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1、PCRPCR技术原理及人技术原理及人SRYSRY基因扩增基因扩增 1教育DNA的结构2教育DNA的复制模板：基因组模板：基因组DNADNA原料：游离的核苷酸原料：游离的核苷酸 A A、G G、C C、T T催化剂：催化剂：DNADNA聚合酶聚合酶需要的条件：需要的条件：活细胞内的微观环境活细胞内的微观环境3教育DNA的复制4教育 体内in vivo 体外in vitroDNA的复制5教育PCR技术的发明Kary B. Mullis Californian highway6教育Khorana(1971)Khorana(1971)等提出在体外经等提出在体外经DNADNA变性变性, ,与适当引与适当
2、引物杂交物杂交, ,再用再用DNADNA聚合酶延伸聚合酶延伸, ,克隆克隆DNADNA的设想。的设想。 19831983年年,Mullis,Mullis发明了发明了PCRPCR技术技术, ,使使KhoranaKhorana的设想得的设想得到实现。到实现。 19881988年年SaikiSaiki等将耐热等将耐热DNADNA聚合酶（聚合酶（TaqTaq）引入了）引入了PCRPCR技术。技术。 19891989年美国年美国ScienceScience杂志列杂志列PCR PCR 为十余项重大为十余项重大科学发明之首科学发明之首, ,比喻比喻19891989年为年为PCRPCR爆炸年爆炸年,Mulli
3、s,Mullis荣获荣获19931993年度诺贝尔化学奖。年度诺贝尔化学奖。7教育8教育PCR技术的特点1 1 ）高度的灵敏性）高度的灵敏性2 2 ）特异性）特异性3 3 ）操作简便易行）操作简便易行4 4 ）用途广泛）用途广泛30303030轮循环扩增量达轮循环扩增量达轮循环扩增量达轮循环扩增量达2 2 2 230303030个拷贝（个拷贝（个拷贝（个拷贝（101010109 9 9 9拷贝）拷贝）拷贝）拷贝）9教育生命科学：生命科学：DNADNA重组、转基因生物重组、转基因生物医学工程：基因疫苗、产前诊断医学工程：基因疫苗、产前诊断疾病诊断：艾滋病、禽流感疾病诊断：艾滋病、禽流感法医学：血
4、迹、精斑等痕迹法医学：血迹、精斑等痕迹DNADNA考古学：远古人类、猛犸考古学：远古人类、猛犸DNADNAPCR技术的应用10教育人的性别决定人的性别决定11教育人的性别决定人的性别决定 Father Mother22pairs+XY22pairs+XX22+X22+Y22+Xspermegg22pairs+XX22pairs+XY GirlBoy12教育 19591959年生物学家发现年生物学家发现Y Y染色体决定人（和老鼠）染色体决定人（和老鼠）的男性特征的男性特征; ; 19751975年，年，WachtelWachtel等提出等提出Y Y染色体上有一个组织相染色体上有一个组织相容性抗原
5、的基因容性抗原的基因H-YH-Y和男性决定有关和男性决定有关; ; 19871987年年, David Page, David Page认为认为Y Y染色体上一个特定的染色体上一个特定的基因基因ZFYZFY是决定男性的基因是决定男性的基因; ; 19881988年年, ,澳大利亚的澳大利亚的SinclairSinclair实验室发现袋鼠类实验室发现袋鼠类的的ZFYZFY基因不在基因不在Y Y染色体上，而是在常染色体上染色体上，而是在常染色体上; ; 19901990年，澳大利亚女科学家年，澳大利亚女科学家Marshall Graves Marshall Graves 和和英国的英国的Lovel
6、l-BadgeLovell-Badge两个实验室发现另外一个基因两个实验室发现另外一个基因SRYSRY。13教育人的性别决定人的性别决定YSRY男性男性14教育利用PCR技术检测SRY基因男性，有男性，有SRYSRY阳性结果阳性结果女性，无女性，无SRYSRY阴性结果阴性结果应用：奥运会运动员的性别鉴定应用：奥运会运动员的性别鉴定 犯罪现场血痕、毛发的性别鉴定犯罪现场血痕、毛发的性别鉴定 野生动物的性别鉴定野生动物的性别鉴定 男男 女女15教育 总体积总体积 25 l Buffer 缓冲液缓冲液 dNTP 原料原料 Primer 引物引物 DNA分子分子 模板模板 Taq酶酶 DNA聚合酶聚合
7、酶 反应体系16教育移液器移液器（pipettepipette）枪头枪头（tipstips）反应管反应管（tubetube）17教育95 3min95 3min； 94 30s 94 30s、 52 30s 52 30s、 72 30s 72 30s3030个循环；个循环； 72 72 延伸延伸5min. 5min. 18教育核酸电泳1. 1. 根据欲分离根据欲分离DNADNA片段大小用凝胶缓冲液配制适片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶：准确称量琼脂糖干粉，宜浓度的琼脂糖凝胶：准确称量琼脂糖干粉，加入到配胶用的三角烧瓶内，定量加入电泳缓加入到配胶用的三角烧瓶内，定量加入电泳缓冲液。冲
8、液。 19教育2. 2. 放入到微波炉内加热熔化放入到微波炉内加热熔化 20教育3.3.冷却片刻，加入一滴荧光染料，轻轻旋转冷却片刻，加入一滴荧光染料，轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液，倒入电泳槽中，待其以充分混匀凝胶溶液，倒入电泳槽中，待其凝固。凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将凝凝固。凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽内胶安放在电泳槽内 21教育4.4.向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面胶面1mm1mm为宜，如样品孔内有气泡，应设法为宜，如样品孔内有气泡，应设法除去。除去。 22教育5.5.在在DNADNA样品中加入样品中加入1010体积的载样缓
9、冲液体积的载样缓冲液（loading bufferloading buffer），混匀后，用枪将样品），混匀后，用枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内 。23教育6.6.接通电源，红色为正极，黑色为负极，切接通电源，红色为正极，黑色为负极，切记记DNADNA样品由负极往正极泳动样品由负极往正极泳动 ( (靠近加样孔靠近加样孔的一端为负的一端为负) )；根据指示剂泳动的位置，判；根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳。断是否终止电泳。 24教育7.7.电泳完毕，关上电源，在凝胶成像仪上观电泳完毕，关上电源，在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置。察电泳带及其位置。 25教育
