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1、实验七ELISA法测定乙肝：是指用可微量测定的标记物（放射性核素、荧光素、酶等）对抗原或抗体进行标记，并在标记免疫物质反应结合后，测定结合物中的标记物来反映抗原-抗体反应的检测技术。目前最常用的是酶标记免疫技术、荧光标记免疫技术、放射性核素标记技术。这类免疫标记技术的应用极大程度地提高了抗原-抗体反应的检测敏感性。1;.酶标记免疫技术以酶作为标记物，通过显色反应指示抗原-抗体反应的标记技术称为酶免疫技术。可分为酶免疫组织化学技术和酶免疫测定技术两大类。目前应用最广的为酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA）,是免疫测定技术的代表。2;.酶联免
2、疫吸附试验酶联免疫吸附试验（ELISA）3;. 掌握酶联免疫吸附试验的原理、方法和结果判断及临床应用。 实验目的：实验目的：4;. 将抗原（或抗体）结合于某种固相载体的表面，并保持免疫活性，再以标本中的待检抗体（或抗原）与之结合，然后使酶标抗体与已形成的抗原抗体复合物结合，分别洗去未结合的抗原与抗体，最后加入酶反应的底物，出现呈色反应，该反应中的有色产物含量与待检抗体（抗原）的含量直接相关。 实验原理：实验原理：5;.ELISA测定方法有：间接法：检测抗体最常用的方法；双抗体夹心法：检测抗原最常用的方法；竞争法：既可用于测抗原，又可用于测抗体；6;.（1）间接法测定抗体A.将抗原吸附于固相载体
3、表面(试剂盒生产厂家已经做好）；B.加抗体,形成抗原-抗体复合物;C.加酶标抗体（多为37孵育）；D.洗液洗去多余未结合酶标抗体E.加底物,显色反应，测定底物的降解量和抗体量有关。7;.（2）双抗体夹心法测定抗原A.将抗体吸附于固相表面;B.加抗原，形成抗原-抗体复合物;C.加酶标抗体;D.洗液洗去多余未结合酶标抗体E. 加底物显色。底物的降解量与抗原量有关。8;.（3）竞争法测定抗原A.将抗体吸附在固相载体表面;B.加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体；对照只加入酶标抗原；C.加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差未知抗原量。9;.乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒测定原理：采用单克隆抗-HBs（
4、HBsAb）包被反应板，加入待测标本，同时加入多克隆抗HBs-HRP（辣根过氧化物酶）,当标本中存在HBsAg时，该HBsAg与包被抗-HBs结合并与抗HBs-HRP结合形成抗-HBs-HBsAg-抗HBs-HRP复合物，加入显色TMB（四甲基联苯胺）底物产生显色反应，反之则无显色反应。10;.试剂盒组成：1.包被好的微孔反应板2.酶结合物3.阳性对照4.阴性对照5.洗涤液6.显色剂A、B11;.测定步骤1.每孔加入待测样本50l，设阴性、阳性对照孔，每孔加入阴性对照（或阳性对照）各一滴，并设空白对照1孔。2.每孔加入酶结合物一滴（空白对照孔除外），充分混匀封板，置37孵育30分钟。3.手工洗
5、板：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，静置5秒，甩干，重复5次后拍干。洗板机洗板：选择5次程序洗板后拍干。4.每孔加入显色剂A、B液各一滴，充分混匀，封板，置37孵育15分钟。5.用酶标仪读数，取波长450nm,先用空白孔较零，然后读取各孔OD值。12;.结果判断：判断为阳性，否则为阴性。阴性对照OD值低于0.05时作0.05计算，高于0.05按实际OD值计算。样品OD值阴性对照平均OD值2.113;.HBV抗原抗体检测结果的临床分析HBsAgHBeAg抗-HBs抗-HBe抗-HBc结果分析 HBV感染或无症状携带感染或无症状携带 急慢性乙肝或无症状携带急慢性乙肝或无症状携带 急慢性乙肝（大三阳）
6、急慢性乙肝（大三阳） 趋于恢复（小三阳）趋于恢复（小三阳） 既往感染恢复期既往感染恢复期 感染过感染过HBV 既往感染或接种过疫苗既往感染或接种过疫苗14;.酶标板15;.酶标仪16;. ELISA法有哪几种类型？其原理是什么？ ELISA操作过程中应注意哪些事项？ ELISA的结果判断及临床应用？思考题17;.胶体金技术（金标法）氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金颗粒由一个基础金核（原子金Au）及包围在外的双离子层构成，紧连在金核表面的是内层负离子（AuC12），外层离子层H则分散在胶体
7、间溶液中，以维持胶体金游离于溶胶间的悬液状态。胶体金颗粒的基础金核并非是理想的圆球核，较小的胶体金颗粒基本是圆球形的，较大的胶体金颗粒（一般指大于30nm以上的）多呈椭圆形。在电子显微镜下可观察胶体金的颗粒形态。胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽缀合物等非共价结合，因而在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。免疫金标记技术(Immunogoldlabellingtechique)主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中，这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色。18;.
