酶的生产与分离纯化课件

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1、第第2章章酶的生产与分离纯化酶的生产与分离纯化主要内容：主要内容：2.1酶的发酵生产酶的发酵生产*2.2提高酶发酵产量的方法提高酶发酵产量的方法2.3食品用酶发酵生产举例食品用酶发酵生产举例2.4酶分离纯化工作的基本原则酶分离纯化工作的基本原则2.5酶的纯化酶的纯化*2.6酶纯度的评价酶纯度的评价2.7酶的剂型与保存酶的剂型与保存12.1酶的发酵生产酶的发酵生产目前，酶的生产主要通过三种方法：目前，酶的生产主要通过三种方法：组织提取组织提取：木瓜蛋白酶、凝乳蛋白酶：木瓜蛋白酶、凝乳蛋白酶发酵生产发酵生产：最大量的来源：最大量的来源化学及生物合成化学及生物合成：生物重组：生物重组其中，酶的发酵生

2、产生目前生产酶的主要方法。其中，酶的发酵生产生目前生产酶的主要方法。2酶的发酵生产：经过预先设计，通过人工酶的发酵生产：经过预先设计，通过人工操作控制，利用细胞（包括操作控制，利用细胞（包括微生物细胞微生物细胞、植物细胞和动物细胞）的生命活动，产生植物细胞和动物细胞）的生命活动，产生人们所需要酶的过程，称为酶的发酵生产。人们所需要酶的过程，称为酶的发酵生产。3能用于酶发酵生产的细胞需能用于酶发酵生产的细胞需具备如下几个具备如下几个条件条件：（1）产酶量高）产酶量高（2）容易培养和管理）容易培养和管理（3）产酶稳定性好）产酶稳定性好（4）利于酶的分离纯化）利于酶的分离纯化（5）安全可靠）安全可靠

3、42.1酶的发酵技术酶的发酵技术利用微生物产酶的优点是：利用微生物产酶的优点是：(1)微生物种类多、酶种丰富，且菌株易诱变，菌种多样。微生物种类多、酶种丰富，且菌株易诱变，菌种多样。(2)微生物生长繁殖快，易提取酶，特别是胞外酶。微生物生长繁殖快，易提取酶，特别是胞外酶。(3)微生物培养基来源广泛、价格便宜。微生物培养基来源广泛、价格便宜。(4)可以采用微电脑等新技术，控制酶发酵生产过程，生产可以采用微电脑等新技术，控制酶发酵生产过程，生产可连续化、自动化，经济效益高。可连续化、自动化，经济效益高。(5)可以利用以基因工程为主的现代分子生物学技术，选育可以利用以基因工程为主的现代分子生物学技术

4、，选育菌种、增加酶产率和开发新酶种。因此，下面将主要介绍菌种、增加酶产率和开发新酶种。因此，下面将主要介绍微生物发酵法产酶的一般原理和工艺。微生物发酵法产酶的一般原理和工艺。52.1.1产酶微生物产酶微生物菌种菌种是发酵生产酶的重要条件。菌种不仅与产酶种类、产是发酵生产酶的重要条件。菌种不仅与产酶种类、产量密切相关，而且与发酵条件、工艺等关系密切。已经在量密切相关，而且与发酵条件、工艺等关系密切。已经在自然界中发现的酶有数千种，目前投入工业发酵生产的酶自然界中发现的酶有数千种，目前投入工业发酵生产的酶约有约有5060种。它们的生产菌种十分广泛，包括细菌、种。它们的生产菌种十分广泛，包括细菌、放

5、线菌、酵母菌、霉菌。放线菌、酵母菌、霉菌。6（1）枯草芽孢杆菌）枯草芽孢杆菌细菌属细菌属革兰氏阳性革兰氏阳性菌落粗糙，不透明菌落粗糙，不透明此菌用途广，可用于生产此菌用途广，可用于生产-淀粉酶、蛋白酶、淀粉酶、蛋白酶、-葡聚糖酶，碱性磷酸酶等。葡聚糖酶，碱性磷酸酶等。7革兰氏染色是微生物中重要的染色方法革兰氏染色是微生物中重要的染色方法1、初染：结晶紫染色、初染：结晶紫染色2、媒染：碘液媒染、媒染：碘液媒染3、脱色：乙醇脱色、脱色：乙醇脱色4、复染：番红复染、复染：番红复染8细菌对革兰氏染色的不同反应是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。初细菌对革兰氏染色的不同反应是由于它们细胞壁的成分和

6、结构不同而造成的。初染后，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶染后，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫紫碘的复合物，增强染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，碘的复合物，增强染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌的细的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇脱色时细胞壁胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇脱色时细胞壁脱水，使肽聚糖层的网状结构孔经缩小，透性降低，从而使结晶紫脱水，使肽聚糖层的网状结构孔经缩小，透性降低，从而使结晶紫碘的复合物不易碘的复合物

7、不易被洗脱而保留在细胞内，被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌则不则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂质含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂质含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫碘的复合物比较容易被洗脱出来，碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色后，细胞被染上复染剂的红色。9（2）大肠杆菌大肠杆菌革兰氏阴性，无芽孢革兰氏阴性，无芽孢菌落光滑菌落光滑用于谷氨酸脱羧酶，天用于谷氨

8、酸脱羧酶，天门冬氨酸酶等门冬氨酸酶等胞内酶胞内酶10（3）黑曲霉）黑曲霉属于真菌属，菌丝体属于真菌属，菌丝体由横隔的分枝菌丝构由横隔的分枝菌丝构成，菌丛呈黑褐色成，菌丛呈黑褐色糖化酶、淀粉酶、酸糖化酶、淀粉酶、酸性蛋白酶、果胶酶等。性蛋白酶、果胶酶等。11（4）米曲霉米曲霉真菌属，菌丛一般由真菌属，菌丛一般由黄绿色变为黄褐色。黄绿色变为黄褐色。产分生孢子产分生孢子主要用于糖化酶和蛋主要用于糖化酶和蛋白酶的生产白酶的生产12（5）根霉）根霉由营养菌丝产生匍匐由营养菌丝产生匍匐枝，匍匐枝的末端产枝，匍匐枝的末端产生假根，并生长出成生假根，并生长出成群孢子囊梗。群孢子囊梗。主要用于糖化酶、淀主要用于

9、糖化酶、淀粉酶、转化酶等生产粉酶、转化酶等生产13（6）毛霉）毛霉菌丝体上生出孢子囊菌丝体上生出孢子囊梗，孢子囊梗顶端有梗，孢子囊梗顶端有膨大成球形的孢子囊。膨大成球形的孢子囊。主要用于生产蛋白酶、主要用于生产蛋白酶、糖化酶、淀粉酶、脂糖化酶、淀粉酶、脂肪酶等。肪酶等。14（7）链霉菌）链霉菌放线菌放线菌气生菌丝和基内菌气生菌丝和基内菌丝丝葡萄糖异构酶。青葡萄糖异构酶。青霉素酰化酶、纤维霉素酰化酶、纤维素酶、几丁质酶等素酶、几丁质酶等15（8）啤酒酵母）啤酒酵母细胞呈圆形，卵形、细胞呈圆形，卵形、椭圆形到腊肠形。菌椭圆形到腊肠形。菌落呈白色，有光泽、落呈白色，有光泽、平滑。平滑。用于生产转化酶

10、、丙用于生产转化酶、丙酮酸脱羧酶等。酮酸脱羧酶等。162.1.1.2产酶菌株的选育产酶菌株的选育特定酶产生菌的筛选方法主要依据特定酶产生菌的筛选方法主要依据酶催化的反应性质酶催化的反应性质、作作用底物的特异性用底物的特异性、底物和产物的特性底物和产物的特性以及以及酶在细胞中所处酶在细胞中所处的位置的位置来进行选育。来进行选育。对于对于胞外酶胞外酶，可在培养基中加入酶作用的不溶性底物或酶，可在培养基中加入酶作用的不溶性底物或酶催化反应的产物，根据菌落周围的催化反应的产物，根据菌落周围的透明圈、颜色变化来筛透明圈、颜色变化来筛选选。对于对于胞内酶胞内酶，若酶作用底物分子量小可透过细胞膜，将酶，若酶

11、作用底物分子量小可透过细胞膜，将酶催化反应的产物作为底物，加在培养基中，根据催化反应的产物作为底物，加在培养基中，根据菌落颜色菌落颜色变化来筛选变化来筛选。而多数胞内酶产生菌的筛选则通过细胞破碎。而多数胞内酶产生菌的筛选则通过细胞破碎物做酶源，经酶反应后，根据物做酶源，经酶反应后，根据酶反应产物的特点来筛选酶反应产物的特点来筛选（辅酶（辅酶NAD）。17酶的发酵生产是以获得大量所需的酶为目的。因酶的发酵生产是以获得大量所需的酶为目的。因此，除了此，除了选择性能优良的产酶微生物选择性能优良的产酶微生物，还应对酶，还应对酶的发酵加以控制。酶的发酵技术内容包括的发酵加以控制。酶的发酵技术内容包括培养

12、基培养基设计设计、选择合适的发酵方式选择合适的发酵方式及及发酵过程的各种参发酵过程的各种参数控制数控制等。酶的发酵的生产一般工艺如图所示：等。酶的发酵的生产一般工艺如图所示：2.1.2酶的发酵技术酶的发酵技术重要18保藏细胞保藏细胞细胞活化细胞活化细胞扩大培养细胞扩大培养原生质体原生质体固定化细胞固定化细胞固定化原生质体固定化原生质体预培养预培养发酵发酵发酵发酵分离纯化分离纯化酶酶重要192.1.2.1培养基培养基培养基的营养成分是微生物发酵产酶的原料，培养基的营养成分是微生物发酵产酶的原料，主要是碳源、氮源，其次是无机盐、生长因子主要是碳源、氮源，其次是无机盐、生长因子和产酶促进剂等。和产酶

13、促进剂等。重要20氨基酸结构通式氨基酸结构通式CCOOHHRNH221（1）碳源）碳源碳素是构成菌体成分的主要元素，也是细胞贮藏碳素是构成菌体成分的主要元素，也是细胞贮藏物质和生产各种代谢产物的骨架，还是菌体生命物质和生产各种代谢产物的骨架，还是菌体生命活动的能量的主要来源。活动的能量的主要来源。当前酶制剂生产上使用当前酶制剂生产上使用的菌种大都是只能利用的菌种大都是只能利用有机碳有机碳的异养型微生物。的异养型微生物。重要吃点啥吃点啥？22重要有机碳的主要来源有：一是农副产品中如甘薯、麸皮、有机碳的主要来源有：一是农副产品中如甘薯、麸皮、玉米、米糠等淀粉质原料；二是野生的如土茯苓、橡玉米、米糠

14、等淀粉质原料；二是野生的如土茯苓、橡子、石蒜等淀粉质原料。此外，以石油产品中子、石蒜等淀粉质原料。此外，以石油产品中1216碳的成分来作碳源，如以某些嗜石油微生物生产碳的成分来作碳源，如以某些嗜石油微生物生产蛋白酶、脂酶，均已获得成功。蛋白酶、脂酶，均已获得成功。23不同的细胞对各种碳源的利用差异很大，所不同的细胞对各种碳源的利用差异很大，所以在配制培养基时应根据不同细胞的不同要以在配制培养基时应根据不同细胞的不同要求而选择合适的碳源。另外，选择碳源除考求而选择合适的碳源。另外，选择碳源除考虑虑营养要求营养要求外，还要考虑酶生物合成的外，还要考虑酶生物合成的诱导诱导作用作用和是否存在和是否存在

15、分解代谢物阻遏作用分解代谢物阻遏作用。尽量。尽量选用具有诱导作用的碳源，尽量不用或少用选用具有诱导作用的碳源，尽量不用或少用有分解代谢物阻遏作用的碳源。有分解代谢物阻遏作用的碳源。例如，例如，淀粉酶的发酵生产中，应该选用有诱导作淀粉酶的发酵生产中，应该选用有诱导作用的淀粉作为碳源，而不用对该酶有分解代谢物阻用的淀粉作为碳源，而不用对该酶有分解代谢物阻遏作用的果糖作为碳源。遏作用的果糖作为碳源。重要24（2）氮源）氮源氮是生物体内各种含氮物质，如氨基酸、蛋白质、氮是生物体内各种含氮物质，如氨基酸、蛋白质、核苷酸、核酸等的组成成分。酶制剂生产中的氮核苷酸、核酸等的组成成分。酶制剂生产中的氮源主要有

16、源主要有有机氮源和无机氮有机氮源和无机氮源源两种，常用的有机两种，常用的有机氮源有：豆饼、花生饼、菜籽饼、鱼粉、蛋白胨、氮源有：豆饼、花生饼、菜籽饼、鱼粉、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、多肽、氨基酸等；无机氮源有：牛肉膏、酵母膏、多肽、氨基酸等；无机氮源有：(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3、(NH4)3P04、尿、尿素等。素等。重要25不同的细胞对各种氮源的要求各不相同，应根据要求进行不同的细胞对各种氮源的要求各不相同，应根据要求进行选择和配制。一般来说，动物细胞要求有机氮；植物细胞选择和配制。一般来说，动物细胞要求有机氮；植物细胞主要要求无机氮；主要要求无机氮；微生物细胞中，异养型微生

17、物用有机氮，微生物细胞中，异养型微生物用有机氮，自养型用无机氮。自养型用无机氮。多数情况下将有机氮源和无机氮源配合多数情况下将有机氮源和无机氮源配合使用才能取得较好的效果。使用才能取得较好的效果。重要我有我要求我有我要求26例如黑曲霉酸性蛋白酶生产，只用铵盐或硝酸盐例如黑曲霉酸性蛋白酶生产，只用铵盐或硝酸盐为氮源时，酶产量仅为有胨时的为氮源时，酶产量仅为有胨时的30%。只用有机。只用有机氮源而不用无机氮源时产量也低，故一般除使用氮源而不用无机氮源时产量也低，故一般除使用高浓度有机氮源外尚需添加高浓度有机氮源外尚需添加1%3%的无机氮源。的无机氮源。重要27（3）无机盐无机盐微生物酶生产和其他微

18、生物产品生产一样，培养基中微生物酶生产和其他微生物产品生产一样，培养基中需要有磷酸盐及硫、钾、钠、钙、镁等元素存在。需要有磷酸盐及硫、钾、钠、钙、镁等元素存在。提提供细胞生命活动，调节培养基的供细胞生命活动，调节培养基的pH、氧化还原电位和、氧化还原电位和渗透压。渗透压。在酶生产中常以磷酸二氢钾、磷酸氢二钾等磷酸盐作在酶生产中常以磷酸二氢钾、磷酸氢二钾等磷酸盐作为为磷源磷源，以硫酸镁为硫源和，以硫酸镁为硫源和镁源镁源。钙离子钙离子对淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等多种酶的活性有对淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等多种酶的活性有十分重要的稳定作用，例如在无十分重要的稳定作用，例如在无Ca2+存在时灰色链霉存在时灰

19、色链霉菌中性蛋白酶只在菌中性蛋白酶只在pH77.5很小范围内稳定，当有很小范围内稳定，当有Ca2+存在时稳定存在时稳定pH范围可以扩大到范围可以扩大到57。重要28钠离子钠离子有控制细胞渗透压使酶产量增加的作用，酶生有控制细胞渗透压使酶产量增加的作用，酶生产的培养基中有时以磷酸氢二钠及硝酸钠等形式加入，产的培养基中有时以磷酸氢二钠及硝酸钠等形式加入，例如米曲霉例如米曲霉淀粉酶生产，添加适量的硝酸钠以促进淀粉酶生产，添加适量的硝酸钠以促进酶生产。酶生产。在天然培养基中，一般微量元素不必另外加入，但也在天然培养基中，一般微量元素不必另外加入，但也有一些例外。如玉米粉、豆粉为碳源时，添加有一些例外。

20、如玉米粉、豆粉为碳源时，添加100ppmCo2+和和Zn2+，放线菌，放线菌166蛋白酶活力可增加蛋白酶活力可增加70%80%。微量元素如过量会引起不良效果。微量元素如过量会引起不良效果。重要29（4）生长因子）生长因子微生物还需一些微量的像维生素一类的物质，才能正微生物还需一些微量的像维生素一类的物质，才能正常生长发育，这类物质统称生长因子常生长发育，这类物质统称生长因子(或生长素或生长素)。其中包括某些氨基酸、维生素、嘌呤或嘧啶等。酶制其中包括某些氨基酸、维生素、嘌呤或嘧啶等。酶制剂生产中所需的生长因子，大多是由天然原料提供，剂生产中所需的生长因子，大多是由天然原料提供，如玉米浆、麦芽汁、

21、豆芽汁、酵母膏、麸皮、米糠等。如玉米浆、麦芽汁、豆芽汁、酵母膏、麸皮、米糠等。玉米浆中一般含有生长素玉米浆中一般含有生长素32128mg/mL。重要有你才有你才健康！健康！30（5）产酶促进剂产酶促进剂产酶促进剂产酶促进剂是指在培养基中添加某种少量物质，能显是指在培养基中添加某种少量物质，能显著提高酶的产率，这类物质称为产酶促进剂。著提高酶的产率，这类物质称为产酶促进剂。产酶促进剂大体上分为两种：产酶促进剂大体上分为两种：一是诱导物，二是表面一是诱导物，二是表面活性剂。活性剂。表面活性剂，如吐温表面活性剂，如吐温80的浓度为的浓度为0.1%时能时能增加许多酶的产量。表面活性剂能增加细胞的通透性

22、，增加许多酶的产量。表面活性剂能增加细胞的通透性，处在气液界面改善了氧的传递速度，还可以保护酶处在气液界面改善了氧的传递速度，还可以保护酶的活性。的活性。重要312.1.2.2细胞活化与扩大培养细胞活化与扩大培养细胞活化细胞活化是指保藏细胞在使用之前必须接种于新是指保藏细胞在使用之前必须接种于新鲜的斜面培养基上，在一定的条件下进行培养，鲜的斜面培养基上，在一定的条件下进行培养，以恢复细胞的生命活动能力。以恢复细胞的生命活动能力。为了保证发酵时有足够数量的优质细胞，活化了为了保证发酵时有足够数量的优质细胞，活化了的细胞一般要经过一级至数级的扩大培养。的细胞一般要经过一级至数级的扩大培养。322.

23、1.2.3发酵方式的选择发酵方式的选择酶的种类繁多，产酶菌种各异，但其发酵酶的种类繁多，产酶菌种各异，但其发酵生产的工艺流程是相似的，一般有生产的工艺流程是相似的，一般有固态发固态发酵法酵法和和液体深层发酵法液体深层发酵法之分，具体采用何之分，具体采用何种方法由微生物和酶的种类来决定。种方法由微生物和酶的种类来决定。332.1.2.4发酵条件的控制发酵条件的控制酶的发酵生产中发酵效果除了受到菌种产酶的发酵生产中发酵效果除了受到菌种产酶性能的影响外，还受到发酵温度、酶性能的影响外，还受到发酵温度、pH、溶氧量等条件的影响。溶氧量等条件的影响。34(1)pH对产酶的影响对产酶的影响种子培养基和发酵

24、培养基的种子培养基和发酵培养基的pH直接影响酶的产量和质直接影响酶的产量和质量。在发酵过程中，微生物不断分解和同化营养物质，量。在发酵过程中，微生物不断分解和同化营养物质，同时排出代谢产物。由于这些产物都与同时排出代谢产物。由于这些产物都与pH有直接关系，有直接关系，因此发酵液因此发酵液pH在不断发生变化。生产上根据在不断发生变化。生产上根据pH的变化的变化情况常作为生产控制的根据。情况常作为生产控制的根据。35一般来说，培养基成分中碳一般来说，培养基成分中碳/氮氮(C/N)比高，发酵液倾向比高，发酵液倾向于酸性，于酸性，pH低；低；C/N低，发酵液倾向于碱性，低，发酵液倾向于碱性，pH高。高

25、。pH的这些变化情况，常常引起细胞生长和产酶环境的的这些变化情况，常常引起细胞生长和产酶环境的变化，对产酶带来不利的影响。因此生产中常采用一变化，对产酶带来不利的影响。因此生产中常采用一些控制些控制pH的方法，通常有：添加缓冲液维持一定的的方法，通常有：添加缓冲液维持一定的pH；调节通风量维持发酵液的氧化还原电位于一定范围；调节通风量维持发酵液的氧化还原电位于一定范围；调节培养基的初始调节培养基的初始pH，保持一定的，保持一定的C/N比；当发酵液比；当发酵液pH过高时用糖或淀粉来调节，过高时用糖或淀粉来调节，pH过低时，通过氮调节。过低时，通过氮调节。36(2)温度对产酶的影响温度对产酶的影响

26、发酵温度的变化主要随着微生物代谢反应、发酵中通风、搅发酵温度的变化主要随着微生物代谢反应、发酵中通风、搅拌速度的变化而变化的。微生物在生长发育中，不断地吸收拌速度的变化而变化的。微生物在生长发育中，不断地吸收培养基营养成分来合成菌体的细胞物质和酶时的生化反应都培养基营养成分来合成菌体的细胞物质和酶时的生化反应都是吸热反应；培养基中的营养物质被大量分解时的生化反应是吸热反应；培养基中的营养物质被大量分解时的生化反应都是放热反应。都是放热反应。发酵初期发酵初期合成反应吸收的热量大于分解反应合成反应吸收的热量大于分解反应放出的热量，放出的热量，发酵液需要升温发酵液需要升温。当。当菌体繁殖旺盛菌体繁殖

27、旺盛时，情况则时，情况则相反，发酵液温度就自行上升，加上通风搅拌所带来的热量，相反，发酵液温度就自行上升，加上通风搅拌所带来的热量，这时，这时，发酵液必须降温发酵液必须降温，以保持微生物生长繁殖和产酶所需，以保持微生物生长繁殖和产酶所需的适宜温度。的适宜温度。37微生物生长繁殖和产酶的最适温度随着菌种和酶的性微生物生长繁殖和产酶的最适温度随着菌种和酶的性质不同而异，生长繁殖和产酶的最适温度往往不一致。质不同而异，生长繁殖和产酶的最适温度往往不一致。一般细菌为一般细菌为37，霉菌和放线菌为，霉菌和放线菌为2830，一些嗜，一些嗜热微生物需在热微生物需在4050下生长繁殖，如红曲霉生长温下生长繁殖

28、，如红曲霉生长温度度3537，而生产糖化酶的最适温度为，而生产糖化酶的最适温度为3740。38在酶生产中，为了有利于菌体生长和酶的合成，也有在酶生产中，为了有利于菌体生长和酶的合成，也有进行变温生产的。例如以枯草杆菌进行变温生产的。例如以枯草杆菌ASl.398进行中性蛋进行中性蛋白酶生产时，培养温度必须从白酶生产时，培养温度必须从31逐渐升温至逐渐升温至40，然后再降温到然后再降温到31进行培养，蛋白酶产量比不升温者进行培养，蛋白酶产量比不升温者高高66%。据报道，酶生产的温度对酶活力的稳定性有。据报道，酶生产的温度对酶活力的稳定性有影响，例如用嗜热芽孢杆菌进行影响，例如用嗜热芽孢杆菌进行淀粉

29、酶生产时，在淀粉酶生产时，在55培养所产生的酶的稳定性比培养所产生的酶的稳定性比35好。好。39(3)耗氧量和通风量对产酶的影响耗氧量和通风量对产酶的影响其实通风量的多少应根据培养基中的溶解氧而定。一其实通风量的多少应根据培养基中的溶解氧而定。一般来说，在发酵初期，虽然幼细胞呼吸强度大，耗氧般来说，在发酵初期，虽然幼细胞呼吸强度大，耗氧多，但由于菌体少，相对通风量可以少些；菌体生长多，但由于菌体少，相对通风量可以少些；菌体生长繁殖旺盛期时，耗氧多，要求通风量大些；产酶旺盛繁殖旺盛期时，耗氧多，要求通风量大些；产酶旺盛时的通风量因菌种和酶种而异，一般需要强烈通风；时的通风量因菌种和酶种而异，一般

30、需要强烈通风；但也有例外，通风量过多反而抑制酶的生成。因此，但也有例外，通风量过多反而抑制酶的生成。因此，菌种、酶种、培养时期、培养基和设备性能都能影响菌种、酶种、培养时期、培养基和设备性能都能影响通风量，从而影响酶的产量。目前用于酶制剂生产的通风量，从而影响酶的产量。目前用于酶制剂生产的微生物都为好气性微生物，生产上普遍采用自动测定微生物都为好气性微生物，生产上普遍采用自动测定和记录溶解氧的仪表。和记录溶解氧的仪表。40(4)搅拌的影响搅拌的影响对于好气性微生物的深层发酵，除了需要通气外，还对于好气性微生物的深层发酵，除了需要通气外，还需要搅拌。搅拌有利于热交换、营养物质与菌体均匀需要搅拌。

31、搅拌有利于热交换、营养物质与菌体均匀接触，降低细胞周围的代谢产物，从而有利于新陈代接触，降低细胞周围的代谢产物，从而有利于新陈代谢。同时可打破空气气泡，使发酵液形成湍流，增加谢。同时可打破空气气泡，使发酵液形成湍流，增加湍流速度，从而提高溶氧量，增加空气利用。但搅拌湍流速度，从而提高溶氧量，增加空气利用。但搅拌速度主要因菌体大小而异，由于搅拌产生剪切力，易速度主要因菌体大小而异，由于搅拌产生剪切力，易使细胞受损。同时搅拌也带来一定机械热，易使发酵使细胞受损。同时搅拌也带来一定机械热，易使发酵液温度发生变化。搅拌速度还与发酵液黏度有关。液温度发生变化。搅拌速度还与发酵液黏度有关。41(5)泡沫的

32、影响泡沫的影响发酵中往往产生较多的泡沫。泡沫的存在阻碍发酵中往往产生较多的泡沫。泡沫的存在阻碍了了CO2的排除，影响溶氧量，同时泡沫过多影的排除，影响溶氧量，同时泡沫过多影响补料，也易使发酵液溢出罐外造成跑料。因响补料，也易使发酵液溢出罐外造成跑料。因此，生产上必须采用消泡措施。一般除了机械此，生产上必须采用消泡措施。一般除了机械消泡外，还可利用消泡剂。消泡外，还可利用消泡剂。422.2提高酶发酵产量的方法提高酶发酵产量的方法为了获得大量所需的酶，在实际生产中，为了获得大量所需的酶，在实际生产中，通常采用代谢调控、控制发酵条件、基因通常采用代谢调控、控制发酵条件、基因改变等方法来提高酶的产量。

33、改变等方法来提高酶的产量。432.2.1酶合成调控机制酶合成调控机制2.2.1.1诱导酶合成调控诱导酶合成调控20世纪世纪60年代初雅各布和莫诺等人从分子水平上年代初雅各布和莫诺等人从分子水平上解释了诱导酶合成调节系统。研究了突变对三个解释了诱导酶合成调节系统。研究了突变对三个基因的影响，这三个基因控制分解乳糖所必需的基因的影响，这三个基因控制分解乳糖所必需的三种酶的合成，并依次排列呈乳糖基因区（即乳三种酶的合成，并依次排列呈乳糖基因区（即乳糖操纵子学说）要点如下：糖操纵子学说）要点如下：44乳糖操纵子结构1、乳糖操纵子的组成：大肠杆菌乳糖操纵子含、乳糖操纵子的组成：大肠杆菌乳糖操纵子含Z、Y

34、、A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶，此外还有一个操纵序列和半乳糖苷乙酰转移酶，此外还有一个操纵序列O，一个启动子，一个启动子P和一个调节基因和一个调节基因R。452、阻遏蛋白的负性调节：、阻遏蛋白的负性调节：没有乳糖没有乳糖存在时，存在时，I基因编码的基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列阻遏蛋白结合于操纵序列O处，乳糖操纵子处于阻遏状态，处，乳糖操纵子处于阻遏状态，不能合成分解乳糖的三种酶；不能合成分解乳糖的三种酶；有乳糖有乳糖存在时，乳糖作为诱存在时，乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构，不能结合于操纵序列，乳糖操纵导物诱导阻遏蛋白变构

35、，不能结合于操纵序列，乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。所以，乳糖操纵子子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。所以，乳糖操纵子的这种调控机制为的这种调控机制为可诱导的负调控。可诱导的负调控。诱导机制诱导机制结构基因结构基因S调节基因调节基因R46乳糖操纵子学说对酶合成的指导意义乳糖操纵子学说对酶合成的指导意义1、采用现代诱变育种技术是细胞中的调节、采用现代诱变育种技术是细胞中的调节基因发生突变，致使调节基因不能转录翻基因发生突变，致使调节基因不能转录翻译产生阻遏蛋白，诱导酶变成组成酶。译产生阻遏蛋白，诱导酶变成组成酶。2、在诱导酶合成时加入诱导物以利于诱导、在诱导酶合成时加入诱导物以利于诱

36、导酶的合成。酶的合成。472.2.1.2酶合成的反馈阻遏酶合成的反馈阻遏反馈阻遏反馈阻遏是指酶作用的终产物对酶合成产生阻遏是指酶作用的终产物对酶合成产生阻遏作用，引起反馈阻遏的终产物往往是小分子物质，作用，引起反馈阻遏的终产物往往是小分子物质，又称为产物阻遏。又称为产物阻遏。P14图图2-348反馈阻遏对食品酶生产时的指导意义反馈阻遏对食品酶生产时的指导意义1、设法从培养基中除去其终产物，以消除、设法从培养基中除去其终产物，以消除反馈抑制。反馈抑制。2、向培养基中加入代谢途径的某个抑制因、向培养基中加入代谢途径的某个抑制因子切断代谢途径通路，也可限制细胞内末子切断代谢途径通路，也可限制细胞内末

37、端产物的积累，可达到缓解其反馈阻遏的端产物的积累，可达到缓解其反馈阻遏的目的。目的。492.2.1.3分解代谢对酶合成的阻遏作用分解代谢对酶合成的阻遏作用分解代谢阻遏分解代谢阻遏作用（又称葡萄糖效应）是作用（又称葡萄糖效应）是指其在培养基中由于葡萄糖的存在微生物指其在培养基中由于葡萄糖的存在微生物虽能迅速生长，但明显地抑制某些分解代虽能迅速生长，但明显地抑制某些分解代谢诱导酶的形成。谢诱导酶的形成。50细菌乳糖操纵子的作用机制细菌乳糖操纵子的作用机制( (降解物阻遏降解物阻遏) )调节基因调节基因启动子启动子操纵操纵基因基因lacZ lacYlacACAPcAMPCAP-cAMPCAP-cAM

38、P复合物复合物mRNAmRNA当葡萄糖作唯一碳源时，葡萄糖的降解物对腺苷酸环化酶有抑制作用，当葡萄糖作唯一碳源时，葡萄糖的降解物对腺苷酸环化酶有抑制作用，则则cAMPcAMP的浓度降低，的浓度降低， CAP-cAMPCAP-cAMP复合物减少，不能与启动子结合，故复合物减少，不能与启动子结合，故转录不得进行。转录不得进行。+-半乳糖苷酶-半乳糖苷透过酶-半乳糖苷乙酰基转移酶酶过去称葡萄糖效应过去称葡萄糖效应512.2.1.4酶合成的细胞膜透性调节酶合成的细胞膜透性调节细胞膜透性调节主要有以下几种：细胞膜透性调节主要有以下几种：1、调节胞外酶的分泌、调节胞外酶的分泌2、主动运输的调节、主动运输的

39、调节3、间隔作用的调节、间隔作用的调节522.2.2通过发酵条件控制提高酶产量通过发酵条件控制提高酶产量关于发酵过程中参数控制见关于发酵过程中参数控制见2.1.2pH温度温度中间补料中间补料溶氧量溶氧量532.2.3通过基因突变提高酶产量通过基因突变提高酶产量2.2.3.1自然选育自然选育自然选育自然选育是指不经人工处理，利用微生物的自然突变进行是指不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程称为自然选育。菌种选育的过程称为自然选育。自然突变主要有自然突变主要有两种原因两种原因：（1）自然环境中存在的低剂量宇宙射线、低浓度诱变物）自然环境中存在的低剂量宇宙射线、低浓度诱变物和微生物自身

40、代谢产生的诱变物质的作用。和微生物自身代谢产生的诱变物质的作用。（2）T和和G的六位酮基的烯醇式互变异构及的六位酮基的烯醇式互变异构及C和和A的六位的六位氨基亚氨式互变异构。氨基亚氨式互变异构。54自然诱变的突变率低，概率为自然诱变的突变率低，概率为10-910-8。且可能导致生产上不希望的结果发生，但且可能导致生产上不希望的结果发生，但是自然选育是一种简便易行的选育方法，是自然选育是一种简便易行的选育方法，可以达到纯化菌种、防止退化、稳定生产、可以达到纯化菌种、防止退化、稳定生产、提高生产水平的目的。因其效率低，常和提高生产水平的目的。因其效率低，常和诱变育种结合才能取得良好的效果。诱变育种

41、结合才能取得良好的效果。552.2.2诱变育种诱变育种诱变育种诱变育种是人为利用物理化学等因素，使是人为利用物理化学等因素，使细胞内的遗传物质染色体或细胞内的遗传物质染色体或DNA的片段发的片段发生缺失、易位、倒位、重复等畸变，或生缺失、易位、倒位、重复等畸变，或DNA的某一碱基对发生改变，从而是微生的某一碱基对发生改变，从而是微生物的遗传物质物的遗传物质DNA和和RNA的化学结构发生的化学结构发生变化，引起微生物的遗传变异。变化，引起微生物的遗传变异。56选择诱变育种出发菌株时应注意：选择诱变育种出发菌株时应注意：1、诱变的出发菌株，具有一定的目标产物、诱变的出发菌株，具有一定的目标产物的生

42、产能力的生产能力2、对诱变剂敏感的菌株变异幅度较大、对诱变剂敏感的菌株变异幅度较大3、生产性能好的菌株、生产性能好的菌株4、可选择已经诱变后的菌株、可选择已经诱变后的菌株572.2.4通过基因重组提高酶的产量通过基因重组提高酶的产量基因工程操作主要包括：基因工程操作主要包括：1、目的基因的分离、目的基因的分离2、载体分离、载体分离3、限制性内切酶的应用、限制性内切酶的应用4、基因重组、基因重组5、细胞转化和基因表达、细胞转化和基因表达582.2.5其他方法提高酶产量的方法其他方法提高酶产量的方法1、添加诱导物、添加诱导物:这种方法只适应于诱导酶的合成。这种方法只适应于诱导酶的合成。其关键在于选

43、择适宜的诱导物及其浓度。其关键在于选择适宜的诱导物及其浓度。诱导物：诱导物：一是酶的作用底物，但有些底物并不一定是诱导物；一是酶的作用底物，但有些底物并不一定是诱导物；二是一些难以代谢的底物类似物。二是一些难以代谢的底物类似物。三是诱导物的前体物质。三是诱导物的前体物质。此外此外,对于参加分解代谢的胞外酶，它们的产物也往往行诱导对于参加分解代谢的胞外酶，它们的产物也往往行诱导作用，如纤维二糖诱导纤维素酶。作用，如纤维二糖诱导纤维素酶。592、控制阻遏物的浓度、控制阻遏物的浓度阻遏作用根据机理不同，可分为：产物阻遏和分解代谢物阻遏两阻遏作用根据机理不同，可分为：产物阻遏和分解代谢物阻遏两种。种。

44、1.1.产物阻遏作用是由酶催化作用的产物或者代谢途径的末端产物引起产物阻遏作用是由酶催化作用的产物或者代谢途径的末端产物引起的阻遏作用。的阻遏作用。2.2.分解代谢物阻遏作用是由分解代谢物（葡萄糖等和其它容易利用的分解代谢物阻遏作用是由分解代谢物（葡萄糖等和其它容易利用的碳源等物质经过分解代谢而产生的物质）引起的阻遏作用碳源等物质经过分解代谢而产生的物质）引起的阻遏作用。控制阻遏物的浓度是解除阻遏、提高酶产量的有效措施。 为了减少或者解除分解代谢物阻遏作用，应当控制培养基中葡萄糖等容易利控制培养基中葡萄糖等容易利用的碳源的浓度用的碳源的浓度。采用其他较难利用的碳源，如淀粉等采用补料、分次流加碳

45、源添加一定量的环腺苷酸（cAMP）对于受代谢途径末端产物阻遏的酶，可以通过控制末端产物的浓度的方法控制末端产物的浓度的方法使阻遏解除使阻遏解除。 603、添加表面活性剂、添加表面活性剂表面活性剂可以与细胞膜相互作用，增加细胞的透过性，有利表面活性剂可以与细胞膜相互作用，增加细胞的透过性，有利于胞外酶的分泌，从而提高酶的产量。于胞外酶的分泌，从而提高酶的产量。 将适量的非离子型表面活性剂，如吐温（将适量的非离子型表面活性剂，如吐温（TweenTween）、特里顿）、特里顿(Triton)(Triton)等添加到培养基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的产等添加到培养基中，可以加速胞外酶的分泌，而使

46、酶的产量增加。量增加。 由于离子型表面活性剂对细胞有毒害作用，尤其是季胺型表面由于离子型表面活性剂对细胞有毒害作用，尤其是季胺型表面活性剂（如活性剂（如新洁而灭新洁而灭等）是消毒剂，对细胞的毒性较大，不能等）是消毒剂，对细胞的毒性较大，不能在酶的发酵生产中添加到培养基中。在酶的发酵生产中添加到培养基中。 614 4、添加产酶促进剂、添加产酶促进剂 产酶促进剂是指可以促进产酶、但是作用机理未阐明清楚的物产酶促进剂是指可以促进产酶、但是作用机理未阐明清楚的物质。例如，添加一定量的植酸钙镁，可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷质。例如，添加一定量的植酸钙镁，可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶的产量提高酸二酯酶

47、的产量提高1 12020倍；添加聚乙烯醇（倍；添加聚乙烯醇（Polyvinyl Polyvinyl alcoholalcohol）可以提高糖化酶的产量。产酶促进剂对不同细胞、不同酶）可以提高糖化酶的产量。产酶促进剂对不同细胞、不同酶的作用效果各不相同，现在还没有规律可循，要通过试验确定所添的作用效果各不相同，现在还没有规律可循，要通过试验确定所添加的产酶促进剂的种类和浓度。加的产酶促进剂的种类和浓度。 622.3食品用酶发酵生产实例食品用酶发酵生产实例1、-淀粉酶的生产淀粉酶的生产生产菌种：主要来自细菌和曲霉，如枯草生产菌种：主要来自细菌和曲霉，如枯草芽孢杆菌、黑曲霉等。芽孢杆菌、黑曲霉等。发

48、酵方法：霉菌，固体曲法；细菌，液体发酵方法：霉菌，固体曲法；细菌，液体深层发酵。深层发酵。回收方法：盐析、有机溶剂沉淀和淀粉吸回收方法：盐析、有机溶剂沉淀和淀粉吸附等。附等。632、果胶酶的生产、果胶酶的生产生产菌种：主要来自真菌，如曲霉菌、青生产菌种：主要来自真菌，如曲霉菌、青霉菌等，细菌主要有枯草芽孢杆菌、欧氏霉菌等，细菌主要有枯草芽孢杆菌、欧氏杆菌等。杆菌等。发酵方法：固体曲法和液体深层发酵，依发酵方法：固体曲法和液体深层发酵，依据微生物特性。据微生物特性。回收方法：一般用水提后加入乙醇沉淀。回收方法：一般用水提后加入乙醇沉淀。642.4酶分离纯化的基本原则酶分离纯化的基本原则酶的分离纯

49、化工作，是酶学研究的酶的分离纯化工作，是酶学研究的基础基础。酶的纯。酶的纯化过程，就目前而言，还是一门实验科学。一个化过程，就目前而言，还是一门实验科学。一个特定酶的提纯往往需要通过许多次小实验进行摸特定酶的提纯往往需要通过许多次小实验进行摸索，没有通用的规律可循。酶的纯化过程与一般索，没有通用的规律可循。酶的纯化过程与一般的蛋白质纯化过程相比，又有其本身独有的特点：的蛋白质纯化过程相比，又有其本身独有的特点：一是特定的一种酶在细胞中的含量很少；一是特定的一种酶在细胞中的含量很少；二是酶可以通过测定活力的方法加以跟踪；二是酶可以通过测定活力的方法加以跟踪；前者给纯化带来了困难，而后者却能使我们

50、迅速找出纯化前者给纯化带来了困难，而后者却能使我们迅速找出纯化过程的关键所在。过程的关键所在。652.4.1酶活力的测定酶活力的测定基本概念基本概念酶活力酶活力(Enzymeactivity)：酶活力是指酶催化反应的能：酶活力是指酶催化反应的能力，它表示样品中力，它表示样品中酶的含量酶的含量。1961年国际酶学会规定，年国际酶学会规定，1min催化催化1mol底物转化为产物的酶量为该酶的一个活底物转化为产物的酶量为该酶的一个活力单位力单位(国际单位国际单位)，温度为，温度为25，其它条件，其它条件(pH、离子、离子强度强度)采用最适条件。采用最适条件。非标准的习惯方法：非标准的习惯方法：1小时

51、分解小时分解1g底物底物重要66酶的总活力为样品的全部酶活力。酶的总活力为样品的全部酶活力。总活力总活力=酶活力酶活力总体积总体积(mL)或或=酶活力酶活力总质量总质量(g)67比活力比活力(Specificactivity)：比活力是指单位蛋白质：比活力是指单位蛋白质(毫毫克蛋白质或毫克蛋白氮克蛋白质或毫克蛋白氮)所含有的酶活力所含有的酶活力(单位单位/毫克蛋白毫克蛋白)。比活力是。比活力是酶纯度酶纯度指标，比活力愈高表示酶愈纯，即表示指标，比活力愈高表示酶愈纯，即表示单位蛋白质中酶催化反应的能力愈大。但是，比活力仍然单位蛋白质中酶催化反应的能力愈大。但是，比活力仍然是个相对酶纯度指标。要了

52、解酶的实际纯度，尚需采用电是个相对酶纯度指标。要了解酶的实际纯度，尚需采用电泳等测定方法。泳等测定方法。重要68回收率回收率(Yieldpercent)：回收率是指提纯前与提：回收率是指提纯前与提纯后酶的纯后酶的总活力总活力之比。它表示提纯过程中酶的损之比。它表示提纯过程中酶的损失程度，回收率愈高，其损失愈少。失程度，回收率愈高，其损失愈少。提纯倍数提纯倍数：提纯倍数是指提纯前后两者：提纯倍数是指提纯前后两者比活力比活力之之比。它表示提纯过程中酶纯度提高的程度，提纯比。它表示提纯过程中酶纯度提高的程度，提纯倍数愈大，提纯效果愈佳。倍数愈大，提纯效果愈佳。6970酶活力的测定酶活力的测定酶活力是

53、通过测定酶促反应过程中单位时间内底酶活力是通过测定酶促反应过程中单位时间内底物的减少量或产物的生成量，即测定酶促反应的物的减少量或产物的生成量，即测定酶促反应的速率来获得。一般采用速率来获得。一般采用测定产物的生成量测定产物的生成量来实现来实现酶活力的测定。酶活力的测定。为了保证测定结果的可靠性，须在最适反应条件为了保证测定结果的可靠性，须在最适反应条件下进行，并加以适当的下进行，并加以适当的对照对照。712.4.2酶原料的选择酶原料的选择一般来说，为了使纯化过程容易进行，总是选择目的酶一般来说，为了使纯化过程容易进行，总是选择目的酶含含量最多、干扰物质少；来源丰富、保持新鲜；容易得量最多、干

54、扰物质少；来源丰富、保持新鲜；容易得到、提取工艺简单；稳定性好、安全性好；有综合利用到、提取工艺简单；稳定性好、安全性好；有综合利用价值等的生物组织为原料来进行提取纯化的。价值等的生物组织为原料来进行提取纯化的。在分离纯化动物在分离纯化动物Cu，ZnSOD(超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶)时，一时，一般就以含般就以含Cu，ZnSOD很高的动物血球为原材料。很高的动物血球为原材料。MnSOD主要存在于线粒体中，所以，龙虾、灵芝草、人主要存在于线粒体中，所以，龙虾、灵芝草、人体组织适宜于作为提取体组织适宜于作为提取MnSOD的原材料。但龙虾、灵的原材料。但龙虾、灵芝草等非常昂贵，人体组织也很难得到，

55、因而，除非是芝草等非常昂贵，人体组织也很难得到，因而，除非是特殊目的的纯化，一般不选用这些材料提取酶。特殊目的的纯化，一般不选用这些材料提取酶。72同时在同时在选择酶提取原料时还应注意选择酶提取原料时还应注意：1、酶在细胞内的存在状态、酶在细胞内的存在状态2、材料与酶含量的关系、材料与酶含量的关系3、同一种酶在不同材料中的性质、安全性的差、同一种酶在不同材料中的性质、安全性的差异异4、材料选择后应及时处理，防止酶的破坏、材料选择后应及时处理，防止酶的破坏735、植物材料对酶提取的影响、植物材料对酶提取的影响6、动物脏器中脂肪对酶提取纯化及性质的性质、动物脏器中脂肪对酶提取纯化及性质的性质的影响

56、的影响7、微生物因具有众多优点，成为制备酶的主要、微生物因具有众多优点，成为制备酶的主要材料之一材料之一8、采集的材料应进行预处理，除去明显的杂质。、采集的材料应进行预处理，除去明显的杂质。742.4.3酶的提取酶的提取酶的提取酶的提取是指在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶是指在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程，也称作酶的抽提。酶提取时首先应根据酶充分溶解到溶剂中的过程，也称作酶的抽提。酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。大多数酶能溶解于水，可用水的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。大多数酶能溶解于水，可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液提取；

57、有些酶与脂质结合或含较多的非极性或稀酸、稀碱、稀盐溶液提取；有些酶与脂质结合或含较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。为了提高酶的提取率并防止酶的变性失基团，则可用有机溶剂提取。为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中，要注意控制好温度、活，在提取过程中，要注意控制好温度、pH值等各种条件。值等各种条件。75生物组织的破碎生物组织的破碎各种生物组织的细胞有着不同的特点，在各种生物组织的细胞有着不同的特点，在考虑破碎方法时，要根据细胞性质、处理考虑破碎方法时，要根据细胞性质、处理量及酶的性质，采用合适的方法。量及酶的性质，采用合适的方法。76(2)超声波法超声波法超声波是破碎细胞或细胞

58、器的一种有效手段。经过足超声波是破碎细胞或细胞器的一种有效手段。经过足够时间的超声波处理，细菌和酵母细胞都能得到很好够时间的超声波处理，细菌和酵母细胞都能得到很好的破碎。的破碎。超声处理的主要问题超声处理的主要问题是超声空穴局部过热引是超声空穴局部过热引起酶活性丧失，所以超声振荡处理的时间应尽可能短，起酶活性丧失，所以超声振荡处理的时间应尽可能短，容器周围以冰浴冷却处理，尽量减小热效应引起的酶容器周围以冰浴冷却处理，尽量减小热效应引起的酶的失活。的失活。(1)机械机械(匀浆匀浆)法法利用机械力的搅拌、剪切、研碎细胞。常利用机械力的搅拌、剪切、研碎细胞。常用的有高速组织捣碎机，高压匀浆泵、用的有

59、高速组织捣碎机，高压匀浆泵、直接用研钵研磨等。直接用研钵研磨等。77(3)渗透压法渗透压法渗透破碎是破碎细胞最温和的方法之一。细胞在低渗渗透破碎是破碎细胞最温和的方法之一。细胞在低渗溶液中由于渗透压的作用，溶胀破碎。如红血球在纯溶液中由于渗透压的作用，溶胀破碎。如红血球在纯水中会发生破壁溶血现象。但这种方法对具有坚韧的水中会发生破壁溶血现象。但这种方法对具有坚韧的多糖细胞壁的细胞，如植物、细菌和霉菌不太适用，多糖细胞壁的细胞，如植物、细菌和霉菌不太适用，除非用其他方法先除去这些细胞外层坚韧的细胞壁。除非用其他方法先除去这些细胞外层坚韧的细胞壁。(4)冻融法冻融法生物组织经冰冻后，细胞胞液结成冰

60、晶，使细胞壁胀生物组织经冰冻后，细胞胞液结成冰晶，使细胞壁胀破。冻融法所需设备简单，普通家用冰箱的冷冻室即破。冻融法所需设备简单，普通家用冰箱的冷冻室即可进行冻融。一般需在冻融液中加入蛋白酶抑制剂，可进行冻融。一般需在冻融液中加入蛋白酶抑制剂，如如PMSF(苯甲基磺酰氟苯甲基磺酰氟)、络合剂、络合剂EDTA、还原剂、还原剂DTT(二硫苏糖醇二硫苏糖醇)等以防破坏目的酶。等以防破坏目的酶。78(5)酶消化法酶消化法利用溶菌酶、蛋白水解酶、糖苷酶对细胞膜或细胞壁利用溶菌酶、蛋白水解酶、糖苷酶对细胞膜或细胞壁的酶解作用，使细胞崩解破碎。的酶解作用，使细胞崩解破碎。将革兰氏阳性菌将革兰氏阳性菌(如枯草

61、杆菌如枯草杆菌)与与溶菌酶溶菌酶一起温育，就一起温育，就能得到易破碎的原生质体，用能得到易破碎的原生质体，用EDTA与革兰氏阴性菌与革兰氏阴性菌(如大肠杆菌如大肠杆菌)一起温育，也可制得相应的原生质体。一起温育，也可制得相应的原生质体。几丁质酶几丁质酶和和3葡聚糖酶则常用于水解曲霉、面包霉等葡聚糖酶则常用于水解曲霉、面包霉等的细胞壁。的细胞壁。(6)化学破碎法化学破碎法化学破碎法是应用各种化学试剂与化学破碎法是应用各种化学试剂与细胞膜作用细胞膜作用，使细，使细胞膜（壁）的结构改变或破坏的方法。胞膜（壁）的结构改变或破坏的方法。常用的化学试剂可分为有机溶剂和表面活性剂两大类。常用的化学试剂可分为

62、有机溶剂和表面活性剂两大类。79有机溶剂处理有机溶剂处理常用的有机溶剂有甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等。常用的有机溶剂有甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等。有机溶剂可使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细有机溶剂可使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的透过性，再经提取可使膜结合酶或胞内酶等胞膜的透过性，再经提取可使膜结合酶或胞内酶等释出胞外。释出胞外。表面活性剂处理表面活性剂处理表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用使细胞膜结构破坏，增加膜的透过性。用使细胞膜结构破坏，增加膜的透过性。802.5酶的纯化酶的纯化抽提的酶液是否需要进一步经过纯化，要视其应抽提的酶

63、液是否需要进一步经过纯化，要视其应用部门的要求。用部门的要求。一般工业的酶一般工业的酶，如纺织工业应用，如纺织工业应用淀粉酶脱胶处理，往往采用液体粗酶便可；淀粉酶脱胶处理，往往采用液体粗酶便可；皮革工业应用的细菌蛋白酶也是如此。皮革工业应用的细菌蛋白酶也是如此。食品工业食品工业应用的酶如果粗酶液已达到食品级标准要求，特应用的酶如果粗酶液已达到食品级标准要求，特别是卫生指标，也无需进一步纯化。然而，应用别是卫生指标，也无需进一步纯化。然而，应用于于医药、化学试剂级医药、化学试剂级的酶液必须进一步纯化。的酶液必须进一步纯化。81在浓缩液或发酵液中，除含有我们需要的酶以外，在浓缩液或发酵液中，除含有

64、我们需要的酶以外，还不可避免地存在着其他大分子物质和小分子物还不可避免地存在着其他大分子物质和小分子物质。其中小分子物质在以后的纯化步骤中会自然质。其中小分子物质在以后的纯化步骤中会自然而然的除去。大分子物质中包括核酸、粘多糖及而然的除去。大分子物质中包括核酸、粘多糖及其他蛋白质等。因此，酶的分离纯化工作主要是，其他蛋白质等。因此，酶的分离纯化工作主要是，将酶从杂蛋白中分离出来或者将杂蛋白从酶溶液将酶从杂蛋白中分离出来或者将杂蛋白从酶溶液中除去中除去。现有酶的分离纯化方法都是依据酶和杂。现有酶的分离纯化方法都是依据酶和杂质在性质上的差异而建立的。质在性质上的差异而建立的。82酶和杂质的性质差异

65、大体有以下几个方面，它们的分离方酶和杂质的性质差异大体有以下几个方面，它们的分离方法根据这个基础分为：法根据这个基础分为：(1)根据溶解度大小分离的方法、如盐析法、有机溶剂沉根据溶解度大小分离的方法、如盐析法、有机溶剂沉淀法、共沉淀法、选择性沉淀法、等电点沉淀法等。淀法、共沉淀法、选择性沉淀法、等电点沉淀法等。(2)根据分子大小而设计的方法。如离心分离法、筛膜分根据分子大小而设计的方法。如离心分离法、筛膜分离法、凝胶过滤法等。离法、凝胶过滤法等。(3)按分子所带电荷性质分离的方法，如离子交换分离法、按分子所带电荷性质分离的方法，如离子交换分离法、电泳分离法、聚焦层析法等。电泳分离法、聚焦层析法

66、等。(4)按酶分子专一性结合的分离方法，如亲和层析法、亲按酶分子专一性结合的分离方法，如亲和层析法、亲和洗脱等。和洗脱等。(5)其它方法：如高效液相色谱法、免疫吸附层析等。其它方法：如高效液相色谱法、免疫吸附层析等。重要831、等电点沉淀法、等电点沉淀法等电点时溶解度最低等电点时溶解度最低粗分离，沉淀可能不完全；粗分离，沉淀可能不完全；与盐析法、有机溶剂联合；与盐析法、有机溶剂联合；沉淀后的酶不变性。沉淀后的酶不变性。842、盐析法、盐析法盐离子与酶和蛋白质分子争夺水分子，减弱了酶盐离子与酶和蛋白质分子争夺水分子，减弱了酶和蛋白质的水合程度，使其溶解度降低；盐离子和蛋白质的水合程度，使其溶解度

67、降低；盐离子所带电荷部分地中和了其所带电荷，净电荷减少所带电荷部分地中和了其所带电荷，净电荷减少也易沉淀也易沉淀。注意事项注意事项p36853、有机溶剂沉淀法、有机溶剂沉淀法利用和水互溶的有机溶剂使酶沉淀的方法很早就利用和水互溶的有机溶剂使酶沉淀的方法很早就用来纯化酶。在工业上也很重要，例如血浆蛋白用来纯化酶。在工业上也很重要，例如血浆蛋白质的分离纯化，至今仍采用本法。由于本法的机质的分离纯化，至今仍采用本法。由于本法的机理和盐析法不同，可作为盐析法的补充。理和盐析法不同，可作为盐析法的补充。86加入有机溶剂于酶溶液中产生多种效应，这些效应结合加入有机溶剂于酶溶液中产生多种效应，这些效应结合起

68、来，使酶沉淀。其中主要效应是起来，使酶沉淀。其中主要效应是水的活度的降低水的活度的降低。当。当有机溶剂浓度增大时，水对酶分子表面上荷电基团或亲有机溶剂浓度增大时，水对酶分子表面上荷电基团或亲水基团的水化程度降低，或者说溶剂的介电常数降低，水基团的水化程度降低，或者说溶剂的介电常数降低，因而静电吸力增大。在憎水区域附近有序排列的水分子因而静电吸力增大。在憎水区域附近有序排列的水分子可以为有机溶剂所取代，使这些区域的溶解性增大。但可以为有机溶剂所取代，使这些区域的溶解性增大。但除了憎水性特别强的酶外，对多数酶来说，后者影响较除了憎水性特别强的酶外，对多数酶来说，后者影响较小，所以总的效果是导致酶分

69、子聚集而沉淀。小，所以总的效果是导致酶分子聚集而沉淀。87有机溶剂沉淀法的优点是有机溶剂沉淀法的优点是溶剂容易蒸发除去溶剂容易蒸发除去，不会残留在，不会残留在成品中，因此适用于制备食品级酶。而且有机溶剂密度低，成品中，因此适用于制备食品级酶。而且有机溶剂密度低，与沉淀物密度差大，与沉淀物密度差大，便于离心分离便于离心分离。有机溶剂沉淀法的缺。有机溶剂沉淀法的缺点是，点是，容易使酶变性失活，且有机溶剂易燃、易爆、安全容易使酶变性失活，且有机溶剂易燃、易爆、安全要求较高要求较高。884、离心分离、离心分离离心是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小和离心是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同

70、大小和不同密度的物质分离的技术，在酶的提取和分离纯化过程不同密度的物质分离的技术，在酶的提取和分离纯化过程中，细胞的收集、细胞碎片和沉淀的分离以及酶的纯化等中，细胞的收集、细胞碎片和沉淀的分离以及酶的纯化等往往要使用离心分离。在离心分离时，要根据欲分离物质往往要使用离心分离。在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、以及杂质的大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。离心方法和离心条件。离心机多种多样，按照离心机的最大转速的不同可以分为离心机多种多样，按照离心机的最大转速的不同可以分为常速常速(低速低速)、高速和超速三种。、高速和超速

71、三种。89常速离心机的最大转速在常速离心机的最大转速在8000r/min以内，相对离心力以内，相对离心力(RCF)在在1104g（重力加速度）（重力加速度）以内，在酶的分离纯化过以内，在酶的分离纯化过程中，程中，主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。分离。高速离心机的最大转速为高速离心机的最大转速为11042.5104r/min，相对，相对离心力达到离心力达到1104g1105g，在酶的分离中主要用于在酶的分离中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。90超速离心机的最大转速达超速离心机的最大转速达2.510

72、48104r/min，相对离心力可以高达，相对离心力可以高达5105g。超速离心可以采。超速离心可以采用差速离心、密度梯度离心或等密梯度离心等方用差速离心、密度梯度离心或等密梯度离心等方法。法。超速离心可用于酶分子的分离纯化。超速离心可用于酶分子的分离纯化。在离心在离心过程中，应该根据需要，选择好离心力过程中，应该根据需要，选择好离心力(或离心速或离心速度度)和离心时间，并且控制好温度和和离心时间，并且控制好温度和pH值等条件。值等条件。915、凝胶过滤凝胶过滤(gelfiltrationchromatography)凝胶过滤有多种名称，又称凝胶排阻层析、分子筛层析法、凝胶过滤有多种名称，又称

73、凝胶排阻层析、分子筛层析法、凝胶层析法等。凝胶层析法等。是根据溶质分子的大小进行分离的方法。是根据溶质分子的大小进行分离的方法。它具有一系列的优点：操作方便，不会使物质变性，层析它具有一系列的优点：操作方便，不会使物质变性，层析介质不需再生，可反复使用等；因而在酶纯化中占有重要介质不需再生，可反复使用等；因而在酶纯化中占有重要位置。由于凝胶层析剂的容量比较低，所以在生物大分子位置。由于凝胶层析剂的容量比较低，所以在生物大分子物质的分离纯化中，一般不作为第一步的分离方法，而往物质的分离纯化中，一般不作为第一步的分离方法，而往往在最后的处理中被使用。往在最后的处理中被使用。它的应用主要包括脱盐，生

74、物大分子按分子大小分级分离它的应用主要包括脱盐，生物大分子按分子大小分级分离以及分子量测定等。以及分子量测定等。92图图24 凝胶过滤层析的原理凝胶过滤层析的原理a.小分子由于扩散作用进入凝胶内部被截留；大分子被排阻在颗粒小分子由于扩散作用进入凝胶内部被截留；大分子被排阻在颗粒外，在颗粒间迅速通过。外，在颗粒间迅速通过。b. 1.蛋白质混合物上柱，蛋白质混合物上柱，2. 洗脱开始，小分洗脱开始，小分子扩散进入凝胶颗粒内大分子被排阻在颗粒外，子扩散进入凝胶颗粒内大分子被排阻在颗粒外，3. 小分子被截留，大小分子被截留，大分子向下移动，大小分子分开，分子向下移动，大小分子分开， 4. 大小分子完全

75、分开，大小分子完全分开，5. 大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在行进中。大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在行进中。(1)基本原理基本原理93(2)凝胶种类凝胶种类葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶是分子量几万到几十万的葡聚糖凝胶通过是分子量几万到几十万的葡聚糖凝胶通过环氧氯丙烷环氧氯丙烷交联而成的网状结构物质，可分离分子量从交联而成的网状结构物质，可分离分子量从1000500000的分子。的分子。葡聚糖凝胶在干燥状态是坚硬的白色粉末，不溶于水和盐葡聚糖凝胶在干燥状态是坚硬的白色粉末，不溶于水和盐类溶液。因具有大量的羟基，故有很大的亲水性，在水中类溶液。因具有大量的羟基，故有很大的亲水性，在水

76、中即显膨胀，吸水后机械强度大大降低。它对碱和弱酸即显膨胀，吸水后机械强度大大降低。它对碱和弱酸(pH212)稳定。在强酸溶液中，特别是在高温度下，糖苷键稳定。在强酸溶液中，特别是在高温度下，糖苷键会水解。在中性下，可在会水解。在中性下，可在120加压消毒保存。和氧化剂加压消毒保存。和氧化剂接触会分解。接触会分解。长久不用时，有时会长霉，应加防腐剂。长久不用时，有时会长霉，应加防腐剂。其商品名是其商品名是SephadexG，有各种型号，有各种型号，G后的数字表后的数字表示每示每g干胶吸水量干胶吸水量(即吸水值即吸水值)的的10倍。倍。94聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶是以丙烯酰胺为单体，通过是以丙

77、烯酰胺为单体，通过N，N甲叉双丙烯酰胺为交联剂共聚而成的。商甲叉双丙烯酰胺为交联剂共聚而成的。商品名是品名是BioGelP，有各种型号，有各种型号，P后的数字后的数字乘以乘以1000表示其分离的最大分子量表示其分离的最大分子量(即排阻分子即排阻分子量量)。大小与溶胀时间，机械强度大小与溶胀时间，机械强度95琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶琼脂糖是琼脂抽去琼脂胶等之后琼脂糖是琼脂抽去琼脂胶等之后所得所得D半乳糖和半乳糖和3，6脱水半乳糖，自动缔合脱水半乳糖，自动缔合而成的而成的网眼结构物质网眼结构物质，孔径大小由胶的浓度决定。，孔径大小由胶的浓度决定。以商品以商品Sepharose为例，有为例，有2B、4B

78、和和6B等规格，等规格，B前面数字表示胶百分浓度。前面数字表示胶百分浓度。这类凝胶孔径都比这类凝胶孔径都比较大，适于分离较大的物质，如病毒、细胞颗粒较大，适于分离较大的物质，如病毒、细胞颗粒和和DNA等。等。966、其他纯化方法、其他纯化方法亲和层析法亲和层析法利用生物体内存在的特异性相互作用分子对而设计的利用生物体内存在的特异性相互作用分子对而设计的层析方法层析方法染料层析法染料层析法具有亲和配基的染料可以吸附酶，由于配基的结构类具有亲和配基的染料可以吸附酶，由于配基的结构类似某些酶的底物。似某些酶的底物。疏水层析疏水层析将疏水性基团如丁烷、辛烷、苯固定化到介质上，这将疏水性基团如丁烷、辛烷

79、、苯固定化到介质上，这些基团会与蛋白质生物大分子上的疏水区亲和。些基团会与蛋白质生物大分子上的疏水区亲和。电泳电泳靠溶质在电场移动中移动速度不同而分离的方法。靠溶质在电场移动中移动速度不同而分离的方法。972.4酶纯度的评价酶纯度的评价分离纯化后的酶必须进行纯度进行检验，分离纯化后的酶必须进行纯度进行检验，酶纯度的检验一般方法主要有电泳法、层酶纯度的检验一般方法主要有电泳法、层析法、沉降法、分光光度法、结晶法、免析法、沉降法、分光光度法、结晶法、免疫法等。疫法等。981、电泳法：在凝胶电泳上、电泳法：在凝胶电泳上仅有一条区带仅有一条区带2、层析法：经层析后各部分比活力一致、层析法：经层析后各部

80、分比活力一致993、免疫化学法：免疫扩散、免疫电泳等、免疫化学法：免疫扩散、免疫电泳等4、超速离心沉降分析法、超速离心沉降分析法5、分光光度法：根据、分光光度法：根据A280/A260应为的比应为的比值确定，纯酶的比值为值确定，纯酶的比值为1.756、结晶法、结晶法7、恒溶解度法、恒溶解度法：根据酶溶解度的拐点：根据酶溶解度的拐点1008、酶活力的测定、酶活力的测定1019、其他方法、其他方法在实际工作中，用某一种方法测定酶的纯在实际工作中，用某一种方法测定酶的纯度往往不可靠，因此要从不同角度去测定度往往不可靠，因此要从不同角度去测定酶的均一性。酶的均一性。102酶催化活性的检验酶催化活性的检

81、验Km、Vmax、最适温度、最适温度、pH、热稳定性等、热稳定性等酶活性部位的测定酶活性部位的测定1032.7酶的剂型与保存酶的剂型与保存2.7.1酶的剂型酶的剂型根据纯度分可分为：根据纯度分可分为：1、纯酶制剂、纯酶制剂2、粗酶制剂、粗酶制剂3、复合酶制剂、复合酶制剂根据形态可分为：根据形态可分为：1、液体酶制剂、液体酶制剂2、固体酶制剂、固体酶制剂3、固定化酶制剂、固定化酶制剂104液体酶制剂液体酶制剂包括稀酶液和浓缩酶液。一般除去固体杂质后，不再纯化包括稀酶液和浓缩酶液。一般除去固体杂质后，不再纯化而直接制成，或加以浓缩而成，一般需要加稳定剂。而直接制成，或加以浓缩而成，一般需要加稳定剂

82、。这种这种酶制剂不稳定，且成分复杂，只用于某些工业生产。酶制剂不稳定，且成分复杂，只用于某些工业生产。105固体粗酶制剂固体粗酶制剂发酵液经杀菌后直接浓缩或喷雾干燥制成。有的加入淀粉发酵液经杀菌后直接浓缩或喷雾干燥制成。有的加入淀粉等填充料，用于工业生产。有的经初步纯化后制成，如用等填充料，用于工业生产。有的经初步纯化后制成，如用于洗涤剂、药物生产。用于加工或生产某种产品时，务须于洗涤剂、药物生产。用于加工或生产某种产品时，务须除去起干扰作用的杂酶，才不会影响质量。除去起干扰作用的杂酶，才不会影响质量。固体酶制剂适固体酶制剂适于运输和短期保存，成本也不高。于运输和短期保存，成本也不高。106纯

83、酶制剂纯酶制剂包括结晶酶，通常用作分析试剂和医疗药物。要求较高的包括结晶酶，通常用作分析试剂和医疗药物。要求较高的纯度和一定的活力单位数。纯度和一定的活力单位数。用作分析工具酶时，除了要求没有干扰作用的杂酶存在外，用作分析工具酶时，除了要求没有干扰作用的杂酶存在外，还要求单位质量的酶制剂中酶活力达到一定的单位数。用还要求单位质量的酶制剂中酶活力达到一定的单位数。用作基因工程的工具酶要求不含作基因工程的工具酶要求不含非专一性非专一性的核酸酶，或完全的核酸酶，或完全不含核酸酶，不含核酸酶，1072.7.2酶的稳定性与保存酶的稳定性与保存(1)温度。温度。(2)pH与缓冲液。与缓冲液。(3)酶蛋白的浓度酶蛋白的浓度(4)氧氧(5)为提高酶稳定性，常加入稳定剂为提高酶稳定性，常加入稳定剂108109思考题思考题分离纯化酶有哪些常用方法，根据是什么？分离纯化酶有哪些常用方法，根据是什么？110