ELISPOT 和和 ELISAELI
6、SA的区别的区别ELISPOT ELISPOT 法源自法源自 ELISA ELISA ，又突破传统，又突破传统 ELISA ELISA 法，法，是定量是定量 ELISA ELISA 技术的延伸和新的发展。两者都可检测技术的延伸和新的发展。两者都可检测细胞产生的细胞因子或其他可溶性蛋白，它们最大的细胞产生的细胞因子或其他可溶性蛋白，它们最大的不同不同: :nELISAELISA测定的是测定的是蛋白浓度蛋白浓度，ELISPOTELISPOT测定的是测定的是细胞频率细胞频率；（整体水平与单细胞水平）（整体水平与单细胞水平）nELISAELISA是是免疫检测免疫检测ImmunoImmuno-Assay
7、-Assay，而，而ELISPOTELISPOT是是生物检测生物检测Bio-AssayBio-Assay（活细胞，功能检测）（活细胞，功能检测）nELISAELISA检测的特异性表现在检测的特异性表现在抗体抗体上，上，ELISPOTELISPOT检测的特异性检测的特异性及表现在双重的及表现在双重的刺激源刺激源和和抗体抗体上。上。达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.5.ELISPOT5.ELISPOT的优点的优点 目前，检测细胞因子或者细胞免疫反应的方法有以下目前，检测细胞因子或者细胞免疫反应的方法有以下几种：几种：ELISAELISA、ELISPOTELI
8、SPOT、FACSFACS、TetramerTetramer、3 3H H胸苷参入法、胸苷参入法、5151CrCr释放法。释放法。 n高灵敏高灵敏：度少至：度少至1001001,0001,000个分子个分子/Cell/Cell即能够被检测。比即能够被检测。比ELISAELISA的灵的灵敏度高敏度高200200倍。倍。n单细胞水平单细胞水平：即使只有一个阳性细胞也能够检测出来，比：即使只有一个阳性细胞也能够检测出来，比FACSFACS灵敏。灵敏。n高通量高通量：每个研究人员每天可作数百样本的检测。：每个研究人员每天可作数百样本的检测。High Throughput High Throughput
9、 ScreeningScreening达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.在在10106 6抗原呈递细胞（抗原呈递细胞（APCAPC）中混入已知数量的中混入已知数量的IFN-IFN-阳阳性性T T淋巴细胞，然后用三种方法分别进行检测。淋巴细胞，然后用三种方法分别进行检测。X X坐标：各检测方法的检测结果坐标：各检测方法的检测结果 Y Y坐标：每百万坐标：每百万APCAPC中实际中实际IFN-IFN-+ +T T细胞数量细胞数量ELISPOT/FACS/ELISAELISPOT/FACS/ELISA检测精确度比较 ELISPOT ELISPOT 流式荧光染色
10、流式荧光染色 ELISAELISA达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.第二部分：技术特点第二部分：技术特点1.1.技术操作流程技术操作流程2.2.ELISPOTELISPOT技术要点技术要点3.3.塑料板与膜板塑料板与膜板4.4.膜结构与抗体包被膜结构与抗体包被5.5.细胞处理细胞处理6.6.有血清与无血清有血清与无血清7.7.刺激物选择刺激物选择8.8.建立阳性对照建立阳性对照9.9.调整适当的细胞浓度调整适当的细胞浓度10.10.预培养法与直接法预培养法与直接法11.11.各种染色系统各种染色系统达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COM
11、PANY Ltd.1.1.包被抗体包被抗体 4 4 过夜，洗涤；过夜，洗涤；2.2.封闭封闭37 1h37 1h；3.3.加入淋巴细胞和刺激原加入淋巴细胞和刺激原37 37 孵育孵育8-40h8-40h；4.4.冰水裂解并移出细胞，洗涤；冰水裂解并移出细胞，洗涤；5.5.加入生物素标记的检测抗体加入生物素标记的检测抗体37 1h37 1h，洗涤；，洗涤；6.6.加入酶联亲和素加入酶联亲和素37 1h37 1h，洗涤；洗涤；7.7.加入显色底物，显色加入显色底物，显色1040min1040min；8.8.获得斑点，计数。获得斑点，计数。1，23456781. ELISPOT1. ELISPOT一
12、般操作流程一般操作流程达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.2. ELISPOT2. ELISPOT技术要点技术要点u细胞培养和培养前阶段无菌操作，避免污染细胞培养和培养前阶段无菌操作，避免污染u细胞在细胞在ELISPOT板上孵育时要避免震动，包括开关板上孵育时要避免震动，包括开关CO2孵箱孵箱u洗涤要充分，尤其是裂解细胞之后的洗涤洗涤要充分，尤其是裂解细胞之后的洗涤u洗涤时，枪头不能接触到膜，从孔中移出液体采用倾倒洗涤时，枪头不能接触到膜，从孔中移出液体采用倾倒的方式的方式u洗涤最后一次要用高质量的吸水纸拍干洗涤最后一次要用高质量的吸水纸拍干达科为生物达科
13、为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.塑料板：塑料板：U-U-cytechcytech公司特有的透明版公司特有的透明版操作简单，方便，省时，价廉，但是斑点不如膜板漂亮，适于初操作简单，方便，省时，价廉，但是斑点不如膜板漂亮，适于初学者以及临床诊断。学者以及临床诊断。膜板：膜板：PVDFPVDF膜板、膜板、NCNC膜板膜板操作复杂，但是斑点漂亮，适合有经验的实验者以及科学研究。操作复杂，但是斑点漂亮，适合有经验的实验者以及科学研究。3.3.塑料板与膜板塑料板与膜板达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.塑料板：塑料板：U-cytech公司特
14、有的透明版公司特有的透明版优点：优点：v透明全塑料板，易于操作，可以随时观察细胞；透明全塑料板，易于操作，可以随时观察细胞；v可以快速包被，节省实验时间；可以快速包被，节省实验时间；v可回收细胞和上清；可回收细胞和上清；v价格只有价格只有PVDFPVDF膜板的一半。膜板的一半。缺点：缺点：v吸附能力比膜差，斑点松散，易受粒细胞的分解；吸附能力比膜差，斑点松散，易受粒细胞的分解；v裸视下斑点为灰白色，不如有颜色斑点明显；裸视下斑点为灰白色，不如有颜色斑点明显；v只有一种染色系统，不能用于多色分析。只有一种染色系统，不能用于多色分析。修饰的修饰的HRP/银银染系统染系统达科为生物达科为生物DAKE
15、WE BIOTECH COMPANY Ltd.膜板：膜板：PVDFPVDF膜，膜， NCNC膜膜优点：优点：FPVDFPVDF膜的吸附能力更强，斑点致密、圆润；膜的吸附能力更强，斑点致密、圆润；F斑点颜色鲜艳，易于判读；斑点颜色鲜艳，易于判读；F能用于多色能用于多色ELISPOTELISPOT实验。实验。缺点：缺点：F需酒精预湿等步骤，操作稍复杂；需酒精预湿等步骤，操作稍复杂；F因为膜的渗漏问题，在洗涤步骤稍复杂；因为膜的渗漏问题，在洗涤步骤稍复杂；F几乎不可能回收细胞和上清；几乎不可能回收细胞和上清；F膜的脆弱性，实验中的操作与保存更困难。膜的脆弱性，实验中的操作与保存更困难。HRP/DAB
16、AP/BCIP&NBTHRP/AEC达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.IFN- IL-5IL-10IFN- PMA/ionomycinPMA/ionomycin2.5x102.5x104 4 hu-PBMC hu-PBMCindirectindirecttetanustetanus105 hu-PBMC105 hu-PBMCindirectindirectConAConA2.5x104 hu-PBMC2.5x104 hu-PBMCindirectindirectICE Peptide PoolICE Peptide Pool2x105 hu-PBMC2x
17、105 hu-PBMCindirectindirectIL-5IL-5IL-12p70IL-12p70IFN-IFN- PMA/ ionomycin2x105 hu-PBMCindirectLPS/ IFN- 2.5x104 hu-PBMCdirectICE Peptide Pool2x105 hu-PBMCindirectPVDFPVDF板、透明板、透明板的典型斑点图像板的典型斑点图像达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.4. 4. 膜结构和抗体包被膜结构和抗体包被n通常的包被条件是4过夜，也可以室温2小时n37 包被不能超过1小时，否则包被效率急剧降低n
18、膜吸附能力远远超过包被抗体的量，所以需要封闭n包被后必须接着封闭，否则包被抗体会逐渐失活n封闭之后用纯水或PBS洗涤，可以在4长期存储关于膜的一些参数（单孔面积）关于膜的一些参数（单孔面积）厚度：厚度：120-150um最大蛋白吸附量：最大蛋白吸附量： 80-100 ugELISPOT所需量：所需量：1 ug包被抗体集中于膜表面包被抗体集中于膜表面1um(透明板容纳量为：透明板容纳量为：30-40 ug)达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.从外周血提取淋巴细胞时从外周血提取淋巴细胞时, , 应避免凝血引起的细胞活应避免凝血引起的细胞活性降低；血液越新鲜越好
19、，全血不应该存放超过性降低；血液越新鲜越好，全血不应该存放超过6 6小小时。时。只能采用淋巴细胞提取液分离。提取淋巴细胞时应尽只能采用淋巴细胞提取液分离。提取淋巴细胞时应尽量去除红细胞、粒细胞和杂质的干扰量去除红细胞、粒细胞和杂质的干扰从小鼠的脾脏取淋巴细胞时，尤其要注意，加入从小鼠的脾脏取淋巴细胞时，尤其要注意，加入ELISPOTELISPOT培养孔的细胞须为单细胞悬液培养孔的细胞须为单细胞悬液预培养的淋巴细胞若有坏死预培养的淋巴细胞若有坏死/ /凋亡（培养液变黄）会凋亡（培养液变黄）会影响斑点的形成影响斑点的形成预培养后的细胞入预培养后的细胞入ELISPOTELISPOT培养板前应更换培养
20、液培养板前应更换培养液ELISPOT实验的难点在于细胞处理与培养实验的难点在于细胞处理与培养5. 5. 细胞处理细胞处理 达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.6. 6. 有血清与无血清有血清与无血清u血清是细胞培养所必需的添加血清是细胞培养所必需的添加品品 ，ELISPOT有细胞培养的有细胞培养的过程，所以需要血清过程，所以需要血清u但是血清批次间差异大、成分但是血清批次间差异大、成分未可知，为未可知，为ELISPOT增加了增加了严重的不确定性因素。有些批严重的不确定性因素。有些批次的血清严重干扰试验结果。次的血清严重干扰试验结果。u无血清培养法已经成熟，
21、其优无血清培养法已经成熟，其优点：点：u成分固定，彻底消除了批次间的差异，结果可以在全世界的试验室之间比较。u不含杂蛋白，背景更弱，斑点更清晰。u不含抑制细胞因子分泌成分，斑点更多，更加反映真实的结果。u目前只能用于直接法，间接法目前只能用于直接法，间接法孵育时间过长，细胞生长受影孵育时间过长，细胞生长受影响，结果不理想。响，结果不理想。119 SFC267 SFC我们自己的试验结果：我们自己的试验结果：PHA/10,000 Hu-PBMC上：上：5%小牛血清（杭州）下：无血清培养基小牛血清（杭州）下：无血清培养基U-cytech)达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPAN
22、Y Ltd.n非特异性刺激物非特异性刺激物n有丝分裂原有丝分裂原 ConAConA，PMAPMA，PHAPHA，IonomycinIonomycinn特异性刺激物特异性刺激物n重组蛋白重组蛋白n病毒载体或者病毒颗粒病毒载体或者病毒颗粒n重叠肽段重叠肽段n表位肽表位肽注意：注意：u直接在直接在ELISPOTELISPOT培养可能会因没有足够的刺激强度而导致斑点数少。培养可能会因没有足够的刺激强度而导致斑点数少。此时可以采用预培养法。此时可以采用预培养法。u部分多价抗原刺激物导致细胞凋亡，可以换用单价抗原刺激物。部分多价抗原刺激物导致细胞凋亡，可以换用单价抗原刺激物。u核酸、激素等抗原刺激物的免疫
23、原性较弱，应该加强刺激浓度、辅助核酸、激素等抗原刺激物的免疫原性较弱，应该加强刺激浓度、辅助刺激物、延长刺激时间等。刺激物、延长刺激时间等。7. 7. 刺激物选择刺激物选择达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.8.8.建立阳性对照建立阳性对照n非特异性刺激阳性对照：非特异性刺激阳性对照：ConA 伴刀豆蛋白伴刀豆蛋白A 0.4-1.0ug/wellPHA 植物血球凝集素植物血球凝集素 0.3-1.0ug/wellIonomycin 伊诺霉素伊诺霉素 50-100ng/wellPMA 14烷酰佛波乙酯烷酰佛波乙酯 5.0-10ng/welln特异性阳性刺激原：
24、国际标准多肽池特异性阳性刺激原：国际标准多肽池CEF CEF C CMVMV， E EBVBV， ininf fluenza virusluenza virus在在PBMCPBMC的的IFN-IFN- ELISPOT ELISPOT 分析中：分析中：自发斑点频率自发斑点频率：1050/百万PBMC细胞；(十万分之一）PHAPHA刺激频率刺激频率：104105/百万PBMC细胞；（百分之一）CEFCEF刺激频率刺激频率：500 5000 /百万PBMC细胞（千分之一）达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.阳性对照实例阳性对照实例未未 刺刺 激激40SFC/百万
25、百万PBMCCEF 刺刺 激激3，400SFC/百万百万PBMCPHA 刺刺 激激26，000SFC/百万百万PBMC人PBMC40万/孔U-cytech无血清培养基人PBMC1万/孔U-cytech无血清培养基人PBMC5万/孔U-cytech无血清培养基4265177达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.9.9.调整适当的细胞浓度调整适当的细胞浓度 844 492 355 192 40万万 20万万 10万万 5万万n20-4020-40万万/ /孔形成最大密度的单层细胞孔形成最大密度的单层细胞n根据所使用刺激原作初步调整根据所使用刺激原作初步调整nCo
26、nAConA PHA PMA PHA PMA ：0.5-50.5-5万万/ /孔孔n特异性刺激物：特异性刺激物：5-405-40万万/ /孔孔n根据预实验的斑点数目作精细调整根据预实验的斑点数目作精细调整人人PBMC/CEF刺激刺激 U-cytech无血清培养基无血清培养基达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.10. 10. 预培养法与直接法预培养法与直接法p预培养法即：预先将细胞和刺激物加入预培养法即：预先将细胞和刺激物加入2424孔板中作孔板中作预孵育和刺激，然后再加入预孵育和刺激，然后再加入ELISPOTELISPOT板进行实验。板进行实验。p大多数大
27、多数ELISPOTELISPOT实验都可以用直接实验都可以用直接ELISPOTELISPOT法得到可法得到可接受的结果。接受的结果。p预孵育的优点：预孵育的优点：n经过预孵育，斑点更分散，清晰经过预孵育，斑点更分散，清晰n可以除去贴壁的巨噬细胞，从而减少小斑点的影响；可以除去贴壁的巨噬细胞，从而减少小斑点的影响；粒细胞的影响（虫啃）也可以大大减轻粒细胞的影响（虫啃）也可以大大减轻n某些细胞因子通常很难用直接法得到结果某些细胞因子通常很难用直接法得到结果，比如颗粒颗粒酶、酶、IL-10IL-10p预孵育的缺点：预孵育的缺点：n需要长时间孵育刺激，更为严格的无菌操作环境需要长时间孵育刺激，更为严格
28、的无菌操作环境n需耗费额外的物资和时间需耗费额外的物资和时间达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.直接法直接法PVDFPVDF刺激物：ICE Peptide Pool40 Hours,2 X 105 Cell/ Well预孵育法预孵育法PVDFPVDF刺激物：ICE Peptide Pool24+16 Hours,2 X 105 Cell/ WellIFN-IFN-直接法与预培养法比较直接法与预培养法比较达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.直接法直接法PVDFPVDF刺激物：破伤风杆菌40Hours, 2X105Cell
29、/Well预孵育法预孵育法PVDFPVDF刺激物：破伤风杆菌24+16 Hours, 2X105Cell/WellIL-10IL-10直接法与预培养法比较直接法与预培养法比较达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.11.11.各种染色系统各种染色系统修饰的修饰的HRP/银染系银染系统统HRP/AECAP/BCIP&NBTHRP/DAB透明板：只有一种透明板：只有一种修饰的修饰的HRP/HRP/银染系统银染系统，白色不透明斑点。，白色不透明斑点。PVDFPVDF板：两种标记酶板：两种标记酶 n辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶HRP-HRP-显色快，但是背景高显色快，
30、但是背景高(30min)(30min)AECAEC底物，颜色鲜艳，但易退色底物，颜色鲜艳，但易退色DABDAB底物，棕色斑点，着色稍牢固，但是板点松散底物，棕色斑点，着色稍牢固，但是板点松散n碱性磷酸酶碱性磷酸酶AP-AP-显色慢，但是背景干净显色慢，但是背景干净(2h)(2h)BCIP&NBTBCIP&NBT混合底物，蓝黑色，着色牢固混合底物，蓝黑色，着色牢固达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.第三部分：常见问题第三部分：常见问题0.0. 无斑点无斑点斑点过少（影响斑点数量的因素）斑点过少（影响斑点数量的因素）斑点过密斑点过密斑点聚集在孔边缘问题斑点聚集
31、在孔边缘问题斑点变花或者斑点变花或者“拖尾拖尾”透明板透明板“空斑空斑”问题问题斑点明显偏大，并且弥散斑点明显偏大，并且弥散PVDFPVDF膜酒精预湿处理中的问题膜酒精预湿处理中的问题细胞凋亡对细胞凋亡对ELISPOTELISPOT的影响的影响达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd. 1.1.ELISPOTELISPOT影响斑点形成的因素影响斑点形成的因素uQuality antibody pairQuality antibody pairuSolid support (polystyrene, nitrocellulose, PVDF)Solid suppo
32、rt (polystyrene, nitrocellulose, PVDF)uCells from STLV/HTLV-infected animals/humansCells from STLV/HTLV-infected animals/humansuCell source of tissues Cell source of tissues uCell composition (T cells, monocytes/macrophages, Cell composition (T cells, monocytes/macrophages, granulocytes, erythrocyte
33、s etc.)granulocytes, erythrocytes etc.)uKinetics cytokine productionKinetics cytokine productionuColoring systemColoring systemuWashing conditions/dilution bufferWashing conditions/dilution bufferuPreincubation (yes or no)Preincubation (yes or no)达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.2.2.斑点过密，细胞数量过多斑
34、点过密，细胞数量过多 844 192 40万万/孔孔 5万万/孔孔Human PBMC, stimulate by CEF peptide pool人人PBMC/CEF刺激刺激 U-cytech无血清培养基无血清培养基达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.3.3.斑点聚集在孔边缘问题斑点聚集在孔边缘问题细胞集中于孔边缘细胞集中于孔边缘n与细胞在孔边缘的与细胞在孔边缘的“层流阻滞层流阻滞”作用相关作用相关n常见于常见于PVDF膜板，膜的自然曲率影响膜板，膜的自然曲率影响改善方法改善方法u接种细胞之后，不要摇动、振荡接种细胞之后，不要摇动、振荡u细胞体积不要超过
35、细胞体积不要超过100uLu培养箱质量，铝箔包裹均匀受热培养箱质量，铝箔包裹均匀受热u方型孔板可杜绝细胞（斑点）的边缘效应方型孔板可杜绝细胞（斑点）的边缘效应洗板时的流水冲击力过大洗板时的流水冲击力过大n见于使用自动洗板机的情景见于使用自动洗板机的情景达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.这是震动所导致的斑点拖尾4. 4. 斑点变花或者斑点变花或者“拖尾拖尾”这是细胞趋化所导致的斑点变花n细胞在培养过程中震动导致斑点拖尾n大部分斑点清晰，但部分出现“拖尾”，这并非震动的原因n主要原因是主要原因是DC所导致的所导致的细胞趋化作用细胞趋化作用n常见于多价刺激，没
36、有常见于多价刺激，没有固定的固定的DC比例，有很大比例，有很大的个体差异的个体差异达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.5. 5. 透明板透明板“空斑空斑”问题问题n主要原因是粒细胞分主要原因是粒细胞分泌或分解所至的酶解泌或分解所至的酶解现象现象nPVDF膜板因底部是白膜板因底部是白色的膜，同时斑点更色的膜，同时斑点更致密而几乎看不出来致密而几乎看不出来改善方法改善方法n采用单价刺激物，多价采用单价刺激物，多价刺激物时更容易出现刺激物时更容易出现n与与PBMC分离的质量密分离的质量密切相关切相关n采用预孵育法可大大减采用预孵育法可大大减轻这一现象轻这一现象达
37、科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.我们自己的一个例子我们自己的一个例子（透明板，（透明板，PBMCPBMC，乙肝核心抗原蛋白），乙肝核心抗原蛋白）达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.6.6.斑点明显偏大，并且弥散斑点明显偏大，并且弥散u这与包被抗体的质量、浓度有着密切的关系这与包被抗体的质量、浓度有着密切的关系u随着包被抗体浓度的增加，斑点变得清晰致密随着包被抗体浓度的增加，斑点变得清晰致密u由于透明板的吸附能力差，这个问题更突出一些由于透明板的吸附能力差，这个问题更突出一些0.2ug/well0.5ug/well1.
38、0ug/well达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.斑点偏大，弥散：我们自己的例子斑点偏大，弥散：我们自己的例子（透明板，（透明板，PBMCPBMC，乙肝核心抗原蛋白），乙肝核心抗原蛋白）达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.7. PVDF7. PVDF膜酒精预湿处理问题膜酒精预湿处理问题不作酒精预湿不作酒精预湿不作酒精预湿不作酒精预湿过量酒精残留过量酒精残留过量酒精残留过量酒精残留nPVDFPVDF膜由于其疏水性，需要酒精预湿润膜由于其疏水性，需要酒精预湿润n有些公司的产品声称不需要预湿，但是有些公司的产品声称不需要预
39、湿，但是斑点减少斑点减少30-40%30-40%n由于膜的通透性，加入过量酒精会导致由于膜的通透性，加入过量酒精会导致其残留在膜的背面其残留在膜的背面n正确方法正确方法u减少酒精用量至减少酒精用量至 15ul 70% 15ul 70% 乙醇乙醇u快速预湿快速预湿 3030秒，迅速用水或秒，迅速用水或PBSPBS洗涤至少洗涤至少三遍三遍达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.一个客户的实例一个客户的实例达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.v细胞凋亡是高背景、无斑点的重要原因细胞凋亡是高背景、无斑点的重要原因v如果有如果有30
40、30细胞凋亡，完全不会出斑点；即使细胞凋亡，完全不会出斑点；即使5 5凋亡，也有严重凋亡，也有严重影响对策：对策：v台盼蓝活细胞计数台盼蓝活细胞计数v复苏冻存的细胞，可以先培养过夜，再做复苏冻存的细胞，可以先培养过夜，再做ELISPOTELISPOT实验实验8. 8. 细胞凋亡对细胞凋亡对ELISPOTELISPOT的影响的影响达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.第四部分：第四部分：ELISPOTELISPOT应用应用nELISPOTELISPOT在国外的应用已经非常普遍，成为一项免疫学检测常规技在国外的应用已经非常普遍，成为一项免疫学检测常规技术。凡是免
41、疫学相关领域，都可以应用术。凡是免疫学相关领域，都可以应用ELISPOTELISPOT技术。技术。n我们国内，主要用疫苗研究方面，尤其是艾滋病疫苗我们国内，主要用疫苗研究方面，尤其是艾滋病疫苗。中国药品生物制品检定所：中国药品生物制品检定所： 2003年 预防用DNA疫苗临床前研究技术指导原则预防用以病毒为载体的活疫苗制剂的技术指标原则“使用ELISPOT方法检测淋巴细胞分泌干扰素功能，应该作为检测和评价疫苗的细胞免疫的有效方法” WHOWHO：WHO-UNAIDS-sponsored training workshop 2003年 在艾滋病(HIV)疫苗的研究中，推荐使用ELISPOT检测淋
42、巴细胞分泌干扰素功能。在我国举办了技术培训学习班。nELISPOTELISPOT在国内大规模应用的时代已经到来。在国内大规模应用的时代已经到来。达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.国外国外ELISPOTELISPOT应用应用疫苗研究疫苗研究nHIV疫苗：在小鼠上检验抗原性；在猴体检验保护功效；在人体检验免疫原性；研究猴子感染SIV动力学；I型与II型HIV引发的CTL反应差别；nHBV疫苗：疫苗的免疫原性；疫苗的治疗效果；疫苗的给药途径；不同病人的敏感性n肿瘤疫苗 抗肿瘤甲胎蛋白和热休克蛋白DNA疫苗；DC疫苗预防胃癌；DC疫苗治疗白血病；卵巢癌中的细胞免
43、疫情况；日本临床DC疫苗治疗黑色素瘤的情况n其它疫苗：疟疾疫苗：疟疾疫苗产生的CD4+8+和体液免疫反应；克隆病疫苗；肝癌疫苗；HPV疫苗；n抗原表位筛选： 结核杆菌的CTL表位；丙肝CTL表位；HIV-1表位肽；用肽库筛选T细胞表位肽；HIV蛋白酶和整合酶功能域中的CTL表位；痘病毒的T细胞表位自身免疫病研究、诊断自身免疫病研究、诊断n风湿性关节炎、红斑狼疮 研究红斑狼疮患者肾中的抗体分泌细胞的影响n牛皮癣（银屑病）：致病机理，易感病人预测，治疗效果评估nI-型糖尿病：致病机理，临床检测，易感病人预测n麻风病 多重硬化症n结核病：多重抗药性、症状不明显的结核病早期诊断器官移植器官移植n肾移植
44、 肝移植 骨髓移植：次要组织相容性抗原(H)在骨髓移植中的影响；肝移植免疫耐受n研究CCR2在移植排斥中的角色；研究移植耐受性差异；免疫系统研究免疫系统研究n研究抗体分泌细胞：B细胞的成熟；活化；抗体分泌细胞在粘膜的分布n研究粘膜免疫反应：不同的粘膜部位；局部免疫与系统免疫；各种疫苗的粘膜保护效果n研究基础免疫学：研究基因治疗中的外源蛋白免疫耐受；肿瘤疫苗对细胞免疫的刺激；研究DC细胞的功能调节；抗疟疾研究；HIV患者中细胞免疫强度和病毒载量的关系；同时评估多种细胞免疫反应；测定针对原生肿瘤细胞的免疫反应；急性丙肝病人体内的细胞免疫反应；老年人对流感病毒免疫反应低下的原因分析；达科为生物达科为
45、生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.ELISPOTELISPOT在国内的应用在国内的应用HIVHIV疫苗疫苗HBV(HBV(乙肝乙肝) )疫苗疫苗SARSSARS疫苗疫苗HEV(HEV(戊肝戊肝) )疫苗疫苗乙肝诊断与治疗评估乙肝诊断与治疗评估I-I-性糖尿病诊断性糖尿病诊断肝移植排斥反应肝移植排斥反应B B细胞抗体分泌研究细胞抗体分泌研究达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.ELISPOTELISPOT在在HIVHIV疫苗研究中的应用疫苗研究中的应用n体液免疫与细胞免疫：细胞免疫在控制体液免疫与细胞免疫：细胞免疫在控制HIV主治方面发
46、挥了主主治方面发挥了主要作用要作用n目前没有任何疫苗能预防目前没有任何疫苗能预防HIV的感染，但是可以减轻感染之后的感染，但是可以减轻感染之后的发病情况，甚至不再发病。的发病情况，甚至不再发病。n评价评价HIV疫苗的好坏不再与看它激发的抗体，而在于看它激发疫苗的好坏不再与看它激发的抗体，而在于看它激发的病毒特异性细胞免疫反应。的病毒特异性细胞免疫反应。n目前评价这个指标最好的方法就是：目前评价这个指标最好的方法就是：ELISPOT!疫苗免疫两周后，猴PBMC对HIV病毒裂解物的IFN-ELISPOT反应A, 肌肉与粘膜联合免疫；B,单独肌肉免疫。 Makitalo B. et. al. Enh
47、anced cellular immunity and systemic control of SHI V infection by combined par enter al and mucosal administration of a DNA prime M VA boost vaccine regimen.J Gen Virol. 2004:2407-19. 达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.ELISPOTELISPOT在在HIVHIV基础研究中的应用基础研究中的应用u鸡尾酒疗法（HAART）可以抑制一切处于活跃状态的HIV病毒，但是不能根除之。
48、u有些病毒躲在处于休眠状态的CD4+记忆系胞中。u本文作者测定了那些休眠的、分泌HIV抗原的CD4+记忆细胞的频率。The ELISPOT approach to targeting the HIV-1-Ag-SCs could be a useful method for identifying latently HIV-1 infected CD4 T cells carrying replication-competent HIV-1 in patients responding to HAART. Fondere JM, et. al. Human immunodeficiency v
49、irus type 1 (HIV-1) antigen secretion by latently infected resting CD4+ T lymphocytes from HIV-1-infected individuals. J Virol. 2004 Oct;78(19):10536-42. 达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.ELISPOTELISPOT在在I-I-型糖尿病诊断中的应用型糖尿病诊断中的应用n糖尿病分好多种，糖尿病分好多种，I-I-型是由自身免疫引起的型是由自身免疫引起的n免疫系统攻击胰腺中的胰岛素分泌细胞，使之裂解、死免疫系
50、统攻击胰腺中的胰岛素分泌细胞，使之裂解、死亡亡n不等糖尿病发作，体内就有许多糖尿病相关自身抗体和不等糖尿病发作，体内就有许多糖尿病相关自身抗体和活化的免疫细胞活化的免疫细胞n检测这些抗体和免疫细胞可以提前数年预测糖尿病的发检测这些抗体和免疫细胞可以提前数年预测糖尿病的发生生nELISPOTELISPOT可以预测和诊断可以预测和诊断I-I-型糖尿病型糖尿病达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.ELISPOTELISPOT在乙肝诊断中的应用在乙肝诊断中的应用n检测乙肝不需要检测乙肝不需要ELISPOTELISPOT，检测抗原抗体就可以了，检测抗原抗体就可以了n但是判断乙肝病人在病程中所处的免疫状态（急性期、但是判断乙肝病人在病程中所处的免疫状态（急性期、平稳期、耐受期、恢复期）以及判断各种治疗的效果就平稳期、耐受期、恢复期）以及判断各种治疗的效果就需要需要ELISPOTELISPOT了。了。n这些参数对乙肝治疗方案、治疗时期和治疗评估特别重这些参数对乙肝治疗方案、治疗时期和治疗评估特别重要。要。达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.PubMed年度收录年度收录ELISPOT相关论文的数量变化相关论文的数量变化 达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.谢谢大家！谢谢大家！
