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1、实验七ELISA法测定乙肝:是指用可微量测定的标记物(放射性核素、荧光素、酶等)对抗原或抗体进行标记,并在标记免疫物质反应结合后,测定结合物中的标记物来反映抗原-抗体反应的检测技术。目前最常用的是酶标记免疫技术、荧光标记免疫技术、放射性核素标记技术。这类免疫标记技术的应用极大程度地提高了抗原-抗体反应的检测敏感性。1;.酶标记免疫技术以酶作为标记物,通过显色反应指示抗原-抗体反应的标记技术称为酶免疫技术。可分为酶免疫组织化学技术和酶免疫测定技术两大类。目前应用最广的为酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA),是免疫测定技术的代表。2;.酶联免
2、疫吸附试验酶联免疫吸附试验(ELISA)3;. 掌握酶联免疫吸附试验的原理、方法和结果判断及临床应用。 实验目的:实验目的:4;. 将抗原(或抗体)结合于某种固相载体的表面,并保持免疫活性,再以标本中的待检抗体(或抗原)与之结合,然后使酶标抗体与已形成的抗原抗体复合物结合,分别洗去未结合的抗原与抗体,最后加入酶反应的底物,出现呈色反应,该反应中的有色产物含量与待检抗体(抗原)的含量直接相关。 实验原理:实验原理:5;.ELISA测定方法有:间接法:检测抗体最常用的方法;双抗体夹心法:检测抗原最常用的方法;竞争法:既可用于测抗原,又可用于测抗体;6;.(1)间接法测定抗体A.将抗原吸附于固相载体
3、表面(试剂盒生产厂家已经做好);B.加抗体,形成抗原-抗体复合物;C.加酶标抗体(多为37孵育);D.洗液洗去多余未结合酶标抗体E.加底物,显色反应,测定底物的降解量和抗体量有关。7;.(2)双抗体夹心法测定抗原A.将抗体吸附于固相表面;B.加抗原,形成抗原-抗体复合物;C.加酶标抗体;D.洗液洗去多余未结合酶标抗体E. 加底物显色。底物的降解量与抗原量有关。8;.(3)竞争法测定抗原A.将抗体吸附在固相载体表面;B.加入酶标抗原和待测抗原,竞争结合抗体;对照只加入酶标抗原;C.加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差未知抗原量。9;.乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒测定原理:采用单克隆抗-HBs(
4、HBsAb)包被反应板,加入待测标本,同时加入多克隆抗HBs-HRP(辣根过氧化物酶),当标本中存在HBsAg时,该HBsAg与包被抗-HBs结合并与抗HBs-HRP结合形成抗-HBs-HBsAg-抗HBs-HRP复合物,加入显色TMB(四甲基联苯胺)底物产生显色反应,反之则无显色反应。10;.试剂盒组成:1.包被好的微孔反应板2.酶结合物3.阳性对照4.阴性对照5.洗涤液6.显色剂A、B11;.测定步骤1.每孔加入待测样本50l,设阴性、阳性对照孔,每孔加入阴性对照(或阳性对照)各一滴,并设空白对照1孔。2.每孔加入酶结合物一滴(空白对照孔除外),充分混匀封板,置37孵育30分钟。3.手工洗
5、板:弃去孔内液体,洗涤液注满各孔,静置5秒,甩干,重复5次后拍干。洗板机洗板:选择5次程序洗板后拍干。4.每孔加入显色剂A、B液各一滴,充分混匀,封板,置37孵育15分钟。5.用酶标仪读数,取波长450nm,先用空白孔较零,然后读取各孔OD值。12;.结果判断:判断为阳性,否则为阴性。阴性对照OD值低于0.05时作0.05计算,高于0.05按实际OD值计算。样品OD值阴性对照平均OD值2.113;.HBV抗原抗体检测结果的临床分析HBsAgHBeAg抗-HBs抗-HBe抗-HBc结果分析 HBV感染或无症状携带感染或无症状携带 急慢性乙肝或无症状携带急慢性乙肝或无症状携带 急慢性乙肝(大三阳)
6、急慢性乙肝(大三阳) 趋于恢复(小三阳)趋于恢复(小三阳) 既往感染恢复期既往感染恢复期 感染过感染过HBV 既往感染或接种过疫苗既往感染或接种过疫苗14;.酶标板15;.酶标仪16;. ELISA法有哪几种类型?其原理是什么? ELISA操作过程中应注意哪些事项? ELISA的结果判断及临床应用?思考题17;.胶体金技术(金标法)氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下,可聚合成一定大小的金颗粒,形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态,故称胶体金。胶体金颗粒由一个基础金核(原子金Au)及包围在外的双离子层构成,紧连在金核表面的是内层负离子(AuC12),外层离子层H则分散在胶体
7、间溶液中,以维持胶体金游离于溶胶间的悬液状态。胶体金颗粒的基础金核并非是理想的圆球核,较小的胶体金颗粒基本是圆球形的,较大的胶体金颗粒(一般指大于30nm以上的)多呈椭圆形。在电子显微镜下可观察胶体金的颗粒形态。胶体金标记,实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷,与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能,可以与葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽缀合物等非共价结合,因而在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。免疫金标记技术(Immunogoldlabellingtechique)主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性,在金标蛋白结合处,在显微镜下可见黑褐色颗粒,当这些标记物在相应的配体处大量聚集时,肉眼可见红色或粉红色斑点,因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中,这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大,称之为免疫金银染色。18;.