第十章紫外可见分光光度法

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1、第十章第十章 紫外紫外- -可见分光光可见分光光度法度法 概述概述第一节第一节 紫外紫外-可见分光光度法的基本原理和可见分光光度法的基本原理和概念概念第二节第二节 紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计第三节第三节 紫外紫外-可见分光光度法的应用可见分光光度法的应用主要内容概述概述 分光光度法是物质分子对光的选择性吸分光光度法是物质分子对光的选择性吸收而建立起来的分析方法。按物质吸收光收而建立起来的分析方法。按物质吸收光的波长不同，可分为的波长不同，可分为可见分光光度法、紫可见分光光度法、紫外分光光度法外分光光度法及及红外分光光度法。红外分光光度法。紫外可见分光光度计的主要应用方面 粮食系统：

2、对维生素A、C、E、K、山梨酸、苯甲 酸、棉酸、甲脂、乙酸脂、胡萝卜素、烟酸、总氨基酸等的检测;对微量元素，例如： 钾、铁、硒、碘、铜、磷、锰等也可用紫外可见分光光度计检测;特别是对人体有毒有害的微量元素的检测工作中使用更加广泛。 标准片测试：计量部门对在用的各类紫外可见分光光度计仪器的杂散光( SL)、光度准确度(PA) 等关键性能技术指标的检测，必须用比被检测仪器的档次高的紫外可见分光光度计，测试一块石英 片的SL和PA。然后用这块石英片作为二级标准检测被测的紫外可见分光光度计。 药检系统：我国和世界很多国家的药典，都明确规定许多药品，一定要用紫外可见分光光度计检测;它是药厂和药检系统必备

3、的检测仪器(工具)。 石油工业：石油里一般都含有芳烃杂质，全世界基本上都用紫外可见分光光度计检测。 水质监测：水里的氨氮、亚硝酸盐致癌物质，一般都用紫外可见分光光度计检测。 环保系统：环境中的有害物质检测、环保材料的检测。 生命科学领域：蛋白质的测试波长为280nm、核酸的测试波长为260nm、氨基酸的测试波长为230nm、糖类的测试波长218nm、多糖的测试波长206nm等等，生命科学领域的这些物质的测试波长都在紫外区。 农药及其残留物：例如:粮食(大米、小麦中的氧化稀土)、食品添加剂(5,-鸟苷酸二钠)、蔬菜(亚硝酸盐、甲胺磷、西维因、氨氮、敌敌畏)、 瓜果、茶叶等的农残检测，大多用紫外可

4、见分光光度计进行。据美国癌症研究中心报道，人类癌症的90%来自有机物(天然有机和金属有机);其中农残为主。所以紫外可见分光光度计在农残的检测中非常有用。 渔业(水产品)质量控制：海水、淡水鱼类、贝类、虾类、海蜇类等中的苯、总三卤甲烷、甲苯基三唑、多氯联苯、氟、汞等，一般也是采用紫外可见分光光度计检测。 发展史18 1 5年夫琅和费(J. Fraunhofer)仔细观察了太阳光谱，发现太阳光谱中有600多条暗线，并且对主要的8条暗线标以A、B、C、DH的符号。这就是人们最早知道的吸收光谱线，被称为“夫琅和费线”。但当时对这些线还不能作出正确的解释。 1859年本生(RBunsen)和基尔霍夫(G

5、Kirchhoff)发现由食盐发出的黄色谱线的波长和“夫琅和费线，；中的D线波长完全一致，才知一种物质所发射的光波长（或频率），与它所能吸收的波长（或频率）是一致的。1862年密勒( Miller)应用石英摄谱仪测定了一百多种物质的紫外吸收光谱。他把光谱图表从可见区扩展到了紫外区，并指出：吸收光谱不仅与组成物质的基团质有关。接着，哈托莱( Hartolay)和贝利(Balley)等人，又研究了各种溶液对不同波段的截止波长。并发现吸收光谱相似的有机物质，它们的结构也相似。并且，可以解释用化学方法所不能说明的分子结构问题，初步建立了分光光度法的理论基础，以此推动了分光光度计的发展。1918年美国国

6、家标准局研制成了世界上第一台紫外可见分光光度计（不是商品仪器，很不成熟）。此后，紫外可见分光光度士很快在各个领域的分析工作中得到了应用。物质对光吸收的定量关系很早就受到了科学家的注意并进行了研究。皮埃尔布格（Pierre Bouguer）和约翰海因里希朗伯（Johann Heinrich Lambert）分别在1729年和1760年阐明了物质对光的吸收程度和吸收介质厚度之间的关系；1852年奥古斯特比尔（August Beer）又提出光的吸收程度和吸光物质浓度也具有类似关系，两者结合起来就得到有关光吸收的基本定律布格朗伯比尔定律，简称比尔朗伯定律。朗伯德国数学家布格法国数学家、地球物理学家、大

7、地测量学家和天文学家。他也以“造船工程之父”之名为人所知。随后，人们开始重视研究物质对光的吸收，并试图在物质的定性、定量分析方面予以使用。因此，许多科学家开始研究以比耳定律为理论基础的仪器装置。经过一个漫长的时期后，美国Beckman公司于1945年，推出世界上第一台成熟的紫外可见分光光度计商品仪器。从此，紫外可见分光光度计的仪器和应用开始得到飞速发展。 概述概述 一、紫外一、紫外-可见分光光度法：可见分光光度法：是研究物质在紫外是研究物质在紫外- 可见光区可见光区(200 800 nm)分子吸收光谱的分析方分子吸收光谱的分析方法。法。 可见光区可见光区 400760nm；紫外光区；紫外光区2

8、00400nm。二二.紫外紫外可见分光光度法的特点可见分光光度法的特点（1）灵敏度较高：灵敏度可达）灵敏度较高：灵敏度可达10-510-7g/mL（2）选择性较好：多组分共存溶液中，无需化学分选择性较好：多组分共存溶液中，无需化学分离即可测定离即可测定（3）准确度高：仪器设备较好，相对误差一般为）准确度高：仪器设备较好，相对误差一般为0.5%（4）用途广泛：既可定性分析，又可定量分析）用途广泛：既可定性分析，又可定量分析三、紫外三、紫外可见吸收光谱可见吸收光谱(一一)紫外紫外可见吸收光谱的产生：可见吸收光谱的产生： 1.分子吸收光谱分子吸收光谱物质分子内部三种运动形式：（1）电子）电子绕绕原子

9、核的运动；原子核的运动；（2）原子在其平衡位置附近的相对振动；）原子在其平衡位置附近的相对振动；（3）分子本身绕其重心的转动。）分子本身绕其重心的转动。 分子的总能量可以认为等于这三种运动能量之和。即： 分子中各种不同运动状态都具有一定的能级, 具有三种三种不同能级：电子能级电子能级电子绕原子核的运动；电子绕原子核的运动； E=120eV振动能级振动能级原子在其平衡位置上的振动原子在其平衡位置上的振动 E=0.051eV 转动能级转动能级分子整体绕其重心的转动。分子整体绕其重心的转动。 E=0.0050.05eV 如果用如果用 E电子电子， E振动振动以及以及E转动转动表示各能级表示各能级差，

10、则：差，则： 由分子中的电子能级、振动能级和转动能级跃迁产生的光谱称分子吸收光谱。 2分子吸收光谱的分类：分子吸收光谱的分类： 分分子子内内运运动动涉涉及及电电子子能能级级、振振动动能能级级和和转转动动能级能级三种跃迁能级，三种跃迁能级，对应的波谱区范围如下：E电 约为120eV 为为为为1240 60nm 紫外、可见光区(电子) 100800nmE振 约为0.51eV 为为为为25 1.25 (中)红外区 (振动) 2.550 mE转约为10-40.05eV 为为为为1.25cm 25 （远）红外区(转动) 501990 m 若用一连续辐射的电磁波照射分子，将照若用一连续辐射的电磁波照射分子

11、，将照射前后光强度的变化转变为电信号（吸光度射前后光强度的变化转变为电信号（吸光度 ） ，并记录下来，然后，并记录下来，然后以波长以波长为横坐标，以吸为横坐标，以吸光度光度 A为纵坐标，为纵坐标，就可以得到光强度变化对波就可以得到光强度变化对波长的关系曲线图长的关系曲线图分子吸收光谱图。分子吸收光谱图。吸收曲线与最大吸收波长吸收曲线与最大吸收波长 max同一种物质对不同波长光的吸光度不同。如如KMnO4在在400nm吸收少，吸收少，在在525nm吸收最大，吸收最大，吸光度最大处对吸光度最大处对应的波长称为应的波长称为最大吸收波长最大吸收波长max不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似,max

12、不变。而对于不同物质，它们的吸收曲线形状和max则不同。 吸收曲线可以提供物质的结构信息， 并作为物质定性分析的依据之一。3紫外-可见吸收光谱的产生 由于分子吸收紫外-可见光区的电磁辐射，分子中电子能级的跃迁而产生。 （吸收能量=两个跃迁能级之差）第一节第一节 紫外紫外-可见分光光度法的基本原理和可见分光光度法的基本原理和概念概念一、电子跃迁类型一、电子跃迁类型 紫外紫外可见吸收光谱是分子中的可见吸收光谱是分子中的价电子价电子在不同的在不同的分子轨道之分子轨道之间跃迁而产生的间跃迁而产生的。 价电子：价电子： 电子电子 饱和的饱和的键键 电子电子 不饱和的不饱和的键键 n 电子电子 孤对电子孤

13、对电子(非成键的非成键的)COHn s sH轨道:电子围绕分子或原子运动的几率分布。轨道不同,电子所具有的能量也不同。分子轨道:成键成键轨道和* *反键反键轨道成键成键轨道和* *反键反键轨道 n 非键轨道 *s s *RKE ,Bn E 成键轨道反键轨道,非键轨道。它们的能它们的能级高低为：级高低为：n n * * * *s s *RKE,Bn E 当外层电子吸收紫外或可见辐射后，就从基态向激发态(反键轨道)跃迁。主要有四四种种跃迁，跃迁，所需能量大小顺序大小顺序为 n n *s s *RKE,Bn E 1、*跃迁跃迁 能量很高，能量很高，150nm200nm200nm的光的光) )，但是当

14、它们与生色团相连时，但是当它们与生色团相连时，就会发生就会发生n n共轭作用共轭作用， 从而使电子跃迁的能量下降从而使电子跃迁的能量下降, ,增增强生色团的生色能力强生色团的生色能力, ,会使生色团的吸收峰向会使生色团的吸收峰向长波长波方向移动，并且增加其吸光度。方向移动，并且增加其吸光度。 如苯环的一个氢原子被一些基团取代后，苯环在如苯环的一个氢原子被一些基团取代后，苯环在254nm处的吸收带的最大吸收位置和强度就会改变。处的吸收带的最大吸收位置和强度就会改变。化合物化合物取代基取代基苯苯254300氯苯氯苯264320溴苯溴苯262325苯酚苯酚2731780苯甲醚苯甲醚2722240 由

15、于化合物的结构改变由于化合物的结构改变,如发生如发生共轭作用共轭作用、引入助引入助色团色团,以及以及溶剂改变溶剂改变等等, 使最大吸收波长使最大吸收波长max和吸收和吸收强度发生变化强度发生变化:7.红移和蓝移max向长波长波方向移动称为红移红移，向短波短波方向移动称为蓝移蓝移 (紫移紫移)。1）共轭体系的存在）共轭体系的存在-红移红移 如如CH2=CH2的的 - *跃迁，跃迁， max=165200nm； 而而1,3-丁二烯，丁二烯， max=217nm 2) 2) 引入助色团引入助色团：红移红移 如如: :取代基为含孤对电子取代基为含孤对电子-OH-OH、-OR-OR、 -NH-NH2 2

16、、 - -ClCl、-Br-Br的的助色团助色团。 3)溶剂效应。溶剂效应。 溶剂的极性不同也会引起某些化合物溶剂的极性不同也会引起某些化合物的吸收带的吸收带红移红移或或蓝移蓝移，这种作用称为溶剂，这种作用称为溶剂效应。效应。 n *跃迁发生在含有杂原子的不饱跃迁发生在含有杂原子的不饱和化合物中，吸收峰随溶剂极性增加而向和化合物中，吸收峰随溶剂极性增加而向短波短波方向移动，即产生方向移动，即产生蓝移蓝移。正己烷正己烷正己烷正己烷CHClCHClCHClCHCl3 3 3 3CHCHCHCH3 3 3 3OHOHOHOHH H H H2 2 2 2O O O O * * maxmax/ nm /

17、 nm 230230230230238238238238237237237237243243243243n n * * maxmax/ nm / nm 329329329329315315315315309309309309305305305305亚异丙酮的溶剂效应亚异丙酮的溶剂效应亚异丙酮的溶剂效应亚异丙酮的溶剂效应 *跃迁可以发生在任何具有不饱和键跃迁可以发生在任何具有不饱和键的有机化合物分子中，吸收峰随溶剂极性增的有机化合物分子中，吸收峰随溶剂极性增加向长波方向移动，即产生加向长波方向移动，即产生红移红移。8.增色效应和减色效应 由由于于化化合合物物的的结结构构改改变变或或其其它它效效应

18、应,使使吸吸收收强强度度增增加加的的效效应应称称为为增色色效效应应；使使吸吸收收强度减弱的效应称为强度减弱的效应称为减色效应色效应。9.强带和弱带：摩尔吸光系数max 104 强带 min C=O、N=N等基团的分子中等基团的分子中,由由n*跃迁产生的吸收带称为跃迁产生的吸收带称为( ) A. K吸收带吸收带 B. E吸收带吸收带 C. B吸收带吸收带 D. R吸收带吸收带苯环(三三)各种常见有机化合物紫外吸收光各种常见有机化合物紫外吸收光谱谱 1. 饱和烃及其取代衍生物饱和烃及其取代衍生物 饱和烃类：饱和烃类： 分子中只含有键，因此只能产生*跃迁，最大吸收峰一般小于150nm，已超出紫外可见

19、分光光度计的测量范围。 饱和烃的取代衍生物：饱和烃的取代衍生物： 如卤代烃，其卤素原子上存在n电子，可产生n* 的跃迁。 n* 的能量低于*。其相应的吸收波长小于200nm 。 直接用烷烃和卤代烃的紫外吸收光谱分析这些化合物的实用价值不大。但是它们是测定紫外吸收光谱的良好溶剂。例：己烷、氯仿。2. 不饱和烃及共轭烯烃不饱和烃及共轭烯烃 ( (A) A) 非共轭不饱和烯烃非共轭不饱和烯烃 除含有键外，还含有键，它们可以产生*和*两种跃迁。 *跃迁的能量小于 *跃迁。例如，在乙烯分子中， *跃迁最大吸收波长为180nm左右。 C=C 生色基团， 但 *200nm。 max=177nm （B）共轭烯

20、烃）共轭烯烃 * 在不饱和烃类分子中，当有两个以上的双键共轭时，随着共轭系统的延长， *跃迁的吸收带 将明显向长波方向移动，吸收强度也随之增强。共轭双键愈多，红移愈显著，甚至产生颜色。 在在共轭体系中，共轭体系中， *跃迁产生的吸收带又称跃迁产生的吸收带又称为为K带带。 3. 羰基化合物羰基化合物Y=H,R * * 150-160150-160nm nm （K K） n n * * 275-295nm 275-295nm （R R） C=O基团可产生基团可产生n* 、 n*、 *三个三个吸收带，吸收带， n* 吸收带又称吸收带又称R带带，落于近紫外或紫，落于近紫外或紫外光区，外光区， R带带吸

21、收较吸收较弱弱（ maxmax100100） 4. 苯及其衍生物苯及其衍生物l苯有三个吸收带，是由 *与苯环振动能级跃迁叠加引起；也称精细结构吸收带精细结构吸收带E1带：180nm（MAX = 60，000）；E2带： 204nm（ MAX = 8，000 ）；B带：带： 255nm （MAX = 200）。 当苯环上有取代基时，苯的三个特征谱带都会发生显著的变化，其中影响较大的是E2带和B谱带， B带带简化简化， E2红移红移。取代基不同，变化程度不同，可由此鉴定各种取代取代基不同，变化程度不同，可由此鉴定各种取代基基 例：例： max B带带 max E2 苯苯 254 204 甲苯甲苯

22、262 208 苯酚苯酚 271 213 苯甲酸苯甲酸 272 230 四、影响吸收带的主要因素四、影响吸收带的主要因素溶剂效应：溶剂效应： 溶剂除了影响吸收峰位置外,还影响吸收强度及光谱形状,所以一般应注明所用溶剂。 由n-*跃迁产生的吸收峰，随溶剂极性增加，发生蓝移；由-*跃迁产生的吸收峰，随溶剂极性增加，发生红移。 溶剂极性溶剂极性C=O的溶剂效应n *跃迁：蓝移；跃迁：蓝移； ； *跃迁：跃迁：红移红移； ；吸收带 max(正己正己烷烷) max(氯仿氯仿) max(甲醇甲醇) max(水水)*230238237243n*329315309305非极性非极性 极性极性 n n n p

23、n p 非极性非极性 极性极性n * * 在在n *跃迁中跃迁中,基态的极性大基态的极性大, n电子与极性溶剂之间形电子与极性溶剂之间形成较强的氢键成较强的氢键,使基态能量降低大于反键轨道与极性溶剂相互使基态能量降低大于反键轨道与极性溶剂相互作用所降低的能量作用所降低的能量,因而跃迁所需能量变大因而跃迁所需能量变大,故故蓝移蓝移; *跃迁中跃迁中,激发态的极性大激发态的极性大, 因而激发态与极性溶剂因而激发态与极性溶剂之间相互作用所降低能量降低大于基态与极性溶剂相互作用所之间相互作用所降低能量降低大于基态与极性溶剂相互作用所降低的能量降低的能量,因而跃迁所需能量变小因而跃迁所需能量变小,红移红

24、移。溶剂的选择溶剂的选择 由于溶剂对电子光谱图影响很大，因此，在吸收光谱由于溶剂对电子光谱图影响很大，因此，在吸收光谱图上或数据表中必须图上或数据表中必须注明注明所用的所用的溶剂溶剂。与。与已知已知化合物紫外化合物紫外光谱作光谱作对照对照时也应注明所用的溶剂时也应注明所用的溶剂是否相同是否相同。 在进行紫外光谱法分析时，必须正确选择溶剂。选择在进行紫外光谱法分析时，必须正确选择溶剂。选择溶剂时注意下列几点：溶剂时注意下列几点：（1）溶剂应能很）溶剂应能很好好地地溶解溶解被测试样，所成溶液应具有良好的被测试样，所成溶液应具有良好的化学和光学化学和光学稳定性稳定性。 （2）在溶解度允许的范围内，尽

25、量选择）在溶解度允许的范围内，尽量选择极性较小极性较小的溶剂。的溶剂。（3）溶剂在样品的吸收光谱区应）溶剂在样品的吸收光谱区应无明显吸收无明显吸收。五、五、朗伯朗伯比耳比耳定律定律 朗伯朗伯(Lambert)和比耳和比耳(beer)分别于分别于1760年年和和1852年研究了光的吸收与有色溶液液层的厚年研究了光的吸收与有色溶液液层的厚度及溶液浓度的定量关系，奠定了分光光度分析度及溶液浓度的定量关系，奠定了分光光度分析法的理论基础。法的理论基础。(一一)光的选择性吸收与物质颜色的关系：光的选择性吸收与物质颜色的关系：(二二)郎伯郎伯比尔定律：比尔定律： (三三)偏离比尔定律的因素偏离比尔定律的因

26、素(一一)光的选择性吸收与物质颜色的关系：光的选择性吸收与物质颜色的关系：1可见光的颜色和互补色： 在可见光范围内，不同波长的光的颜色是不同的。平常所见的白光是一种复合光，它是由各种颜色的光按一定比例混合而得的。利用棱镜等分光器可将它分解成红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等不同颜色的单色光。 白光除了可由所有波长的可见光复合得到外，还可由适当的两种颜色的光按一定比例复合得到。能复合成白光的两种颜色的光叫互补色光。单色光单色光单色光单色光: :单一波长的光单一波长的光单一波长的光单一波长的光。复合光复合光复合光复合光: :由不同波长的光组合而成的光由不同波长的光组合而成的光由不同波长的光组合而成的光由

27、不同波长的光组合而成的光。光的互补光的互补光的互补光的互补: :若两种不同颜色的单色光按一定的强度比若两种不同颜色的单色光按一定的强度比若两种不同颜色的单色光按一定的强度比若两种不同颜色的单色光按一定的强度比例混合得到白光，那么就称这两种单色光为互补例混合得到白光，那么就称这两种单色光为互补例混合得到白光，那么就称这两种单色光为互补例混合得到白光，那么就称这两种单色光为互补色光，这种现象称为光的互补。色光，这种现象称为光的互补。色光，这种现象称为光的互补。色光，这种现象称为光的互补。单色光、复合光、光的互补单色光、复合光、光的互补2、物质的颜色与吸收光的关系：、物质的颜色与吸收光的关系：当白光

28、照射到物质上时，如果物质对白光中某种颜色的光产生了选择性的吸收，则物质就会显示出一定的颜色。物质所显示的颜色是吸收光的互补色。 /nm颜色颜色互补光互补光400-450紫紫黄绿黄绿450-480蓝蓝黄黄480-490绿蓝绿蓝橙橙490-500蓝绿蓝绿红红500-560绿绿红紫红紫560-580黄绿黄绿紫紫580-610黄黄蓝蓝610-650橙橙绿蓝绿蓝650-760红红蓝绿蓝绿白光白光绿绿黄黄 青青橙色橙色 青蓝青蓝红蓝红蓝紫紫例如，当一束白光（复例如，当一束白光（复合光）通过硫酸铜溶液合光）通过硫酸铜溶液时，水合铜离子中的电时，水合铜离子中的电子发生跃迁，选择性的子发生跃迁，选择性的吸收复合

29、光中的吸收复合光中的黄光黄光，其他颜色的光不被吸收其他颜色的光不被吸收而透过溶液，故溶液呈而透过溶液，故溶液呈现出黄色的互补色现出黄色的互补色蓝色蓝色。我们通常见到的。我们通常见到的有色物质，都是由于他有色物质，都是由于他们吸收了可见光的部分们吸收了可见光的部分光，呈现出吸收光颜色光，呈现出吸收光颜色的互补色。的互补色。(二二)朗伯朗伯-比尔定律比尔定律 设入射光强度为设入射光强度为I0，吸收光强度为吸收光强度为Ia,透透射光强度为射光强度为 It，则，则 I0= Ia+ It1、吸光度和透光率、吸光度和透光率入射光入射光 I0透射光透射光 It吸光度吸光度: 为透光率倒数的对数，用为透光率倒

30、数的对数，用A表示，表示，即即 A=lg1/T=lgI0/It透光率透光率：透光率为透过光的强度：透光率为透过光的强度It与入射光强与入射光强度度I0之比，用之比，用T表示：表示： 即即 T= It/I0 T 取值为取值为0.0 % 100.0 % 全部吸收全部吸收 T = 0.0 % 全部透射全部透射 T = 100.0 %A = K A = K b bc c 定义：定义：当一束单色光通过含有吸光物质的溶液后，当一束单色光通过含有吸光物质的溶液后，溶液的吸光度溶液的吸光度A A与吸光物质的浓度与吸光物质的浓度c c及吸收层厚度成正比及吸收层厚度成正比 式中比例常数式中比例常数与吸光物质的本性

31、，入射光波长及温与吸光物质的本性，入射光波长及温度等因素有关。度等因素有关。c为吸光物质浓度，为吸光物质浓度，b为透光液层厚为透光液层厚度。度。朗伯朗伯-比尔定律是紫外比尔定律是紫外-可见分光光度法的理论基础。可见分光光度法的理论基础。2.朗伯朗伯-比耳定律比耳定律 (1)(1)成立条件：成立条件：1)1)样品溶液因素：上式仅在稀溶液成立；样品溶液因素：上式仅在稀溶液成立； 2)2)仪器因素：上式仅适用于单色光。仪器因素：上式仅适用于单色光。(2)(2)吸光系数吸光系数 1)定定义义：吸吸光光物物质质在在一一定定下下单单位位浓浓度度及及单单 位厚度时的吸光度。位厚度时的吸光度。意意义义：衡衡量

32、量显显色色反反应应灵灵敏敏度度物物理理量量，衡衡量量物物质对光吸收能力的量。质对光吸收能力的量。 2)影影响响因因素素：物物质质本本性性、溶溶剂剂、入入射射光波长光波长 不同物质的特征常数。不同物质的特征常数。 同同一一物物质质，不不同同溶溶剂剂中中吸吸光光系系数数不不同；同； 不同，不同，吸光系数吸光系数不同；不同； 入入射射光光为为单单色色光光才才适适用用光光的的吸吸收收定定律。律。吸光系数吸光系数当当b b以以cmcm，c c以以g/Lg/L为单位，为单位，称为吸光系数，称为吸光系数，用用 a a表示。表示。A= a cba a的单位为的单位为L/(L/(g.cmg.cm) )3)种类：

33、种类： 吸光系数吸光系数a（浓度为（浓度为g/L） 摩尔吸光系数摩尔吸光系数（浓度为（浓度为mol/L） 比吸光系数比吸光系数E1%1cm （浓度为（浓度为g/100mL）它表示物质的浓度为它表示物质的浓度为1g/L，液层厚度为，液层厚度为1cm时，溶液的吸光度。时，溶液的吸光度。 当当b以以cm，c以以mol/L为单位，为单位，称为摩尔吸光系数，称为摩尔吸光系数，用用 表示。表示。 A= cb 的单位为的单位为L/mol.cm，它表示物质的浓度为它表示物质的浓度为1mol/L，液液层厚度为层厚度为1cm时，溶液的吸光度。时，溶液的吸光度。摩尔吸光系数摩尔吸光系数比吸光系数比吸光系数(或百分或

34、百分吸光系数吸光系数) 比吸光系数是指百分含量为比吸光系数是指百分含量为1%， b为为1cm时时的吸光度值，用的吸光度值，用 表示。表示。 表示物质的浓度为表示物质的浓度为1g/100mL ，液层厚度为，液层厚度为1cm时，溶液的吸光度时，溶液的吸光度。小结:吸光系数的几种表示方法 C -C -mol / Lmol / L -摩尔吸光系数摩尔吸光系数摩尔吸光系数摩尔吸光系数 L L mol mol 1 1 cm cm - -1 1C-C-g / Lg / La-a-吸光系数吸光系数吸光系数吸光系数 L L g g 1 1 cm cm -1-1C-C-g / 100 mLg / 100 mLE

35、E1%1%1cm1cm-比比比比吸光系吸光系吸光系吸光系数数数数100mL g100mL g11 cm cm -1-1 、 E E1%1%1cm1cm之间的相互换算：之间的相互换算：之间的相互换算：之间的相互换算： 例例: : 氯霉素氯霉素(M(M为为323.15)323.15)的水溶液在的水溶液在278nm278nm处处有吸收峰有吸收峰, ,设用氯霉素纯品配制设用氯霉素纯品配制100mL100mL含有含有2.00mg2.00mg的溶液的溶液, ,以以1.00cm1.00cm厚的吸收池在厚的吸收池在278nm278nm处测得的透光率为处测得的透光率为24.3%,则求其则求其 和和 值。值。 =

36、-lgT/bc=-lg 24.3%/0.002=0.614/0.002=307 =0.1M =0.1323.15307=9920323.15307=9920摩尔吸光系数摩尔吸光系数 吸光物质的特征常数吸光物质的特征常数吸光物质的特征常数吸光物质的特征常数 ( ( ) )；在最大吸收波长；在最大吸收波长；在最大吸收波长；在最大吸收波长 maxmax处，常以处，常以处，常以处，常以 maxmax表示表示表示表示 。 maxmax越大表明该物质的吸光能力越强，测定的越大表明该物质的吸光能力越强，测定的越大表明该物质的吸光能力越强，测定的越大表明该物质的吸光能力越强，测定的灵敏度越高。灵敏度越高。灵敏

37、度越高。灵敏度越高。 104，为强吸收，是灵敏的。，为强吸收，是灵敏的。 (3) 吸光度吸光度A的加和性的加和性 若溶液中含有不止一种吸光物质，则总若溶液中含有不止一种吸光物质，则总吸光度等于各个组分吸光度之和：吸光度等于各个组分吸光度之和： A=A1+A2+.+An 例例: 1.朗伯朗伯-比尔定律的积分表达式为比尔定律的积分表达式为lgI0/It =bc ，在利用光度计进行实际测定中，在利用光度计进行实际测定中，I0是指是指 入射光入射光强度强度，It 是指是指透过光强度透过光强度。 2.用紫外用紫外-可见分光光度法测定某化合物的含量，可见分光光度法测定某化合物的含量，当其浓度为当其浓度为C

38、mol/L 时，透光率为时，透光率为T，当其浓度由，当其浓度由C变为变为0.5Cmol/L时，在同样测定条件下，其透光时，在同样测定条件下，其透光率应为（率应为（ C ） A. T3/2 B. T2 C. T1/2 D. T1/3 3. 在某波长处，用在某波长处，用2.0cm的比色皿，测得某试液的比色皿，测得某试液的透光度为的透光度为60%，若改用，若改用1.0cm的比色皿，则原的比色皿，则原试液的透光度应为（试液的透光度应为（ D ） A. 0.11 B. 0.22 C. 0.66 D. 0.77 (三三)、偏离朗伯、偏离朗伯-比耳定律的因素比耳定律的因素LambertLambertLamb

39、ertLambertBeerBeerBeerBeer定律的前提定律的前提定律的前提定律的前提条件之一是入射光为条件之一是入射光为条件之一是入射光为条件之一是入射光为单色光。单色光。单色光。单色光。 但实际上难以获得真正意但实际上难以获得真正意但实际上难以获得真正意但实际上难以获得真正意义上的纯单色光。分光光度义上的纯单色光。分光光度义上的纯单色光。分光光度义上的纯单色光。分光光度计只能获得近乎单色的狭窄计只能获得近乎单色的狭窄计只能获得近乎单色的狭窄计只能获得近乎单色的狭窄光普通带。复合光可导致对光普通带。复合光可导致对光普通带。复合光可导致对光普通带。复合光可导致对朗伯朗伯朗伯朗伯- - -

40、 -比耳定律的正或负偏比耳定律的正或负偏比耳定律的正或负偏比耳定律的正或负偏离。离。离。离。1.01.00.50.50 0A AC C正偏离正偏离正偏离正偏离负偏离负偏离负偏离负偏离1.光学因素光学因素 (1)非单色光引起的对吸光定律的偏离非单色光引起的对吸光定律的偏离 对吸收光谱而言，对吸收光谱而言，b 和和 c 固定，固定， 随波长变化的情况，单一波长，随波长变化的情况，单一波长， 固固定；不同波长，定；不同波长， 不同。因此，非单色光不同。因此，非单色光将导致对吸光定律的偏离。将导致对吸光定律的偏离。（2） 杂散光杂散光 是指从单色器分出的光不在入射光谱带是指从单色器分出的光不在入射光谱

41、带宽度范围内，与所选波长相距较远。宽度范围内，与所选波长相距较远。 杂散光来源：杂散光来源：仪器本身缺陷；光学元件污仪器本身缺陷；光学元件污染造成。染造成。2.2.溶液本身的化学和物理因素引起的偏离溶液本身的化学和物理因素引起的偏离 (1)(1)溶液介质不均匀引起的溶液介质不均匀引起的 实际样品的混浊，蒸馏水中的微生物，存在散实际样品的混浊，蒸馏水中的微生物，存在散射以及共振发射等，均可引起吸光质点的吸光特性射以及共振发射等，均可引起吸光质点的吸光特性变化变化。会引起对朗伯会引起对朗伯会引起对朗伯会引起对朗伯- - - -比耳定律的偏离。比耳定律的偏离。比耳定律的偏离。比耳定律的偏离。 ( (

42、 ( () ) ) )浓度的限制稀溶液浓度的限制稀溶液浓度的限制稀溶液浓度的限制稀溶液 所有的吸光质点之间不发生相互作用；所有的吸光质点之间不发生相互作用；所有的吸光质点之间不发生相互作用；所有的吸光质点之间不发生相互作用；假定只有在稀溶液假定只有在稀溶液假定只有在稀溶液假定只有在稀溶液(C 10(C 10(C 10(C 10C10C10C10-2-2-2-2 mol/L mol/L mol/L mol/L 时，吸光质点间可能发生时，吸光质点间可能发生时，吸光质点间可能发生时，吸光质点间可能发生缔合等相互作用，直接影响了对光的吸收。缔合等相互作用，直接影响了对光的吸收。缔合等相互作用，直接影响

43、了对光的吸收。缔合等相互作用，直接影响了对光的吸收。()化学偏离化学偏离 恒定的化学环境恒定的化学环境 铬酸盐或重铬酸盐溶液中存在下列平衡：铬酸盐或重铬酸盐溶液中存在下列平衡： Cr42- 2H = Cr272- H2 黄色黄色 橙色橙色 max=375nm 1max=350nm Cr42-、 Cr272-的吸光性质不同，即的吸光性质不同，即()不同。此时溶液不同。此时溶液pH 对测定有重要影响。对测定有重要影响。第三节第三节 紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计光电比色法光电比色法一、主要部件的性能与作用一、主要部件的性能与作用 基本结构:0.575光源光源单色器单色器吸收池吸收池检测器检

44、测器显示显示光源光源单色器单色器吸收池吸收池检测器检测器信号显示系统信号显示系统样品样品1光源：光源：2单色器：单色器：包括狭缝、准直镜、色散元件包括狭缝、准直镜、色散元件 棱镜棱镜对不同波长的光折射率不同对不同波长的光折射率不同色散元件色散元件 光栅光栅利用利用衍射和干涉衍射和干涉 钨灯或卤钨灯钨灯或卤钨灯可见光源可见光源 3501000nm氢灯或氘灯氢灯或氘灯 紫外光源紫外光源 200360nm3吸收池：吸收池： 玻璃玻璃能吸收能吸收UV光，仅适用于可见光区光，仅适用于可见光区 石英石英不能吸收紫外光，适用于紫外和可见光区不能吸收紫外光，适用于紫外和可见光区 要求：匹配性（对光的吸收和反射

45、应一致）要求：匹配性（对光的吸收和反射应一致）4检检测测器器：检检测测器器的的功功能能是是检检测测信信号号、测测量量单单色色光光透透过溶液后光强度变化的一种装置过溶液后光强度变化的一种装置光电池光电池光电管光电管光电倍增管光电倍增管二极管阵列检测器二极管阵列检测器光电倍增管光电倍增管: :是检测微弱光最常用的光电元件，它的灵敏度比是检测微弱光最常用的光电元件，它的灵敏度比一般的光电管要高一般的光电管要高200200倍，因此可使用较窄的单色器狭缝，从倍，因此可使用较窄的单色器狭缝，从而对光谱的精细结构有较好的分辨能力。而对光谱的精细结构有较好的分辨能力。5记录装置：讯号处理和显示系统记录装置：讯

46、号处理和显示系统 它的作用是放大信号并以适当方式指示或记它的作用是放大信号并以适当方式指示或记录下来。常用的信号指示装置有直读检流计、电录下来。常用的信号指示装置有直读检流计、电位调节指零装置以及数字显示或自动记录装置等。位调节指零装置以及数字显示或自动记录装置等。很多型号的分光光度计装配有微处理机，一方面很多型号的分光光度计装配有微处理机，一方面可对分光光度计进行操作控制，另一方面可进行可对分光光度计进行操作控制，另一方面可进行数据处理。数据处理。二、紫外二、紫外-可见分光光度计的类型可见分光光度计的类型 按其光学系统可分为单波长分光光度计单波长分光光度计和双双波长分光光度计。波长分光光度计

47、。1.单波长单光束分光光度计单波长单光束分光光度计 目前国内广泛采用目前国内广泛采用721721型分光光度计。具有结构简型分光光度计。具有结构简单、价格低廉、操作方便、维修也比较容易，适用于单、价格低廉、操作方便、维修也比较容易，适用于常规分析。常规分析。 单波长单光束分光光度计单波长单光束分光光度计0.575光源光源单色器单色器吸收池吸收池检测器检测器显示显示 2.单波长双光束分光光度计单波长双光束分光光度计： 国产710型、日立UV-340型等。 双光束方法因光束几乎同时通过样品池和参比池， 因此可消除光源不稳产生的误差-提高测量的精确度。 单单波长双光束分光光度计波长双光束分光光度计比值

48、比值光源光源单色器单色器吸收池吸收池检测器检测器显示显示光束分裂器光束分裂器 经单色器分光后经反射镜分解为强度相经单色器分光后经反射镜分解为强度相等的两束光，一束通过参比池，一束通过等的两束光，一束通过参比池，一束通过样品池。样品池。 光度计能自动比较两束光的强度，此比光度计能自动比较两束光的强度，此比值即为试样的透光率，经对数变换将它转值即为试样的透光率，经对数变换将它转换成吸光度并作为波长的函数记录下来。换成吸光度并作为波长的函数记录下来。 双光束分光光度计一般都能自动记录吸双光束分光光度计一般都能自动记录吸收光谱曲线。由于两束光同时分别通过参收光谱曲线。由于两束光同时分别通过参比池和样品

49、池，还能自动消除光源强度变比池和样品池，还能自动消除光源强度变化所引起的误差。化所引起的误差。 3.双波长分光光度计双波长分光光度计： 国产WFZ800-5型、岛津UV-260型优点：是可以在有背景干扰或共存组分吸收干忧的情况下对某组分进行定量测定定量测定。特点： 是利用吸光度差值定量 消除干扰和吸收池不匹配引起的误差3双波长分光光度计双波长分光光度计 由同一光源发出的光被分成两束，分别经过由同一光源发出的光被分成两束，分别经过两个单色器，得到两束不同波长（两个单色器，得到两束不同波长（ 1和和 2）的单色光，利用切光器使两束光以一定的频的单色光，利用切光器使两束光以一定的频率交替照射同一吸收

50、池率交替照射同一吸收池 1 1为选好的测定波长，一般为待测物质的为选好的测定波长，一般为待测物质的 maxmax 2 2为选好的参比波长，一般为待测物质的为选好的参比波长，一般为待测物质的 minmin测得的是样品在两种波长测得的是样品在两种波长 1 1和和 2 2处的吸光度之差处的吸光度之差 A A， A A为扣除了背景吸收的吸光度为扣除了背景吸收的吸光度 A=A 1 -A 2= （K 1 -K 2） CL优点：优点：（1 1）大大提高了测定准确度，可完全扣除背景）大大提高了测定准确度，可完全扣除背景（2 2）可用于微量组分的测定）可用于微量组分的测定（3 3）可用于混浊液和多组分混合物的定

51、量测定）可用于混浊液和多组分混合物的定量测定一、纯度检查一、纯度检查二、定性分析二、定性分析三、定量分析三、定量分析 四、四、有机物结构有机物结构辅助推断辅助推断五五、比色法、比色法第四节第四节 紫外吸收光谱的应用紫外吸收光谱的应用单组分的定量方法单组分的定量方法多组分的定量方法多组分的定量方法 一、纯度检查一、纯度检查 如果一化合物在紫外区没有吸收峰，而其中的杂质有较强吸收，就可方便地检出该化合物中的痕量杂质。 例如例如：要检定甲醇或乙醇中的杂质苯，可利用苯在254nm处的B吸收带，而甲醇或乙醇在此波长处几乎没有吸收。 二、定性分析二、定性分析 max , max：化合物特性参数，可作为化合

52、物特性参数，可作为定性定性依据；依据； 有机化合物紫外吸收光谱：反映结构中生色团和助色团的特性，不完全反映整个分子特性；结构确定的结构确定的辅辅助助工具工具； （一）（一） 制作试样的吸收曲线并与标准紫外光谱制作试样的吸收曲线并与标准紫外光谱对照对照； max ， max都相同，可能可能是一个化合物； 标准谱图库：46000种化合物紫外光谱的标准谱图 The sadtler standard spectra ,Ultraviolet 与标准吸收光谱谱图的比较时注意：相同化学环境与测量条件与标准吸收光谱谱图的比较时注意：相同化学环境与测量条件与标准吸收光谱谱图的比较时注意：相同化学环境与测量条件

53、与标准吸收光谱谱图的比较时注意：相同化学环境与测量条件三、三、 定量分析定量分析（一）单组分的定量方法依据：朗伯依据：朗伯-比耳定律比耳定律 当入射光波长一定时，待测溶液的吸光度A与其浓度（c）和液层厚度（b）成正比，即 吸光度： A= b c1吸光系数法 2对照法3标准曲线法 （为摩尔吸光系数）1.吸光系数法 根据根据A = K bc ,若若b和和k已知已知,即可根据测得的即可根据测得的A求出被测物的浓度。求出被测物的浓度。 c=A/kc k( 或 )可以从手册或文献中查到,这种方法称绝对法。例:维生素B12的水溶液在361nm处的 值是207,盛于1cm吸收池中,测得溶液的吸光度为0.41

54、4,则溶液浓度为:C=A/(b )=0.414/(2071)=0.0020g/100mL 2.对照法：对照法： 在一定条件下，配制标准溶液和样品溶液，在一定条件下，配制标准溶液和样品溶液，在在max下测下测 A 标准溶液标准溶液 As=bCs 被测溶液被测溶液 Ax=bCx Cx=CsAx/As 注意：注意： Cs 与与 Cx大致相当大致相当3.标准曲线法 1 2 3 4 5 样品样品标液标液 C1 C2 C3 C4 C5 CX A A1 A2 A3 A4 A5 AXACXAX例如：芦丁含量测定例如：芦丁含量测定标标 准准 曲曲 线线 法法0.710mg/25mL0.710mg/25mL 芦芦

55、 丁丁 含含 量量 测测 定定 （二）多组分的定量方法（二）多组分的定量方法测量依据测量依据吸光度的加和性：吸光度的加和性：(一一) 两组分吸收光谱不重两组分吸收光谱不重叠叠 （互不干扰互不干扰） 在在 处测定组分处测定组分a, 在在 处测组分处测组分b,如如:(二二) 两组分吸收光谱部分重两组分吸收光谱部分重叠叠 ：测：测A1b组分不干扰组分不干扰可按单组分定量测可按单组分定量测(三三) 两组分吸收光谱完全重叠两组分吸收光谱完全重叠混合样品测混合样品测定定1. 解线性方程组法解线性方程组法过程：过程： 例: 紫外-可见光分光度法可用于混合物的分析, 其定量依据是:吸光度的加和性吸光度的加和性

56、如图设 a、b 的浓度分别为 ca和 cb，在入射光波长为2时的摩尔吸收系数分别为2(a)和2(b)，则在使用 2.0 cm 的比色皿时，在2 测得的总吸光度为 :22aca + 22bcb四、有机化合物结构辅助推断四、有机化合物结构辅助推断 1. 可获得的结构信息可获得的结构信息（1）在210250nm波长范围内有强吸收峰，则可能含有2个共轭双键；若在260350nm波长范围内有强吸收峰，则说明该有机物含有3个或3个以上共轭双键。（2）若在20300nm波长范围内有中等强度的吸收峰则可能含苯环，假设有精细结构的话，可能是苯环的特征吸收。了解共轭程度，对不饱和化合物的异构体进行判别了解共轭程度

57、，对不饱和化合物的异构体进行判别（3）若在270350nm波长范围内有低强度吸收峰,（n* 跃迁），则可能含有羰基。（4）若在200750nm波长范围内无吸收峰，则可能是直链烷烃、环烷烃或仅含一个双键的烯烃等。 五 比色法(一一 )显色反应及反应条件的选择显色反应及反应条件的选择 1.显色反应：显色反应：待测组分转变成有颜色（能吸待测组分转变成有颜色（能吸收）的化合物。收）的化合物。 常用的显色反应：配位反应、氧化还原反常用的显色反应：配位反应、氧化还原反应。应。2.2.显色反应的要求：显色反应的要求： (1) 选择性好，干扰小选择性好，干扰小 (2) 灵敏度高，灵敏度高，大大 (3) 有色化

58、合物组成恒定有色化合物组成恒定 (4) 有色化合物性质稳定有色化合物性质稳定 (5) 有色化合物与显色剂之间的颜色有色化合物与显色剂之间的颜色 差较大差较大 3显色反应条件的选择显色反应条件的选择（1）显色剂用量：）显色剂用量：过量，改变产物组成；过量，改变产物组成； 过少，色淡，降低过少，色淡，降低A。（2）酸度：）酸度： 对显色剂颜色有影响，对显色剂颜色有影响， 对显色反应的影响，对显色反应的影响， 对待测组分存在状态的影响。显色剂对待测组分存在状态的影响。显色剂弱酸，参与配位反应弱酸，参与配位反应 选最佳酸度：选选最佳酸度：选A-pH曲线平坦值部分曲线平坦值部分对应的对应的pH。（3）显

59、色温度：）显色温度：绘制绘制A-T（）曲线。）曲线。（4）显色时间：）显色时间：作作A-t（min）曲线）曲线（5）干扰离子：）干扰离子：消除干扰方法：消除干扰方法： 加入配位掩蔽剂。加入配位掩蔽剂。 加入氧化剂和还原剂。加入氧化剂和还原剂。 选择适宜的显色条件。选择适宜的显色条件。 分离干扰离子。分离干扰离子。(二二)参比溶液的选择参比溶液的选择 参比溶液是用于参比溶液是用于调节仪器工作零点调节仪器工作零点的，的，若选择不适当，对测量读数的影响较大。若选择不适当，对测量读数的影响较大。1. 溶剂空白溶剂空白 当试液、试剂、显色剂均当试液、试剂、显色剂均无色时，用无色时，用蒸馏水蒸馏水作参比溶

60、液；作参比溶液； 2. 试剂空白试剂空白 如果显色剂或其他试剂略如果显色剂或其他试剂略有色，可用有色，可用不含待测组分的试剂溶液不含待测组分的试剂溶液作参作参比溶液。比溶液。3. 试样空白试样空白 如果试样中有色，如果试样中有色， 显色剂无色时，可显色剂无色时，可用用试样溶液试样溶液作参比溶液；作参比溶液； 如果试样中有色如果试样中有色,显色剂也略有色时，可显色剂也略有色时，可在试液中加入适当掩蔽剂，将待测组分掩在试液中加入适当掩蔽剂，将待测组分掩蔽后，再加入显色剂，以此溶液作参比溶蔽后，再加入显色剂，以此溶液作参比溶液。液。在特种钢工业生产中,铬基合金钢中微量镁的测定常用铬黑T(EBT)显色的方法,EBT本身为蓝色,与Mg2+配合后化合物显红色,在制作工作曲线测定微量Mg时,应选用的参比溶液是_。 含EBT的溶液（试剂空白）