人工结合抗原制备学习教案

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1、会计学1人工结合抗原人工结合抗原(kngyun)制备制备第一页，共16页。n n抗原抗原是指能够是指能够(nnggu)(nnggu)刺激机体产生（特异刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体内外结合，发生免疫效应（特异性反应）巴细胞在体内外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。的物质。n n抗原的基本特性：抗原的基本特性：n n诱导免疫应答的能力，即免疫原性。诱导免疫应答的能力，即免疫原性。n n与免疫应答的产物发生反应，即抗原性（免疫反与免疫应答的产物发生反应，即抗原性（免疫反应性）。应性）。第1页/共15页第二页

2、，共16页。免疫原免疫原免疫原免疫原具有具有具有具有(jy(jy u)u)免疫原性的物质免疫原性的物质免疫原性的物质免疫原性的物质免疫原性的免疫原性的化学化学(huxu)基础基础化学化学(huxu)组成组成 分子量分子量 化学结构化学结构 大分子蛋白、多糖等大分子蛋白、多糖等 10000 具有免疫原性具有免疫原性 ；4000 免疫原免疫原 10000 呈呈弱免疫原性弱免疫原性 ； 4000 一般不具有免疫原性。一般不具有免疫原性。一般而言，分子结构和空间结构愈复杂的物质免疫原性愈强一般而言，分子结构和空间结构愈复杂的物质免疫原性愈强第2页/共15页第三页，共16页。人工人工人工人工(rngng

3、)(rngng)抗原抗原抗原抗原 人人工工抗抗原原：用用化化学学合合成成法法或或基基因因重重组组法法制制备备含含有有已已知知化化学学结结构构决决定定簇簇的的抗抗原原，称称之之为为人人工工抗抗原原。 人人工工结结合合抗抗原原：将将无无免免疫疫原原性性的的简简单单化化学学基基团团与与蛋蛋白白质质载载体体偶偶联联，或或将将无无免免疫疫原原性性的的有有机机分分子子如如二二硝硝基基苯苯（DDNNP P）或或三三硝硝基基苯苯（T TNNP P）与与蛋蛋白白质质载载体体结结合合，形形成成载载体体- -半半抗抗原原结结合合物物，均均属属人人工工结结合合抗抗原原。 人人工工合合成成抗抗原原：用用化化学学方方法法

4、将将活活化化氨氨基基酸酸聚聚合合，使使之之成成为为合合成成多多肽肽。只只由由一一种种氨氨基基酸酸形形成成的的聚聚合合体体称称为为同同聚聚多多肽肽，如如由由左左旋旋赖赖氨氨酸酸形形成成的的共共同同聚聚多多肽肽（P PL LL L）。 基基因因工工程程抗抗原原：将将编编码码免免疫疫原原性性氨氨基基酸酸序序列列的的基基因因克克隆隆化化并并与与适适当当载载体体（如如细细菌菌粒粒或或病病毒毒( (b b n ng gd d ) )）DDNNA A分分子子相相结结合合，然然后后引引入入受受体体细细胞胞中中（如如原原核核细细胞胞的的大大肠肠杆杆菌菌或或真真核核细细胞胞酵酵母母菌菌及及哺哺乳乳类类动动物物细细

5、胞胞）使使之之表表达达，即即能能获获得得免免疫疫原原性性之之融融合合蛋蛋白白，经经纯纯化化后后可可做做为为疫疫苗苗，此此即即基基因因工工程程疫疫苗苗。第3页/共15页第四页，共16页。人工结合人工结合人工结合人工结合(jih)(jih)抗原抗原抗原抗原半半抗抗原原：能能与与对对应应抗抗体体结结合合出出现现( (c ch h x xi i n n) )抗抗原原- -抗抗体体反反应应 、又又不不能能单单独独激激发发人人或或动动物物体体产产生生抗抗体体的的抗抗原原。它它只只有有反反应应原原性性，不不具具免免疫疫原原性性，又又称称不不完完全全抗抗原原。一一些些比比一一般般半半抗抗原原分分子子量量小小，

6、但但有有特特异异结结构构的的化化学学活活性性基基团团物物质质（ 如如青青霉霉素素、磺磺胺胺剂剂等等 ） ，称称为为简简单单半半抗抗原原。载载体体蛋蛋白白：制制作作人人工工结结合合抗抗原原时时与与半半抗抗原原进进行行偶偶联联的的具具有有免免疫疫原原性性的的生生物物大大分分子子，主主要要为为大大分分子子的的蛋蛋白白质质。如如：牛牛血血清清白白蛋蛋白白( (B BS SA A) )。载体(zit)蛋白半抗原偶联桥 第4页/共15页第五页，共16页。半抗原半抗原半抗原半抗原选择合适(hsh)的多肽序列，蛋白质的抗原决定簇一般由 6-12个氨基酸构成，呈连续性或者非连续性序列。抗原决定簇大部分为亲水性基

7、团，暴露在外侧，抗原决定簇柔韧性比较高。制备性抗原地多肽有效长度一般是 10-20个氨基； 334Da 半抗原的分子量 374Da 制备的单克隆抗体具有很高的亲和系数。 300Da 产生具有良好灵敏度和特异性单克隆抗体的可能性下降。确定抗原性区域确定抗原性区域亲水性、表露亲水性、表露(biol)性、性、 柔韧性柔韧性确定多肽的长度确定多肽的长度半抗原半抗原第5页/共15页第六页，共16页。人工抗原合成常用人工抗原合成常用人工抗原合成常用人工抗原合成常用(chn(chn yn yn ) )的载体的载体的载体的载体 载载体体表表面面应应首首先先应应具具有有化化学学活活性性基基团团。 载载体体应应具

8、具备备一一定定的的容容量量，可可以以( (k k y y ) )偶偶联联足足够够的的分分子子。 载载体体应应该该是是惰惰性性的的，不不应应干干扰扰偶偶联联分分子子的的功功能能。 载载体体应应具具有有足足够够的的稳稳定定性性，且且应应该该是是廉廉价价易易得得的的。 牛牛血血清清白白蛋蛋白白( (B BS SA A) )、卵卵清清蛋蛋白白( (OOV VA A) )、钥钥孔孔血血蓝蓝蛋蛋白白( (K KL LHH) )、人人血血清清白白蛋蛋白白( (HHS SA A) )及及人人工工合合成成的的多多聚聚赖赖氨氨酸酸( (P PL LL L) )等等是是常常用用的的载载体体蛋蛋白白。载体(zit)的

9、特点第6页/共15页第七页，共16页。蛋白蛋白蛋白蛋白(dnbi)(dnbi)偶联方法偶联方法偶联方法偶联方法 一般是由半抗原上的活性基团决定偶联合成一般是由半抗原上的活性基团决定偶联合成(hchng)(hchng)的的方法。方法。 所有的偶联方法都应该是通过羧基或氨基端残基将多所有的偶联方法都应该是通过羧基或氨基端残基将多肽耦联到载体蛋白上。肽耦联到载体蛋白上。缓冲液成分及其纯度(chnd)和离子强度、PH偶联剂的有效浓度偶联物的浓度偶联剂相对量偶联物相对比例半抗原的稳定性、可溶性、理化特性偶联效果通常是在条件温和的水溶液中将半抗原与载体蛋白共价结合，不宜在高温、低温、强碱、强酸条件下进行。

10、第7页/共15页第八页，共16页。蛋白蛋白蛋白蛋白(dnbi)(dnbi)偶联方法偶联方法偶联方法偶联方法n n分分子子中中含含有有羧羧基基或或者者( (h hu u z zh h ) )可可羧羧化化的的半半抗抗原原的的偶偶联联n n混混合合酸酸酐酐法法（mmi ix xe ed d a an nh hy yd dr ri id de e mme et th ho od d），又又称称氯氯甲甲酸酸异异丁丁酯酯法法n n 正正丁丁胺胺 n n - -C COOOOHH- - 中中间间体体+ +NNHH3 3+ + 结结合合产产物物n n + +氯氯甲甲酸酸异异丁丁酯酯n n碳碳二二亚亚胺胺法法(

11、 (E EDDC C) )n n 半抗半抗原原载体蛋白酰胺键酰胺键EDC第8页/共15页第九页，共16页。蛋白蛋白蛋白蛋白(dnbi)(dnbi)偶联方法偶联方法偶联方法偶联方法n n含有(hn yu)氨基或可还原硝基半抗原的偶联n n戊二醛法 -N=C （schiff键）n n重氮化法 （用于活性基团是芳香胺基的半抗原）n n 芳香胺基+NaNO2 +HCl 重氮盐第9页/共15页第十页，共16页。蛋白蛋白(dnbi)偶联方法偶联方法n n含羟基半抗原的偶联n n琥珀酸酐法n n -OH-+琥珀酸酐 无水吡啶 带有羧基(su j)的中间体 EDC法或混合酸酐法 结合产物n n羰基二咪唑法（C

12、DI）n n N，N-羰基二咪唑是引入羰基的高活性试剂第10页/共15页第十一页，共16页。方法举例（方法举例（方法举例（方法举例（EDCEDC法实验法实验法实验法实验(shyn)(shyn)步骤）步骤）步骤）步骤）mTP 5 mgcBSA 2.5 mgTE buffer（pH 8.0） 250 l EDCHCl 79 mg充分(chngfn)溶解于250 l TE buffer（pH 8.0）37 摇床中反应摇床中反应(fnyng)2 hSephadex柱0.5 ml 溶液在PBS中透析3 d透析产物小剂量分装，于20 保存备用第11页/共15页第十二页，共16页。影响人工影响人工影响人工影

13、响人工(rngng)(rngng)抗原质量的因素抗原质量的因素抗原质量的因素抗原质量的因素偶偶联联比比（联联接接到到蛋蛋白白质质分分子子上上的的半半抗抗原原数数目目） 连连接接到到蛋蛋白白分分子子上上的的半半抗抗原原数数以以5 5- -2 20 0为为宜宜，为为了了取取得得最最佳佳免免疫疫效效果果，应应逐逐个个确确定定各各种种载载体体的的最最佳佳结结合合比比。偶偶联联桥桥 结结构构简简单单，能能量量低低，直直链链，有有助助于于半半抗抗原原暴暴露露在在外外面面 最最好好( (z zu u h h o o) )3 3- -6 6个个直直链链的的碳碳原原子子结结构构半半抗抗原原的的分分子子空空间间结

14、结构构 最最好好( (z zu u h h o o) )有有分分支支结结构构， 最最好好( (z zu u h h o o) )尽尽可可能能利利用用不不同同位位点点都都合合成成出出人人工工抗抗原原，然然后后筛筛选选。第12页/共15页第十三页，共16页。人工人工人工人工(rngng)(rngng)抗原的质量评定抗原的质量评定抗原的质量评定抗原的质量评定n n浓浓度度测测定定n n 紫紫外外吸吸收收法法、福福林林酚酚法法、双双缩缩脲脲法法、微微量量凯凯式式定定量量法法、染染色色结结合合法法和和荧荧光光法法等等。n n纯纯度度鉴鉴定定和和结结构构分分析析n n 紫紫外外光光谱谱( (g gu u n ng gp p ) )扫扫描描法法n n 电电泳泳技技术术鉴鉴定定是是否否达达到到电电泳泳纯纯第13页/共15页第十四页，共16页。谢谢(xi xie)！第14页/共15页第十五页，共16页。内容(nirng)总结会计学。与免疫应答的产物发生反应，即抗原性（免疫反应性）。免疫原具有免疫原性的物质(wzh)。只由一种氨基酸形成的聚合体称为同聚多肽，如由左旋赖氨酸形成的共同聚多肽（PLL）。载体表面应首先应具有化学活性基团。载体应具有足够的稳定性，且应该是廉价易得的。一般是由半抗原上的活性基团决定偶联合成的方法。N，N-羰基二咪唑是引入羰基的高活性试剂。谢谢第十六页，共16页。