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1、2010版药典微生物检验培训内容l原有：无菌检查法原有：无菌检查法 微生物限度检查方法微生物限度检查方法 灭菌法灭菌法l新增：微生物限度检查法指导原则新增：微生物限度检查法指导原则 防腐剂效力检查法指导原则防腐剂效力检查法指导原则 药品微生物实验室规范指导原则药品微生物实验室规范指导原则 药品微生物检验替代方法验证指导原则药品微生物检验替代方法验证指导原则l补充：全封闭式无菌检测系统和无菌隔离技术补充：全封闭式无菌检测系统和无菌隔离技术 的应用及其验证的应用及其验证无菌检查法总则总则：环境、设备、人员培养基培养基：品种、制备、灭菌、贮存、适用性检查稀释液、冲洗液稀释液、冲洗液：品种、制备、灭菌
2、方法验证试验方法验证试验：直接接种法、薄膜过滤法供试品的无菌检查供试品的无菌检查：供试品的处理、对照试验、 直接接种法、薄膜过滤法、培养及观察结果判断结果判断培养基适用性检查包括：无菌性检查 灵敏度检查灵敏度检查灵敏度检查 菌种：不得超过菌种：不得超过5 5代代 菌液：浓度菌液：浓度100cfu/ml100cfu/ml 接种：接种：2 2管管+ +菌液，菌液，1 1管空白管空白 结果判断：结果判断：+ +菌液菌液生长良好生长良好 空白空白无菌生长无菌生长菌种和菌液制备菌液制备操作步骤接种（表格）接种（图示）方法验证试验Why：确认供试品无抑菌活性或已被消除When：建立检查方法 原检验条件改变
3、 产品组分发生改变What：供试品是否有抑菌性 采取消除抑菌性的方法How：按供试品的无菌检查法验证直接接种法重点：重点：1 1、供试品有无抑菌性、供试品有无抑菌性2 2、梯度加入培养基、梯度加入培养基操作流程（表格）操作流程（图示）验证直接接种法结果判断：结果判断：u所有含供试品的管所有含供试品的管生长良好生长良好供试品无抑菌作用供试品无抑菌作用可以用可以用直接接种法直接接种法u任一任一含供试品的含供试品的管管生长微弱、缓慢或不生长生长微弱、缓慢或不生长供试品仍有供试品仍有抑菌作用抑菌作用解决方法（目的：解决方法（目的：消除抑菌活性消除抑菌活性）扩大培养基）扩大培养基用量、薄膜过滤法或其他用
4、量、薄膜过滤法或其他不管采用什么方法，都要进行验证！不管采用什么方法，都要进行验证！ 验证薄膜过滤法重点：重点：1 1、供试品有无抑菌性、供试品有无抑菌性2 2、梯度加入冲洗液、梯度加入冲洗液操作流程（表格）操作流程（图示）验证薄膜过滤法结果判断：结果判断：u所有含供试品的容器所有含供试品的容器生长良好生长良好供试品无抑菌作用供试品无抑菌作用可以用直接接种法可以用直接接种法u任一任一含供试品的容器含供试品的容器生长微弱、缓慢或不生长生长微弱、缓慢或不生长供试供试品仍有抑菌作用品仍有抑菌作用解决方法（目的：解决方法（目的：消除抑菌活性消除抑菌活性）增加冲洗量、增加培养基用量、使用中和剂、更换滤增
5、加冲洗量、增加培养基用量、使用中和剂、更换滤膜品种等等膜品种等等不管采用什么方法，都要进行验证！不管采用什么方法，都要进行验证！验证中和法原理原理：加适量中和剂（可与前两种方法联合使用）重点：重点：1、证明中和剂对试验菌无毒性 2、梯度加入结果判断：结果判断：u所有含供试品的管所有含供试品的管生长良好生长良好供试品无抑菌作用供试品无抑菌作用中和剂对试中和剂对试验菌无毒性验菌无毒性u任一任一含供试品的含供试品的管管生长微弱、缓慢或不生长生长微弱、缓慢或不生长供试品仍有抑菌供试品仍有抑菌作用作用解决方法（目的：解决方法（目的：消除抑菌活性消除抑菌活性）增加中和剂用量、）增加中和剂用量、增加冲洗量增
6、加冲洗量/ /培养基用量、更换滤膜品种等等培养基用量、更换滤膜品种等等不管采用什么方法，都要进行验证！不管采用什么方法，都要进行验证！微生物限度检查法总则总则检验量：检验量：最小包装单位制备供试液：制备供试液：含抑菌成分细菌、霉菌及酵母菌计数细菌、霉菌及酵母菌计数：平皿法、薄膜过滤法控制菌检查控制菌检查：7种.供试液制备、增菌、分离、确认试验、结果判断 结果判断结果判断稀释液稀释液培养基培养基分类产品微限标准分类产品微限标准计数培养基的适用性检查要点：要点：需用对照培养基（中检所）、回收率结果判定：结果判定：1、 2、菌落形态大小应与对照培养基上 的菌落一致 计数方法的验证目的目的：考察供试液
7、制备过程中微生物受影响的程度要点要点：至少应进行3次独立的平行试验试验菌种试验菌种：同适用性检查验证方法验证方法：1、试验组 (1)平皿法:1ml供试液+50100cfu试验菌倾注培养基 (2)薄膜过滤法:规定量供试液+50100cfu试验菌(最后 一次冲洗时)过滤培养基 2、菌液组 3、供式品对照组 4、稀释剂对照组结果判断：结果判断：在3次独立的平行试验中 (1)稀释组对照组的菌数回收率70% (2)试验组的菌数回收率70% (3)若试验组的菌数回收率70%，应采用其他方法或联合 方法消除供试品的抑菌活性 控制菌检查用培养基的适用性检查检查项目检查项目：促生长能力、指示能力、抑制能力结果判
8、定结果判定：与对照培养基比较 促生长能力菌落大小、形态特征 抑制能力无菌生长 指示能力生长情况、指示剂反应控制菌检查方法的验证方法：方法：规定量供试液+50100cfu试验菌相应的控制菌检查法要点要点：验证大肠菌群检查法用大肠埃希菌作为验证菌株结果判断结果判断： 检出试验菌该供试品可用此法 未检出试验菌消除供试品抑菌活性，重新验证抑菌剂（防腐剂）效力检查法指导原则为什么？为什么？ 防止制剂在正常贮藏和使用防止制剂在正常贮藏和使用过程中可能发生的微生物污染和繁殖过程中可能发生的微生物污染和繁殖使药物发生变质而对使用者造成危害，使药物发生变质而对使用者造成危害，尤其是多剂量包装的制剂。尤其是多剂量
9、包装的制剂。 抑菌剂（防腐剂）效力检查法指导原则l用途用途：测定灭菌、非灭菌制剂中抑菌剂的活性l目的目的：1、评价最终产品的抑菌效力 2、检查产品在有效期内抑菌剂的效 力是否符合要求 3、指导生产企业在制剂研发阶段确定 抑菌剂的浓度抑菌剂（防腐剂）效力检查法指导原则宗旨宗旨：1、不管是添加的抑菌剂，还是药物本身 具有抗菌活性，在药物研发药物研发阶段，均 应确认其抗菌效力。 2、应验证最终容器中的抑菌剂效力在有 效期内不因贮藏条件而降低。 3、制剂中抑菌剂的量应为最低有效量最低有效量。 同时，为保证用药安全，最终包装容 器中的抑菌剂有效浓度应低于对人体低于对人体 有害的浓度有害的浓度。 抑菌剂（
10、防腐剂）效力检查法指导原则产品分类产品分类1类：注射剂、其他非肠道制剂，包括乳剂、耳 用制剂、无菌鼻用制剂及眼用制剂2类：局部给药制剂、非灭菌鼻用制剂及用于黏 膜的乳剂3类：口服非固体制剂（非抗酸制剂）4类：非固体抗酸制剂抑菌剂（防腐剂）效力检查法指导原则培养基培养基细菌TSA、TSB真菌沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基同样要进行培养基的适用性检查适用性检查： 菌种：菌种：同微生物限度检查法 菌液的制备菌液的制备：同微生物限度检查法（计数培养基） 结果判断结果判断：同微生物限度检查法（回收率应达70%； 菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致） 抑菌剂（防腐剂）效力检查法指导原则测定
11、方法测定方法菌种菌种：同培养基的适用性检查。若需要，制剂中常见的污 染微生物也可作为试验菌株。菌液的制备菌液的制备：比浊法供试品接种供试品接种：取包装完整的供试品至少5份，直接接种试验菌；或取 适量供试品分别转移至5个适宜的无菌容器中，再接菌1 、2 、3 类：105106cfu/g或ml 4类：l03104cfu/g或ml接种菌液的体积不得超过供试品体积的0.5%1% 充分混合，使供试品中的试验菌均匀分布抑菌剂（防腐剂）效力检查法指导原则存活菌数测定存活菌数测定u每个容器中取供试品1ml或g，用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释成1:10、1:102 、1:103 等稀释级。照微生物限
12、度检查法，采用平皿法或薄膜过滤法测定每份供试品中所含的菌数。u菌数测定方法同样需要进行验证验证（验证方法按微生物限度检查法中的“计数方法的验证”进行）抑菌剂（防腐剂）效力检查法指导原则u结果计算结果计算：根据菌数测定结果，计算1ml或g供试品各试验菌所加的菌数及各间隔时间的菌数，并换算成lg值 u效力判断效力判断：根据各间隔时间的菌数lg值相对于初始值（0时菌数lg值）减少程度进行评价 抑菌剂（防腐剂）效力检查法指导原则抑菌剂（防腐剂）效力检查法指导原则解释解释：1、初始值初始值：即0时菌数，供试品加入试验菌，摇匀，立即取样检查，培养，计数2、不增加不增加：指对前一个测定时间，试验菌增加的数量
13、不超过0.5lg（如1类细菌，“第第14天天28天菌数不增加天菌数不增加”，是14天与28天作比较） 3、7天、天、14天的下降数天的下降数：均与0时菌数作比较药品微生物检验替代方法验证指导原则 为什么？为什么？ 药品微生物检验面临的问题药品微生物检验面临的问题l产品放行对时间的要求VSVS微生物检验周期漫长l生产环境监控的时效性要求VS微生物检验报告的滞后l微生物检验快速分析技术的要求VS药典收载的微生物检验方法发展缓慢药品微生物检验替代方法验证指导原则u目的目的：判断所采用的试验方法能否替代药典规定的方法用 于药品微生物的检验提供技术指导。u新的微生物检验技术，大体分为新的微生物检验技术，
14、大体分为3 3类类： 基于微生物生长信息生长信息的检验技术， 如生物发光技术、电化学技术、比浊法等； 直接测定被测介质中活微生物活微生物的检验技术， 如固相细胞技术法、流式细胞计数法等； 基于微生物细胞所含有特定组成成分特定组成成分的分析技术， 如脂肪酸测定技术、核酸扩增技术、基因指纹分析技 术等 药品微生物检验替代方法验证指导原则基于微生物生长信息的检验技术基于微生物生长信息的检验技术例如，Millipore公司生产的The Milliflex Rapid Microbiology Detection system 优势优势：短时间培养（只需数小时）药品微生物检验替代方法验证指导原则直接测定被测介质中活微生物的检验技术直接测定被测介质中活微生物的检验技术例如，BioVigilant公司生产的空气浮游菌瞬 时计数仪后
