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1、实验二实验二 PCRPCR检测乙肝病检测乙肝病毒毒-PCR-PCR分分析析apoBapoB基因多态性基因多态性分子医学技能分子医学技能分子医学技能分子医学技能实验安排实验安排乙肝病毒乙肝病毒乙肝病毒乙肝病毒PCRPCR实验操作实验操作实验操作实验操作apoBapoB基因基因基因基因PCRPCR多态性分析多态性分析多态性分析多态性分析血清样本处理血清样本处理血清样本处理血清样本处理（模板的制备）（模板的制备）（模板的制备）（模板的制备）PCRPCR检测乙肝病毒检测乙肝病毒检测乙肝病毒检测乙肝病毒PCRPCR反应上机反应上机反应上机反应上机口腔细胞总口腔细胞总口腔细胞总口腔细胞总DNADNA（模板
2、）（模板）（模板）（模板）apoBapoB基因基因基因基因PCRPCR实验操作实验操作实验操作实验操作PCRPCR反应上机反应上机反应上机反应上机一、一、PCR基本原理及相关知识基本原理及相关知识 聚聚合合酶酶链链反反应应（polymerase chain reaction，PCR）是是一一种种体体外外扩扩增增特特异异DNA片片断断的的技技术术,能能在在短短时时间间内获得数百万个特异内获得数百万个特异DNA序列的拷贝。序列的拷贝。特异性特异性、高效性高效性PCRPCR技术的创建技术的创建一、最初的理论描述一、最初的理论描述KhoranaKhorana Khorana Khorana (1971
3、)(1971)等等最最早早提提出出核核酸酸体体外外扩扩增增的的设设想想：“经经DNADNA变变性性，与与合合适适的的引引物物杂杂交交，用用DNADNA聚聚合合酶酶延延伸伸引引物物，并并不不断断重重复复该该过过程程便便可可合合成成tRNAtRNA基因。基因。”但但由由于于当当时时基基因因序序列列分分析析方方法法尚尚未未成成熟熟，热热稳稳定定DNADNA聚聚合合酶酶尚尚未未报报道道以以及及引引物物合合成成的的困困难难，这这种种想想法法似似乎乎没没有有实实际际意意义义。所所以以，KhoranaKhorana的设想被人们遗忘了的设想被人们遗忘了PCRPCR技术的创建技术的创建二、二、PCRPCR技术的
4、发明技术的发明Kary B. MullisKary B. Mullis19851985年年，Kary Kary MullisMullis在在CetusCetus公公司司工工作作期期间间，发明了发明了PCRPCRMullisMullis要要合合成成DNADNA引引物物来来进进行行测测序序工工作作，却却常为没有足够多的模板常为没有足够多的模板DNADNA而烦恼而烦恼19831983年年4 4月月的的一一个个星星期期五五晚晚上上，他他开开车车去去乡乡下别墅的路上下别墅的路上Kary B. MullisKary B. Mullis（19441944）TheNobelPrizeinChemistry19
5、93forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)method（1/2oftheprize ）PCR扩增扩增DNA片段的原理片段的原理 PCR是在模板DNA、引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应，整个扩增过程包括若干个循环，每个循环包括三步： 变性：加热，模板DNA形成两条单链 退火：降温，模板单链DNA与引物配对结合 延伸：在DNA聚合酶及镁离子等存在的条件下， 引物3-端向前延伸，合成与模板配对的新链Step 1. DenaturationStep 1. Denaturation（变性）（变性）Temperat
6、ure: 95 degrees Celsius lThereactionisfirstheatedtodenature(separate)thesidesofthedouble-strandedDNAStep 2. AnnealStep 2. Anneal（退火）（退火）lthencooledtoallowtheprimerstofindandbindtotheircomplementarysequencesontheseparatedstrands.Step 3. ExtendStep 3. Extend（延伸）（延伸）lthepolymerasetoextendtheprimersinto
7、newcomplementarystrands.Repeat the CyclesRepeat the CycleslRepeatedheatingandcoolingcyclesmultiplythetargetDNAexponentially,sinceeachnewdoublestrandseparatestobecometwotemplatesforfurthersynthesis.Thisprocesscanthenberepeatedupto30Thisprocesscanthenberepeatedupto30timestocreateoverabillioncopiesofth
8、etimestocreateoverabillioncopiesofthesequencesequence. 1个循环后的结果个循环后的结果第第2个循环后的结果个循环后的结果模版模版第第1次的产物次的产物第第2次的产物次的产物AABBCD第第3个循环后的结果个循环后的结果第第3次的产物次的产物第第4个循环后的结果个循环后的结果第第4次的产物次的产物1A，1B，2C，2D，2EAB2C2D2E1A，1B，3C，3D，6（22+2）EAB3C3D6E第第N个循环后的结果个循环后的结果第第N次的产物次的产物1A，1B，（N-1）C，（N-1）D，(2n-2+2) E(2n-2+2) EABN-1CN
9、-1DPCRPCR反应体系的组成及功能反应体系的组成及功能PCR的完成是在一个0.2或0.5ml的EP管中完成，一个完整的PCR反应体系应包括以下成分： 引物：是预扩增DNA片段两端的已知序列，是保证PCR特异性的关键因素; PCR引物设计的原则；目的是提高扩增的效率与特异性。 终浓度为0.10.5umol/L Taq DNA聚合酶 有良好的热稳定性，具有5-3聚合酶活性。高保真Taq酶具有3-5核酸外切酶的活性，PCR扩增过程中如果产生了错配的碱基，它可以将其切掉，从而保证了扩增的准确性。 其活性对Mg2+浓度非常敏感 终浓度一般为：2.5u/100ul 最适温度一般为72 模板DNA 相对
10、于分子克隆、酶切、连接、标记等，PCR对DNA模板纯度的要求并不严格。 模板用量也是很低的，一般认为102104拷贝模板就可以满足要求。 dNTP Mix (dATP, dGTP, dTTP, dCTP)： 已有商品化的混合液，终浓度一般为20200umol/L dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量y10PCR反应buffer： 已作成商品化的产品，它包括： 250500mmol/L KCl； 100500mmol/LTris-HAC（pH8.4）； 1520mmol/L MgCl2（对Taq酶的活性影响很大，一般浓度为
11、1.5 2.0mmol/L，实际应用时根据反应体系的情况进行调整。）； 0.1%明胶或牛血清白蛋白（稳定酶活性） dd H2O 调节反应体积液体石蜡油 （减少PCR过程中，尤其是变性时液体蒸发所造成的产物的丢失） 影响影响PCR的主要因素的主要因素 PCRPCR反应体系的各个反应体系的各个反应体系的各个反应体系的各个组分组分组分组分模板的质量、引物的设计、模板的质量、引物的设计、模板的质量、引物的设计、模板的质量、引物的设计、TaqTaq酶的活性酶的活性酶的活性酶的活性 PCRPCR循环的温度与时间循环的温度与时间循环的温度与时间循环的温度与时间预变性、变性、退火、延伸预变性、变性、退火、延伸
12、预变性、变性、退火、延伸预变性、变性、退火、延伸 PCRPCR循环的次数和平台效应循环的次数和平台效应循环的次数和平台效应循环的次数和平台效应 操作操作操作操作环境环境环境环境避免污染避免污染避免污染避免污染 一般一般PCRPCR实验设计实验设计样品反应不同的退火温度梯度不同的Mg2浓度不同的模板浓度阴性对照反应阳性对照反应PCRPCR技术的特点技术的特点l灵敏度高灵敏度高1.1.3030轮循循环, ,扩增量达增量达2 23030个拷个拷贝（10109 9拷拷贝）2.2.将模板从皮克将模板从皮克(pg=10(pg=10-12-12) )量量级扩增到微克增到微克(ug=10(ug=10-6-6)
13、 )水平水平3.3.能从能从100100万个万个细胞中胞中检出一个靶出一个靶细胞胞4.4.病毒病毒检测的灵敏度可达的灵敏度可达3 3个个PFUPFU5.5.细菌菌检测的最小的最小检出率出率为3 3个个细菌菌l特异性特异性强强引物序列与模板引物序列与模板结合的特异性合的特异性l快速快速简便便 一次性加好反一次性加好反应液，液，2 24 4小小时即可完成即可完成扩增增生物学基础研究目的基因扩增和鉴定 、DNA测序、定点突变医学临床应用遗传疾病基因诊断、致病病原体检测 、组织配型人类基因组工程遗传图谱的构建、DNA测序、表达图谱法医学物证鉴定个体识别、亲子鉴定其他动植物检疫、系统进化研究、分子考古学
14、PCRPCR的应用领域的应用领域二、二、PCR试剂盒检测试剂盒检测HBVDNA 实验操作及注意事项HBVHBV检测试剂盒介绍检测试剂盒介绍构成：DNA提取液检测反应管（PCR反应体系，上样buffer，石蜡油）阳性模板设计：反应管中有针对HBV的特异性引物，若出现与阳性对照相同的结果，则说明待测样品中含有HBVPCR实验具体操作实验具体操作1 1、待测血清中、待测血清中DNADNA简单制备简单制备待测血清待测血清4040m ml + l + 4040m ml DNA l DNA 提取液，混匀提取液，混匀 沸水浴沸水浴1010minmin，10000rpm5min10000rpm5min样品模板
15、样品模板样品模板样品模板（用做检测）（用做检测）（用做检测）（用做检测）无菌水无菌水无菌水无菌水4040m m m ml+l+4040m m m mlDNAlDNA提取液提取液提取液提取液 沸水浴沸水浴沸水浴沸水浴1010minmin，10000rpm5min10000rpm5min上清上清上清上清空白模板空白模板空白模板空白模板（做阴性反应）（做阴性反应）（做阴性反应）（做阴性反应）上清上清2 2、实验分组、实验分组阳性反应阳性反应阳性反应阳性反应1 1个个个个阴性反应阴性反应阴性反应阴性反应1 1个个个个样品检测反应样品检测反应样品检测反应样品检测反应4 4个个个个阳性模板阳性模板阳性模板
16、阳性模板2ul2ul空白模板空白模板空白模板空白模板2ul2ul样品模板样品模板样品模板样品模板2ul2ul混匀，混匀，混匀，混匀， 6000rpm5s 6000rpm5s，上上上上PCRPCR仪仪仪仪933933minmin预变性预变性预变性预变性 9 933，45s45s5555，45s45s7272，60s60s 7272保温保温保温保温5 5minmin3 35 5个循环个循环个循环个循环3 3、PCRPCR反应程序反应程序三、三、PCR检测检测人人apoB基因多态性分析基因多态性分析PCR实验操作及注意事项实验操作及注意事项实验目的及预期结果实验目的及预期结果l目的：目的：p检测来自
17、不同来自不同样本的基因多本的基因多样性性l检测技技术：apoB基因的基因的PCRl预期期结果：果：p琼脂糖脂糖电泳条泳条带的差异的差异apoBapoB多态性分析的基本实验过程多态性分析的基本实验过程来源不同的待测样本来源不同的待测样本PCRPCR扩增目的基因扩增目的基因琼脂糖电泳结果比较分析琼脂糖电泳结果比较分析实验主要步骤实验主要步骤lapoB基因基因 PCR，1人人1份份p分装分装PCR反反应液每份液每份21ul（包括：Taq，引物一对，反应缓冲液，dNTP）p加入模板加入模板4ul（口腔口腔细胞基因胞基因组DNA）p混混匀，离心匀，离心p上上PCR仪PCRPCR程序：程序：程序：程序： 9494 5min 5min（预变预变性）性）性）性） 9494 1min 1min（变变性）性）性）性） 6060 4min 4min （退火（退火（退火（退火+ +延伸）延伸）延伸）延伸） 6060 5min 5min（续续延伸）延伸）延伸）延伸）30个循环HBV-PCR反应结果预测反应结果预测
