药效学和毒理学研究

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1、药物药效和毒理研究思路与方法药物药效和毒理研究思路与方法（PharmacodynamicsandToxicologyStudybeforeClinic） 药学实验教学中心药学实验教学中心 廖昌军廖昌军一、药效学研究一、药效学研究（Pharmacodynamics）新药研究的三个阶段和审评尺度安全性安全性有效性有效性质量可控性质量可控性药学研究药学研究药理毒理研究药理毒理研究临床研究临床研究相关名词解读n药理学：研究药物与机体（含病原体）相互作用及作用规律的科学。n药效学（药物效应动力学）：研究药物对机体的作用及作用机制。n药代学（药物代谢动力学）：研究机体对药物的处置，即吸收、分布、代谢、排泄

2、。主要药效学n1.概念：主要药效学研究指与受试药物期望的治疗目的相关的活性和/或作用的研究，如降血糖药评价其降血糖作用。n它是新药临床前评价的重要内容之一，主要目的在于确定受试药物的药理作用，阐明其作用特点并揭示其可能的作用机制。2.研究思路与方法n(1) 研究方法n(2) 动物选择n(3) 实验设计n(4) 样本数n(5) 给药途径(6) 剂量(7) 给药次数(8) 观察指标（1）研究方法n用体内、体外两种以上试验方法获得证明，其中一种必须是整体的正常动物或模型动物。 ( (2) )动物选择 一般来说，主要药效学实验所选择的动物应是品系清楚、成年健康、雌雄各半、符合实验动物管理要求、且对药效

3、学反映敏感的动物。但抗肝癌或胃癌等药效学试验时就用有免疫缺陷的动物，如裸鼠。药效学试验是在动物身上进行的，因此动物的质量与药效关系密切，动物的种类、品系、年龄、性别和饲养管理等都有影响。1.动物的预筛n大部分动物只要选用符合实验动物管理要求的动物就行。但有些药理实验还必须首先将这些动物进行过筛，即预筛。选择在一定药理反应指标内的动物，以免因个体差异太大而影响结果的评判，然后进行随机分组试验。n如镇痛试验用小鼠；镇咳试验用豚鼠进行电刺激嗽时约有5的豚鼠可对刺激无反应，这些动物应弃去；利尿药与抗慢性肾衰药试验用大鼠也需预筛，测定无蛋白尿者方可入选使用。2.年龄的选择n n一般选用成年动物。但有些实

4、验要选用年龄不同的动物。一般选用成年动物。但有些实验要选用年龄不同的动物。n n如观察药物对生长、发育、内分泌等作用时，以幼年动物为如观察药物对生长、发育、内分泌等作用时，以幼年动物为好；而观察抗衰老作用时，则宜用老年动物或衰老过程较快好；而观察抗衰老作用时，则宜用老年动物或衰老过程较快的模型动物；豚鼠致喘不仅要用纯种，而且体重宜小于的模型动物；豚鼠致喘不仅要用纯种，而且体重宜小于200g200g的豚鼠引喘较敏感；抗肿瘤的药物中细胞毒类药物药敏试验的豚鼠引喘较敏感；抗肿瘤的药物中细胞毒类药物药敏试验用大鼠宜用用大鼠宜用3 34 4周龄，约周龄，约505070g70g较宜；鸭乙型肝炎病毒试较宜；

5、鸭乙型肝炎病毒试验需用验需用1 1日龄北京雏鸭；减肥药试验用刚断乳的日龄北京雏鸭；减肥药试验用刚断乳的SDSD大鼠，约大鼠，约50g50g，用于营养性肥胖模型。若是下丘脑性肥胖模型则用新，用于营养性肥胖模型。若是下丘脑性肥胖模型则用新生乳鼠，自出生头一天起生乳鼠，自出生头一天起sc sc l5l5谷氨酸钠造模。谷氨酸钠造模。3.性别的选择n n临床前药效学试验通常用雌雄各半动物。n n但不少药效学试验需用雄性动物: 如抗癫痫药的癫痫模型动物；抗动脉粥样硬化药和调血脂药的实验动物；精神药药效试验的动物；抗血小板聚集药常用雄性兔和大鼠，以避免雌性动物的性周期对实验结果的影响。3.性别的选择n n有

6、些药效学试验宜用雌性动物。如药物对雌性动物内分泌及生殖系统的作用当然用雌性动物。此外，镇痛药试验的热板法和足跖刺激法，由于阴囊部位对热较敏感，不用雄鼠而用雌性鼠。 4.种属异同性n n动物和人、不同动物之间、同一动物不同品系之间对药动物和人、不同动物之间、同一动物不同品系之间对药物的反应均有相似性的一面和差异性的另一面。正确认物的反应均有相似性的一面和差异性的另一面。正确认识这种异同性，对正确评估药效学评价的结果意义重大。识这种异同性，对正确评估药效学评价的结果意义重大。n n既不因相似性而一味迷信实验药效学结果好坏就决定临既不因相似性而一味迷信实验药效学结果好坏就决定临床疗效的优劣；也不因差

7、异性就忽视认真完成药效学试床疗效的优劣；也不因差异性就忽视认真完成药效学试验，错误地强调最终的判断；一般来讲，动物身上做不验，错误地强调最终的判断；一般来讲，动物身上做不出药效学结果是不能批准上临床的。出药效学结果是不能批准上临床的。人与动物的差异n n回顾新药评价历史，就发现不少药物在动物实验无效，回顾新药评价历史，就发现不少药物在动物实验无效，而临床应用不差。如环丝氨酸对动物感染结核无效，但而临床应用不差。如环丝氨酸对动物感染结核无效，但对结核病人却肯定有效；保泰松在动物实验中未见有消对结核病人却肯定有效；保泰松在动物实验中未见有消炎作用，但对人却有肯定疗效。当然也有相反的例子，炎作用，但

8、对人却有肯定疗效。当然也有相反的例子，动物实验有效，临床应用无效。如苄基青霉素对动物感动物实验有效，临床应用无效。如苄基青霉素对动物感染有效，对人却很差。还有对动物疗效较差，而对人却染有效，对人却很差。还有对动物疗效较差，而对人却较好。如丁二醇二甲烷磺酸酯较好。如丁二醇二甲烷磺酸酯( (马利兰、白消安马利兰、白消安) )对动物白对动物白血病疗效较差，但对人的慢性髓性白血病的疗效却较好。血病疗效较差，但对人的慢性髓性白血病的疗效却较好。n n普鲁卡因局部应用，对人是局麻作用，对马却是中枢兴奋作用；普鲁卡因局部应用，对人是局麻作用，对马却是中枢兴奋作用；n n肾上腺素能诱导人的血小板聚集，但对大鼠

9、无此作用；肾上腺素能诱导人的血小板聚集，但对大鼠无此作用；n n丙咪嗪对人有抗抑郁作用，对小鼠和兔无此作用；丙咪嗪对人有抗抑郁作用，对小鼠和兔无此作用；n n人注射组胺引起血压升高，而大鼠和猫则血压下降；人注射组胺引起血压升高，而大鼠和猫则血压下降；n n人对催吐药敏感，但鼠类和兔不引起呕吐；人对催吐药敏感，但鼠类和兔不引起呕吐；n n抗抗5-HT5-HT药溴麦角酰胺对大鼠的足趾浮肿有抗炎消肿作用，但对人药溴麦角酰胺对大鼠的足趾浮肿有抗炎消肿作用，但对人却无此作用；却无此作用；n n别嘌呤醇治疗人的痛风、高尿酸血症效果很好，因它能抑制黄嘌别嘌呤醇治疗人的痛风、高尿酸血症效果很好，因它能抑制黄嘌

10、呤氧化酶，但在批准上临床时费了很长时间，因对动物无效，究呤氧化酶，但在批准上临床时费了很长时间，因对动物无效，究其原因是人对嘌呤代谢的最终产物排泄的是尿酸，而其它哺乳动其原因是人对嘌呤代谢的最终产物排泄的是尿酸，而其它哺乳动物是将嘌呤分解成尿囊素后排泄。物是将嘌呤分解成尿囊素后排泄。 选取动物模型n要求：公认性；与临床疾病的相似性。n类型：自发性动物模型（难得）及诱发性或实验性动物模型（常见）两大类。n很多动物模型有待改进、完善，更多的有待于创新建立。动物模型自发性动物模型：指实验动物未经任何有意识的人工处置，在自然情况下所发生的疾病。突变系的遗传疾病和近交系的肿瘤模型，如高血糖小鼠、肥胖症小

11、鼠、高血压大鼠等。实验性动物模型：通过化学、物理、生物等因素，人工诱发器官、组织或全身性损害，如动物发热模型、动物佐剂性关节炎模型、四氧嘧啶所致糖尿病大鼠等。实验动物v实验动物的三个特殊要求实验动物的三个特殊要求n人工培育，遗传背景清楚人工培育，遗传背景清楚n生活环境设施应达国标中的等级标准生活环境设施应达国标中的等级标准n专门用于科研、教学、生产、检定、实验等专门用于科研、教学、生产、检定、实验等v常用实验动物常用实验动物n小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠（仓鼠）小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠（仓鼠）n兔、犬、猴、猫、小型猪、鸡等。兔、犬、猴、猫、小型猪、鸡等。动物实验应注意的问题n遵循国际遵循国际“”原则原

12、则替代（替代（replacementreplacement）：）：指使用没有知觉的实验材料代替活体动物，或指使用没有知觉的实验材料代替活体动物，或使用低等动物替代高等动物进行试验，并获得相同实验效果的科学方法。使用低等动物替代高等动物进行试验，并获得相同实验效果的科学方法。减少（减少（reductionreduction）：）：使用较少量的动物获取同样多的试验数据或使用使用较少量的动物获取同样多的试验数据或使用一定数量的动物能获得更多的试验数据的科学方法一定数量的动物能获得更多的试验数据的科学方法 。 优化（优化（refinementrefinement）：）：指在必须使用动物进行有关实验时，

13、要尽量减少指在必须使用动物进行有关实验时，要尽量减少非人道程序对动物的影响范围和程度，可通过改进和完善实验程序，避非人道程序对动物的影响范围和程度，可通过改进和完善实验程序，避免减少或减轻给动物造成的疼痛和不安，或为动物提供适宜的生活条件，免减少或减轻给动物造成的疼痛和不安，或为动物提供适宜的生活条件，已保证动物的健康和康乐，保证动物实验结果可靠性和提高实验动物福已保证动物的健康和康乐，保证动物实验结果可靠性和提高实验动物福利的科学方法。利的科学方法。 n善待动物善待动物n自我保护自我保护（3）实验设计 应符合随机、对照、重复的原则。对照组设计包括阳性对照组、阴性对照组（空白对照组、正常对照组

14、）和模型对照组。阳性药选择公认的、已批准上市的或药典上记载的、药理作用机制相同的药物。（4）样本数n小动物（大鼠、小鼠、蛙）：1030例，计量资料10例, 计数资料30例；n中等动物（兔、豚鼠）：812例。计量资料6例,计数资料20例；n大动物（犬、猫、猴）：515例。（5）给药途径n原则上应与临床拟用药途径一致。 （6）剂量n主要药效学试验应设三个剂量组，犬与猴等大动物可设2个剂量组；n通常按等比数原则，整体动物剂量按2倍或3.16倍递增，离体器官剂量按3倍或10倍递增；n安全范围较小的药物（如抗肿瘤药物）可采用等差级数分组；n进行药效对比时，一般选用中效剂量。 同种动物的剂量换算n一般动物

15、的用药剂量均以mg/kg来表示。但也有例外，如金线蛙用强心苷只规定每只蛙用多少mg。n另一些药物，如抗癌药、抗生素、强心苷等，按体表面积用药（mg/m2）更合理。同种动物的剂量换算n体表面积计算公式： A=R W2/3A:动物体表面积（m2）,W:体重（kg）,R:动物的体型系数同种动物之间进行折算，可采用以下比例式： D1：D2=A1：A2=W12/3:W22/3 表1不同动物剂量折算系数动物动物小鼠小鼠大鼠大鼠豚鼠豚鼠家兔家兔猫猫猴猴犬犬人人R R0.060.090.0990.0930.0820.1040.1110.1-0.11同种动物的剂量换算n例：例：已知已知20202g2g小鼠的小鼠

16、的LDLD5050为为58mg/kg 58mg/kg ，现欲取，现欲取40404g4g 的老年小鼠以的老年小鼠以1/10 LD1/10 LD5050剂量进行老年药理学剂量进行老年药理学研究，应取多少剂量为宜？研究，应取多少剂量为宜？n按体表面积算，20g小鼠用药量为0.02kg58mg/kg=1.16mg,其体表面积为0.06（0.02）2/3=0.0044m2，故按体表面积计算的LD50=1.16/0.0044=264mg/m2。n40g小鼠体表面积为0.06（0.04）2/3=0.007m2，故1/10LD50为0.007264/10=0.185mg。体重剂量是0.185/0.04=4.6

17、mg/kg。不同种属动物和人用剂量之间的换算n按公斤体重换算按公斤体重换算 B B种动物剂量（种动物剂量（mg/kg)=mg/kg)=w wA A种动物剂量种动物剂量（mg/kg)mg/kg) 例：已知小鼠对某药的给药剂量为例：已知小鼠对某药的给药剂量为20 mg/kg20 mg/kg，计，计算家兔的给药剂量。算家兔的给药剂量。 查表查表2 2，A A种动物为小鼠，种动物为小鼠，B B种动物为家兔，交叉种动物为家兔，交叉点为点为折算系数折算系数w=0.37w=0.37，故家兔给药剂量为，故家兔给药剂量为 0.370.3720mg/kg=7.4mg/kg20mg/kg=7.4mg/kg 1.5k

18、g 1.5kg家兔用药量为家兔用药量为11.1mg11.1mg。表2动物与人体的每公斤体重等效剂量折算系数表折算系数折算系数小鼠小鼠大鼠大鼠豚鼠豚鼠兔兔猫猫犬犬人人(0.02kg)(0.2kg)(0.4kg)(1.5kg)(2kg)(12kg)(60kg)B B种种动动物物或或成成人人小鼠小鼠(0.02kg)1.001.401.602.702.204.809.01大鼠大鼠(0.2kg)0.701.001.141.882.303.606.25豚鼠豚鼠(0.kg)0.610.871.001.652.053.005.55兔兔(1.5kg)0.370.520.601.001.231.763.30猫猫(

19、2kg)0.300.420.480.811.001.442.70犬犬(12kg)0.210.280.340.560.681.001.80人人(60kg)0.110.160.180.300.370.531.00（7）给药次数n一般应采用单次给药。n如果受试药物的药效作用在给药一段时间后才出现，或者重复给药的非临床研究结果或人用结果出现安全性问题时，应根据这些作用或问题合理设计给药次数。 （8）观察指标n应能反映主要药效作用的药理本质，应选用客观的、灵敏的、特异的、能定量或半定量的指标综合评价药效。 二、毒理学研究二、毒理学研究（ToxicologyStudy）第一节第一节研究目的和意义研究目的和

20、意义1、研究意义 使上市新药在临床治疗剂量下无毒，提高临床使用的安全性安全性。n成功的例子： 如青霉素致敏导致许多病人死亡后，人们便进行多方面的深入研究，了解到引起过敏反应的机制是由于青霉素在人体内遇到蛋白质等物质后，生成青霉素酸等半抗原，找出了与人类有同样反应的动物模型豚鼠，建立起检测这类药物的致敏方法 。 2、局限性nWHO在临床前药物安全实验原则一书中指出：“虽然事先对生物活性物质进行了最仔细彻底的科学研究，但给人使用仍总是不可避免地冒一定风险”。n造成风险的原因主要来自两方面：一方面是新药本身；另一方面来自毒理学研究手段。（1）新药本身新药本身：n不断改变化学结构和由之而产生的药理学特

21、征，往往超出人们原有的知识，超出经验和研究手段所达到的预测能力。 （2）毒理学研究手段毒理学研究手段（动物毒性实验）：实验动物和人为药物反应的种属差异；实验动物的数量有限，那些发生率低的毒性反应，在少量的动物中难以发现；常规毒性试验所用的动物多系实验室培育的品种，反应较单一；毒性实验所用的动物都是健康的，而临床用药的病人则可能同时患有多种疾病；动物毒性试验中采用大剂量的做法与临床用药相差甚远。3、研究内容和要求、研究内容和要求 （1）内容： 急性毒性研究（Acute toxicology） 长期毒性研究（long-term toxicology） 特殊毒性研究（Special toxicolo

22、gy Test） 其他毒性实验 研究内容和意义n特殊毒性试验主要研究哪些外源性物质可能对遗传物质造成损伤以及肿瘤、衰老和畸胎发生的可能性，而不是对机体的一般损伤及其机制的研究。特殊毒性研究特殊毒性研究 致突变实验：致突变实验：1.基因突变实验 2.染色体突变实验 3.DNA损伤测定法 生殖毒性实验：生殖毒性实验：1.三段实验 一般生殖毒性实验（第段实验） 致畸胎实验（第段实验） 围生期毒性试验（第段实验） 2.雌、雄动物生殖毒性实验 3.体外培养实验 4.行为致畸试验 致癌试验致癌试验 药物依赖实验药物依赖实验 毒性代谢动力学试验毒性代谢动力学试验 其他毒性试验其他毒性试验n皮肤给药毒性试验（

23、皮肤给药的急性毒性试验、皮肤给药的长期毒性试验、皮肤刺激试验、皮肤过敏试验、光敏试验）；n腔道用药毒性试验（眼刺激试验、滴鼻剂和吸入剂急性毒性试验、滴鼻剂和吸入剂刺激试验、直肠及阴道用药的急性毒性试验、直肠及阴道用药刺激试验）；n药物依赖性试验（身体依赖性试验与精神依赖性试验）。（2）要求：n 1给出毒性剂量给出毒性剂量 不仅要测出急性毒性的LD50，使我们粗浅了解该药单次给药的毒性剂量，还要了解连续长期给药产生毒性的剂量。n 2确定安全剂量范围确定安全剂量范围 要知道单次或多次给药在多大范围内不仅有效(主要药效学)而且不产生毒性和不良反应，安全范围越大，则作用越好。n3发现毒性反应发现毒性反

24、应 通过动物的毒性反应症状为临床用药的安全性监护提供依据，预防毒性和不良反应的发生，一旦发生便可及时采取措施。n4寻找毒性靶器官寻找毒性靶器官 它不仅能为药物毒性防治提供依据，还有可能为开发新药提供线索。n5判断毒性的可逆与否判断毒性的可逆与否 动物出现毒性反应，必须搞清能否恢复，一般来讲，可逆性毒性反应不影响新药注册，如有不可逆性损伤，则一般不批准上临床。n6解救措施解救措施 特别是作用强而猛、安全范围小的药物。第二节第二节急性毒性试验急性毒性试验（Acute toxicology）n1、定义： 指动物24小时内一次或多次接受一定剂量的受试药物，在一定时间内所出现的毒性反应。 n2、原理：

25、受试物或有毒物质经过多种途径一次大剂量进入动物机体后，破坏动物的生理平衡，也超出了肝脏解毒能力，所以毒物进入中枢神经系统、心血管系统、呼吸系统、肝、肾等重要脏器和系统，促使它们极度兴奋或抑制，以致动物快速死亡。 n3、方法： 定性观察定性观察：观察服药后动物有哪些中毒表现，其毒性反应出现和消失的速度如何，涉及哪些组织和器官，最主要的可能毒性靶器官是什么，损伤的性质及可逆程度如何，中毒死亡过程有哪些特征，可能的死亡原因是什么等。定量观察定量观察：观察药物毒性反应与剂量的关系，主要指标有近似致死剂量，半数致死剂量和致死剂量，其中以LD50为主要定量指标(小动物) 。相相关关名名词词n最大耐受量（M

26、aximal tolerance dose, MTD）：不引起受试对象死亡的最高剂量。n最小致死剂量（Minimal lethal dose, MLD）：引起个别受试动物出现死亡的剂量 。n半数致死量（Median lethal dose, LD50）：在一定试验条件下引起50%动物死亡的剂量。该值是经统计学处理所得的结果。n未见反应剂量（No observed effect level, NOEL）或未见不良反应剂量（No observed adverse effect level, NOAEL） 一、作用意义一、作用意义n1了解新药急性毒性的强度 n2可计算新药相对毒性参数n3为临床毒性不

27、良反应提供参考依据 n4为长期毒性、蓄积性毒性和特殊毒性试验选择剂量提供依据 二、基本内容和方法二、基本内容和方法(药物非临床研究质量管理规药物非临床研究质量管理规范范)n1动物动物 应符合国家有关规定的等级要求，并具有实验动物质量合格证 q种类：啮齿类和/或非啮齿类；q体重：小鼠体重1822g，大鼠体重120150g，同次试验体重相差不超过20；q健康、成年 ；q性别：雌雄各半；q动物数：一般原则是使用尽量少的动物数，获得尽量多信息。n2.受试物受试物q急性毒性研究的受试物应能够代表临床试验受试物和上市药品，与临床试验受试物和上市药品符合同一质量标准。q如果受试物为复方制剂，建议进行各成分单

28、独给药的试验和按复方制剂比例联合给药的试验，以提示有无增毒作用，或是否出现新的毒性。q如果受试物在贮存条件下易发生降解，建议以含降解产物量最高的受试物进行急性毒性试验，并与临床样品的急性毒性试验结果比较。 n3.给药途径给药途径 q至少须两种给药途径至少须两种给药途径，其中一种必须是临床给药途径，和一种能使原型药物较完全进入循环的途径（如静脉注射）。如果临床拟用途径为静脉给药，则仅此一种途径即可。q经口给药时应禁食12-16h，不禁水，给药后继续禁食3-4h。 n4测定步骤测定步骤 n.预实验：预实验：先选用少量小鼠，一般随机分34组，每组35只，各组间剂量（相邻两组）为2:1。如某剂量下3只

29、小鼠全部死亡，则降低一个剂量，至3只小鼠全部不死亡，以摸出受试药物的0%（全活量，a）和100%（全死量，b）死亡的试验剂量。然后按等比数插入几个中间剂量组进行正式试验。 n预实验：预实验：等比数值的确定: 按公式 ，确定等比数值r， n是急性毒性试验设定的组数（通常是5组，即n=5） 按4倍法如1:4:16:64:256:1025mg/kg; 按10倍法如1:10:100:1000mg/kg.给药容积小鼠：ig 0.20.4 ml/10g, ip、sc和iv 0.10.2 ml/10 g大鼠：ig 11.5 ml/100 g, ip、sc和iv 0.5 ml/100 g 静脉注射(iv)腹腔

30、注射(ip)口服(po)皮下注射(sc)灌胃(ig) .正式实验的剂量设计n各剂量组之间的剂距选择主要按预实验的结果来定，即在预实验中100%死亡和0%死亡两种剂量之间选择一种合适的剂距。n剂距一般在0.65-0.8为宜。n剂距和最高剂量的选择合理与否直接关系到实验的成败，必须慎重。n5观察记录观察记录 q给药当天，尤其是给药后4h内应严密观察并记录，然后每天上、下午各观察记录1次，至少连续观察14天。q观察的指标包括一般指标（如动物外观、行为、分泌物、排泄物等）、动物死亡情况（死亡时间、濒死前反应等）、动物体重变化（给药前、试验结束处死动物前各称重一次，观察期间可多次称重）等。q记录所有的死

31、亡情况、出现的症状，以及症状起始的时间、严重程度、持续时间、是否可逆等。 急性毒性急性毒性试验观察的察的动物反物反应指指标中毒部位中毒部位毒性症状表毒性症状表现NS包括行为和反应，如不正常叫声、烦躁、不安、肌肉抽搐、僵硬、强迫运动、共济失调、肌张力增强或减弱等。呼吸系统呼吸急促或过缓、腹式呼吸、窒息、紫钳，死亡动物尸检气管分泌物是否增多。心血管系统触心前区时心率快慢、血管扩张或收缩、心输出改变、心律失常，死亡动物尸检心脏是否瘀血。消化系统呕吐、干呕、腹部胀气、腹部收缩幅度过大、腹泻、便秘，死亡动物尸检胃浆膜或肠浆膜颜色是否正常、有无小颗粒、胃浆膜或肠粘膜有无充血和水肿等。泌尿生殖系统阴唇、阴囊

32、肿大、乳腺肿胀、会阴部肮脏、尿颜色，死亡动物尸检肾、肾上腺、子宫、卵巢、睾丸、附睾、前列腺、膀胱等有无囊肿等。皮肤、毛发皮肤有否充血、发疹，毛色光泽度等。眼睛眼睑下垂、眼球突出、眼震颤、眼分泌物是否增多、瞳孔有无缩小或放大、流泪。其它饮食量、体重变化。n6剖检剖检q对于所有的试验动物均应进行大体解剖，包括实验过程中因濒死而处死的动物、死亡的动物以及试验结束时仍存活而处死的动物。q任何器官出现体积、颜色、纹理改变时，均应记录并进行组织病理学检查。 n7结果处理结果处理 将实验资料列出表格，表格内容至少包括给药计量（mg/kg）、对数剂量（x）、动物数（只）、死亡动物数（只）、死亡率（%）等。用适

33、宜统计方法计算LD50值（现在一般用计算机结合Bliss法计算程序软件）。 若发现毒性反应有明显性别差异，则应分别求它们不同性别的LD50 。n8MTD测定（最大给药量法）测定（最大给药量法）q当有些药物用最大允许浓度和最大允许容积给予动物，仍未测出LD50时，可只求MTD值。即用最大浓度（以药液稠度达到需要稍用力方能吸进注射器的浓度）和最大允许容积一次给药于20只动物后，连续观察714天，未见任何动物死亡，则MTDg/kg。若仅有个别死亡，则宜写成LD50g/kg。第三节第三节长期毒性试验长期毒性试验(long-termtoxicology）一、定义和目的一、定义和目的n1、定义：、定义：

34、指反复多次给药于动物，观察药物对动物的毒性反应。n2、目的：、目的： 通过重复给药的动物试验表征受试物的毒性作用，预测其可能对人体产生的不良反应，降低临床受试者和药品上市后使用人群的用药风险。n3、内容(最终落实目标)： 发现受试物可能引起的临床不良反应，包括不良反应的性质、程度、量效和时效关系、可逆性等； 判断受试物反复给药的毒性靶器官或靶组织； 推测临床试验的起始剂量和重复用药的安全范围； 提示临床试验中需重点监测的安全性指标； 对毒性作用强、毒性症状发生迅速、安全范围小的化合物，长期毒性研究还可以为临床试验中的解毒或解救措施提供参考。二、动物毒性反应对于临床试验的意义二、动物毒性反应对于

35、临床试验的意义 n长期毒性试验是动物非临床安全性评价的核心内容，是能否过渡到临床试用的主要依据，也可为临床安全用药剂量设计提供参考依据，并为临床毒性和不良反应的监护及生理生化指标检测提供依据；n长期毒性研究中动物的毒性反应将会在临床试验长期毒性研究中动物的毒性反应将会在临床试验中再现。中再现。三、基本内容和要求三、基本内容和要求1. 动物动物 理想的动物应具有以下特点： 对受试物的生物转化与人体相近；对受试物敏感；已有大量历史对照数据。 n要求两种动物，啮齿类首选大鼠，非啮齿类用犬或猴。n性别要求雌雄各半。1.动物动物n大鼠：3个月内的实验，宜用68周龄，体重120150 g左右，3 6个月实

36、验宜用5 7周龄，体重100130 g。nBeagle犬: 412月龄，若用杂种狗，其年龄不能超过5年。 n动物数：6个月以内的实验，大鼠选择为每组20只以上（雌雄各半）； Beagle犬为每组4只（雌雄各半）。 6个月以上的实验，大鼠选择为每组40只（雌雄各半）； Beagle犬为每组至少6只（雌雄各半）。 2. 饲养管理饲养管理n饲料应写明供应单位，若自己配的饲料应提供配方及成分含量的检测报告。n各种实验动物均应在符合GLP（药品非临床研究质量管理规范）要求的动物房内饲养。n动物室内温度、湿度、光照和通风条件均应写清楚。n笼养大鼠每笼不宜超过5只，雌雄分开，有条件时单笼饲养，实验前至少适应

37、观察1周。食量每天记录，体重每周称1次。犬宜单笼饲养，定量喂食，Beagle犬实验前至少训养2周，用标准饲料喂养。杂种犬要预先检疫、驱虫，实验前至少驯养1月。猴实验前驯养1月，用标准饲料喂养。 3. 受试药受试药q受试物应能够代表临床试验受试物和上市药品，与临床试验受试物和上市药品符合同一质量标准。4. 给药途径给药途径q一般要求同临床给药途径；q临床静脉注射(大鼠)时可用腹膜内注射代替。 5. 剂量及分组剂量及分组n一般设4个剂量组，剂量以mg/kg或ml/kg为计量单位。n一般以不等浓度等容量不等浓度等容量给药。qa.低剂量组：目的是寻找动物安全剂量范围，为临床剂量设计作参考，一般应高于整

38、体动物有效剂量，此剂量下应不出现毒性反应；qb.中剂量组：应使动物产生轻微的或中度的毒性反应；qc.高剂量组：目的是为寻找毒性靶器官、毒性反应症状及抢救措施提供依据，也为临床毒性和不良反应监测提供参考，应使动物产生明显的或严重的毒性反应，或个别动物死亡；qd.空白对照组：溶媒或其他赋形剂。n若所用溶媒或赋形剂有毒性时则增加正常对照组。5.剂量及分组剂量及分组n参考LD50值：大鼠高、中、低三个剂量分别为LD50值的1/10、1/5、1/100，犬用更小的剂量，一般可相应地用大鼠的一半剂量；n参考最大耐受量（MTD）：大鼠高、中、低三个剂量分别为MTD值的1、1/3、1/10，犬和猴可相应地用大

39、鼠的一半左右剂量；n参考拟用临床剂量：一般大鼠3个月长期毒性试验，低剂量为拟用临床剂量的1020倍（6个月为510倍），中剂量为拟用临床剂量的3050倍（6个月为1525倍），高剂量为拟用临床剂量的50100倍（6个月为3050倍）。犬3个月长期毒性试验，低剂量为拟用临床剂量的25倍（6个月23倍），中剂量为拟用临床剂量的1530倍（6个月1520倍），高剂量为拟用临床剂量的3050倍（6个月1525倍）；n参考药动学实验结果，以最大有效浓度（Cmax）和 t1/2 设计高、中、低剂量组。一般以最大有效浓度的剂量为低剂量组，中、高剂量组分别往上增加若干倍。 6. 给药期限与给药频率给药期限与给

40、药频率1.给药期限：给药期限：q给药期限为2周的长期毒性研究通常可支持临床疗程1-3天的药物进行临床试验和生产；q给药期限为1个月的长期毒性研究通常可支持临床疗程2周的药物；q给药期限为3个月的长期毒性研究通常可支持临床疗程4周的药物；q给药期限为6个月的长期毒性研究通常可支持临床疗程1月以上的药物。2.给药频率：给药频率：q原则上长期毒性研究中动物应每天给药；但给药周期为3个月或3个月以上：可采取一周6天给药。 7. 检测指标检测指标na一般观察：外观体征、行为活动、摄食量、体重、粪便性状、给药局部反应等。nb血液学指标：红细胞或网织红细胞计数、血红蛋白(Hb)、白细胞总数及分类、血小板、凝

41、血时间。 nc血液生化指标：天门冬氨酸氨基转换酶(AST或SGOT)、丙氨酸氨基转换酶(ALT或SGPT) 等。nd病检器官 (1)系统尸解应全面细致，为组织学检查提供依据。(2)脏器系数：心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、甲状腺、胸腺、睾丸、子宫、脑和前列腺。(3)组织学检查 对照组、高剂量组及尸检异常时要详细检查，其他剂量组在高剂量组有异常时才进行检查。一般要求提供重要脏器(心、肝、脾、肺、肾、脑)和靶器官及有病理损伤的照片。ne心电图导联 大动物长期毒性必须做这一项。8. 恢复期观察恢复期观察 (1) 方法：方法： 最后一次给受试物后24 h每组活杀2/31/2动物检测各项指标，留下l/31/

42、2动物继续观察24周，再活杀检查。在此时间，除不给受试物外，其他观察内容与给受试物期间相同。引起不可逆损伤者要慎重考虑临床试验问题。(2) 意义：意义： 了解毒性反应的可逆程度和可能出现的延迟性毒性反应。应根据受试物的代谢动力学特点、靶器官或靶组织的毒性反应和恢复情况确定恢复期的长短。 9. 检测指标的时间检测指标的时间n大鼠3个月以内，一般在最后一次给药后24h和恢复期结束各进行一次。必要时中间可插一次；大鼠3个月以上，可在试验中间活杀少量动物(高剂量组和对照组)检测指标。n犬的长期毒性试验则应有正常值2次，即未给药时，给药后11.5月测一次，停药一次，恢复期结束一次。 10.资料整理资料整理n(1)首页写明试验指导者、课题负责人、各项指标测定及给药观察等负责者的姓名、职称；实验开始及结束日期、实验承担单位、研究室负责人和资料保存单位等。n(2)第2页书写试验摘要。n(3)第3页开始写正文、引言、材料与方法、结果。 n(4)应客观地描述尸检及组织病理学检查结果，对各种异常现象可用半定量的方式表述，以便揭示其与剂量和时间的关系。谢谢 谢！谢！