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1、细胞增殖抑制实验多年来人类一直在进行着抗肿瘤药物的研究，如何合理有效地筛选药物是整个研究过程中很重要的一个环节。上世纪80年代中期以前，普遍采用体内小鼠白血病P388和L1210模型作为第一轮初筛，其明显的缺陷是会相当一部分有活性的药物会被淘汰。1985年之后，开始采用体外代表各种常见实体瘤的人类肿瘤细胞株进行初筛，优势有：高通量，覆盖面大；所需量少，尤其适合复杂天然产物提取物。细胞增殖抑制实验是初筛时普遍使用的方法之一，有快速、重复性好、准确性高的优点。药物疗效评价标准合成化合物/植物提取物纯品的半数抑制浓度IC5010g/mL，或者植物粗提物的IC5010g/mL，并且有细胞毒性的剂量依赖
2、关系，且最高抑制效率达80%以上，则判定样品在体外对细胞有杀伤作用。n细胞：HeLan试剂：二甲亚砜（DMSO） 二甲基亚砜(DMSO)是目前最好的渗透型细胞冻存保护剂，但也是一种对细胞毒性很大的化学试验剂。在深低温(零下200度)保存细胞时冻存过程中，DMSO能够快速穿透细胞膜进入细胞中，降低冰点、延缓冻存过程，同时提高细胞内离子浓度，减少细胞内冰晶的形成，从而减少细胞损伤。低温时二甲基亚砜的细胞毒性受到抑制。n技术：细胞计数法细胞计数细胞计数 用等渗稀释液将细胞稀释一定倍数，充入血细胞计数池，计数一定体积内的细胞数目，经换算求出每毫升培养液中细胞数量。 计数板为一块特制的长方形厚玻璃板，在
3、板的中部有4条槽，中间两槽之间有一条横槽把计数板的中部隔成二个平台，每个平台中间都有一个计数室，此平台比整个玻璃板的平面低0.1mm，当放上盖玻片后，平台与盖玻片之间的高度为0.1mm。在显微镜下可看到，计数室被划分为边长为1mm的9个大方格，四角的大方格，又分为16个中方格，适用于白细胞计数。中间的一个大方格又被双线分为25个中方格，每个中方格又各分成16个小方格，适用于红细胞计数，通常取四角的4个中方格和中间的1个中方格来计数红细胞。 原始培养细胞数/ml 四个大格子细胞数/4104稀释倍数 细胞计数步骤：细胞计数步骤： 1.将血球计数板及盖玻片用蘸95乙醇的棉团擦干净晾干后，将盖玻片盖于
4、计数池上面。 2.将细胞培养液适当稀释并充分混匀，吸取少量（约10L）沿盖玻片的边缘充填入计数池中，注意勿发生气泡或使稀释液流出计数池。 3.静置一两分钟后进行计数，计数时为了避免大的误差，应当稀释适当的细胞浓度；为了防止重复和遗漏，应按一定的顺序计数；如果细胞压在格线上时，依照“数上不数下，数左不数右“的原则进行计数；可以多次计数以求平均值。计数红细胞时，若各中方格数目相差20个以上，需重新计数。计数培养的细胞时，若细胞聚集成团只按照一个细胞计算；若成团达10以上，需重新制备悬液；若各个大格间数目相差10以上，需要重新计数。 4.计算细胞数。 5.用蘸95乙醇的棉团擦干净计数板及盖片。细胞增
5、殖抑制实验步骤：细胞增殖抑制实验步骤：收集对数生长期的Hela细胞(25cm培养瓶中)，用含10%胎牛血清的DMEM 培养基稀释为11ml，然后接种于24孔组织培养板中，接种体积为100L/孔。再于每孔中加入900L含10%胎牛血清的DMEM 培养基。每组实验最少设3个复孔。以10%（100L）、5%（50L）、2.5%（25L）的浓度将二甲亚砜加入种有细胞的24孔组织培养板中，同时以不加二甲亚砜处理的Hela细胞为对照组。将24孔组织培养板置于37、饱和湿度的5% CO2培养箱中培养72h。吸弃培养板中的旧培养液吸弃培养板中的旧培养液，各加入，各加入100l的的PBS液，轻轻振荡液，轻轻振荡
6、漂洗细胞，以除去悬浮在细胞表面的碎片。漂洗细胞，以除去悬浮在细胞表面的碎片。吸弃吸弃PBS，各，各加入加入100l0.25胰蛋白酶胰蛋白酶消化液，消化消化液，消化35 min，倒置显微镜下观察，待细胞单层收缩突起出现空隙。，倒置显微镜下观察，待细胞单层收缩突起出现空隙。各加入各加入200 l含有血清的含有血清的DMEM培养液培养液，反复，反复吹打细胞吹打细胞，使其成均匀的细胞悬液。使其成均匀的细胞悬液。各取各取10微升悬液进行细胞计数（微升悬液进行细胞计数（计数四个大方格之未染计数四个大方格之未染色的细胞总数，再除色的细胞总数，再除4，乘以稀释倍数，乘以稀释倍数 。注：注：4大格细胞大格细胞总数总数/4稀释倍数稀释倍数104=细胞数细胞数/ml）并计算几个复孔的细胞数的平均值。按下列公式计算细胞增殖抑制率：细胞增殖抑制率=（1-实验组活细胞数/对照组活细胞数）100%。实验结果10%5%2.5%0123.平均值抑制率
