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1、大黄鱼大黄鱼RacRac基因基因cDNAcDNA全长克隆全长克隆及分析及分析PPTPPT课件课件主要内容主要内容v研究背景与意义研究背景与意义v技术路线技术路线v结果与分析结果与分析v结论结论v致谢语致谢语产物回收产物回收 产物与载产物与载体的连接体的连接 转化转化 初筛重组初筛重组子子 图图4 4 凝胶电泳检测菌落凝胶电泳检测菌落PCRPCR产物产物 M M：DNA MarkerDNA Marker； 1 1：以水作为模板的：以水作为模板的阴性阴性对照；对照； 2: 2:以以PCRPCR产物为模板的产物为模板的阳性阳性对照；对照； 3-6 3-6：菌落：菌落PCRPCR4 4、PCRPCR筛
2、选克隆子结果筛选克隆子结果M 1 2 3 4 5 6 随机挑随机挑4 4个克隆个克隆子均含有约子均含有约530bp530bp的目的条的目的条带，都为阳性带，都为阳性克隆克隆 5、 3RACE第一轮第一轮PCR结果结果 图图6 6 凝胶电泳检测凝胶电泳检测3RACE3RACE第一轮反应产物第一轮反应产物 M M：DNA MarkerDNA Marker； 1 1：第一轮反应产物；：第一轮反应产物； 第一轮扩增得到一条第一轮扩增得到一条较亮的较亮的1100bp1100bp左右的左右的条带，阴性对照无条条带，阴性对照无条带带. .6、3RACE第二轮第二轮PCR 图图7 7 凝胶电泳检测凝胶电泳检测
3、3RACE3RACE第二轮反应产物第二轮反应产物 M M：DNA MarkerDNA Marker； 1 1：第二轮产物：第二轮产物第二轮扩增得到一条大小第二轮扩增得到一条大小介于介于250-500bp250-500bp之间的条带，之间的条带，与目的条带预期大小基本与目的条带预期大小基本相符，阴性对照无条带，相符，阴性对照无条带，表明该片段可能就是所需表明该片段可能就是所需片段，将琼脂糖块回收做片段，将琼脂糖块回收做后续实验后续实验。 7、3RACE克隆产物的鉴定结果克隆产物的鉴定结果图图8 8 凝胶电泳检测菌落凝胶电泳检测菌落PCRPCR产物产物 M M：DNA MarkerDNA Mark
4、er； 1 1：以水作为模板的：以水作为模板的阴性阴性对照；对照； 2 2：第二轮：第二轮PCRPCR产物为产物为阳性阳性对照；对照； 3-4 3-4：菌落：菌落PCRPCR扩增产物扩增产物两个菌落均含两个菌落均含有目的条带有目的条带 8、 5RACE第一轮第一轮PCR结果结果图图10 10 凝胶电泳检测凝胶电泳检测5RACE5RACE第一轮反应产物第一轮反应产物 M M：DNA MarkerDNA Marker； 1 1：第一轮反应产物；：第一轮反应产物； 2 2：阴性阴性对照对照 第一轮扩增产生第一轮扩增产生100-100-400bp400bp的拖带，但还没有的拖带，但还没有明显条带明显条
5、带 9、5RACE第二轮第二轮PCR 结果结果图图11 11 凝胶电泳检测凝胶电泳检测5RACE5RACE第二轮反应产物第二轮反应产物 M M：DNA MarkerDNA Marker； 1 1：以水作为模板的：以水作为模板的阴性阴性对照；对照； 2 2：第二轮：第二轮PCRPCR产物产物 经第二轮扩增经第二轮扩增, ,在在300bp300bp左右处有特异左右处有特异性条带出现并且阴性条带出现并且阴性对照无条带性对照无条带 产物回收产物回收 产物与载产物与载体的连接体的连接 转化转化 初筛重组初筛重组子子 10、 5RACE克隆产物的鉴定克隆产物的鉴定 图图12 12 凝胶电泳检测菌落凝胶电泳
6、检测菌落PCRPCR产物产物 M M：DNA ladderDNA ladder； 1 1：以水作为模板的：以水作为模板的阴性阴性对照；对照； 2 2：以第二轮：以第二轮PCRPCR产物为产物为阳性阳性对照；对照； 3-5 3-5：菌落：菌落PCRPCR扩增产物扩增产物3 3个菌落均含个菌落均含有目的条带有目的条带 图图14 Rac基因部分序列及由此推测的氨基酸序列基因部分序列及由此推测的氨基酸序列 图中阴影部分是编码区；图中阴影部分是编码区； 下划线标注为终止密码下划线标注为终止密码TAA； 方框中是加尾信号方框中是加尾信号AATAAA获得的片段大小为获得的片段大小为1272bp，其中包含的编
7、，其中包含的编码区码区579bp，编码，编码193个个氨基酸。氨基酸。5端非编码区长端非编码区长80bp3端非编码区长端非编码区长613bp，具有脊椎动物典型的加尾具有脊椎动物典型的加尾信号信号AATAA和和poly A尾尾巴巴 结论结论本实验根据其它动物本实验根据其它动物Rac基因序列设计简并引物，通过基因序列设计简并引物，通过RTPCR和和RACE方法扩增出大黄鱼方法扩增出大黄鱼Rac基因基因cDNA全长全长1272bp,其中编码区（其中编码区（ORF）为）为579bp,编码编码193个氨基酸。个氨基酸。致谢语致谢语感谢韩芳老师在整个毕业论文设计过程中给予的悉心指导，感谢她对我孜孜不倦的教诲！同时感谢课题组的全体老师和同学给予的鼓励和无私的帮助！
