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1、第三章第三章 微生物的营养微生物的营养第四节第四节 培养基培养基 培养基培养基是进行科学研究，发酵生产微是进行科学研究，发酵生产微生物制品等的基础生物制品等的基础 。一、定义一、定义培养基培养基（medium）是人工配制的是人工配制的, ,适合微生适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。 任何培养基都应该具备微生物生长所需要六任何培养基都应该具备微生物生长所需要六大营养要素：大营养要素：碳源碳源 氮源氮源 无机盐无机盐 能源能源 生长因子生长因子 水水 任何培养基一旦配成任何培养基一旦配成, ,必须立即进行灭菌处理必须立即进行灭菌处理常规高压蒸汽灭菌常规
2、高压蒸汽灭菌某些成分进行分别灭菌；某些成分进行分别灭菌；过滤除菌；过滤除菌；1.05kg/cm2,121.315-30分钟分钟0.56kg/cm2,112.615-30分钟分钟常用的培养基灭菌方法常用的培养基灭菌方法一、定义一、定义二、配制培养基的基本原则二、配制培养基的基本原则1 1、选择适宜的营养物质、选择适宜的营养物质2 2、营养物的浓度及配比合适、营养物的浓度及配比合适3 3、物理、化学条件适宜、物理、化学条件适宜4 4、经济节约、经济节约5 5、精心设计、试验比较、精心设计、试验比较根据不同微生物的营养需要配制不根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基，同的培养基，如自型微生物的培养
3、如自型微生物的培养基完全可以（或应该）由简单的无基完全可以（或应该）由简单的无机物质组成。异养做生物的培养基机物质组成。异养做生物的培养基至少需要含有一种有机物质。至少需要含有一种有机物质。1 1、选择适宜的营养物质、选择适宜的营养物质培养不同的微生物必须采用不同的培养条件培养不同的微生物必须采用不同的培养条件; 实验室的常用培养基：实验室的常用培养基：细菌细菌: :牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基( (简称肉汤培养基简称肉汤培养基););放线菌放线菌: :高氏高氏1 1号合成培养基培养号合成培养基培养; ;酵母菌酵母菌: :麦芽汁培养基麦芽汁培养基; ;霉菌霉菌: :查氏合成培养基查氏合
4、成培养基. .实验室一般培养实验室一般培养:普通常用培养基普通常用培养基;遗传研究遗传研究:成分清楚的合成培养基成分清楚的合成培养基;生理、代谢研究生理、代谢研究:选用相应的培养基选用相应的培养基.例如枯草芽孢杆菌例如枯草芽孢杆菌: :一般培养一般培养: :肉汤培养基或肉汤培养基或LBLB培养基培养基; ;自然转化自然转化: :基础培养基基础培养基; ;观察芽孢观察芽孢: :生孢子培养基生孢子培养基; ;产蛋白酶产蛋白酶: :以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶 培养基培养基. .培养目的不同培养目的不同,原料的选择和配比不同原料的选择和配比不同.二、配制培养基的基本原则二
5、、配制培养基的基本原则2 2、营养物质浓度及配比合适、营养物质浓度及配比合适营养物质的浓度适宜；营养物质的浓度适宜；营养物质之间的配比适宜；营养物质之间的配比适宜；高浓度糖类物质、无机盐、重金属离子等高浓度糖类物质、无机盐、重金属离子等不仅不能维持和促进微生物的生长，反而不仅不能维持和促进微生物的生长，反而起到抑制或杀菌作用起到抑制或杀菌作用。培养基中各营养物质之间的浓度配比也直培养基中各营养物质之间的浓度配比也直接影响微生物的生长繁殖和接影响微生物的生长繁殖和( (或或) )代谢产物代谢产物的形成和积累的形成和积累, ,其中碳氮比其中碳氮比(C/N)的影响大的影响大. . 发酵生产谷氨酸发酵
6、生产谷氨酸: :碳氮比为碳氮比为4/1时时: :菌体大量繁殖菌体大量繁殖, ,谷氨酸积累少谷氨酸积累少碳氮比为碳氮比为3/1时时: :菌体繁殖受到抑制菌体繁殖受到抑制, ,谷氨酸产谷氨酸产 量则大量增加量则大量增加。二、配制培养基的基本原则二、配制培养基的基本原则3 3、物理化学条件适宜、物理化学条件适宜pH 水活度水活度 氧化还原电位氧化还原电位二、配制培养基的基本原则二、配制培养基的基本原则3 3、物理化学条件适宜、物理化学条件适宜1）pH培养基的培养基的pH必须控制在一定的范围内必须控制在一定的范围内, ,以满足以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物不同类型微生物的生长繁殖或产生代
7、谢产物通常培养条件：通常培养条件：细菌与放线菌细菌与放线菌: :pH77.5酵母菌和霉菌酵母菌和霉菌: :pH4.56范围内生长范围内生长为了维持培养基为了维持培养基pH的相对恒定的相对恒定, ,通常在培养通常在培养基中加入基中加入pH缓冲剂缓冲剂, ,或在进行工业发酵时补或在进行工业发酵时补加酸、碱。加酸、碱。3 3、物理化学条件适宜、物理化学条件适宜2 2）水活度）水活度 在天然环境中在天然环境中, ,微生物可实际利用的自由水微生物可实际利用的自由水或游离水的含量或游离水的含量. . 一般用在一定的温度和压力条件下一般用在一定的温度和压力条件下, ,溶液的溶液的蒸汽压力与同样条件下纯水蒸汽
8、压力之比表蒸汽压力与同样条件下纯水蒸汽压力之比表示示, ,即即: :w=Pw/Pow 式中式中Pw代表溶液蒸汽压力代表溶液蒸汽压力 POw代表纯水蒸汽压力。代表纯水蒸汽压力。 纯水纯水w为为1.00, ,溶液中溶质越多溶液中溶质越多, , w越小。越小。 微生物一般在微生物一般在w为为0.600.99的条件下生的条件下生长长, ,w过低时过低时, ,微生物生长的迟缓期延长微生物生长的迟缓期延长, ,比比生长速率和总生长量减少。生长速率和总生长量减少。 微生物不同，其生长的最适微生物不同，其生长的最适w不同。不同。3 3、物理化学条件适宜、物理化学条件适宜2 2）水活度）水活度3 3、物理化学条
9、件适宜、物理化学条件适宜3 3）氧化还原电位）氧化还原电位氧化还原电位氧化还原电位又称氧化还原电势又称氧化还原电势(redox potential),是是度量某氧化还原系统中的还原剂释放电子或氧化剂度量某氧化还原系统中的还原剂释放电子或氧化剂接受电子趋势的一种指标接受电子趋势的一种指标, ,其单位是其单位是V( (伏伏) )或或mV( (毫伏毫伏).).就向微生物与就向微生物与pH的关系一样的关系一样, ,不同类型微生物不同类型微生物生长对氧化还原电位生长对氧化还原电位()的要求不同的要求不同好氧性微生物好氧性微生物: +0.1伏以上时可正常生长伏以上时可正常生长, , 以以+0.3+0.4伏
10、为宜伏为宜；厌氧性微生物厌氧性微生物: :低于低于+0.1伏条件下生长伏条件下生长；兼性厌氧微生物兼性厌氧微生物: :+0.1伏以上时进行好氧呼吸伏以上时进行好氧呼吸, , +0.1伏以下时进行发酵伏以下时进行发酵。3 3、物理化学条件适宜、物理化学条件适宜3 3）氧化还原电位）氧化还原电位氧化还原电位与氧分压和氧化还原电位与氧分压和pH有关有关, ,也受某些微也受某些微生物生物代谢产物代谢产物的影响的影响 增加通气量增加通气量( (如振荡培养、搅拌如振荡培养、搅拌) )提高培养基的氧提高培养基的氧分压分压, ,或加入氧化剂，从而增加或加入氧化剂，从而增加值；值； 在培养基中加入抗坏血酸在培养
11、基中加入抗坏血酸（0.1%）、硫化氢、硫化氢(0.025%)、半胱氨酸、半胱氨酸(0.05%)、谷胱甘肽、二硫苏糖、谷胱甘肽、二硫苏糖醇、庖肉等还原性物质可降低醇、庖肉等还原性物质可降低值。值。培养基中加入氧化还原指示剂刃天青可对培养基中加入氧化还原指示剂刃天青可对氧化还原电位进行间接测定氧化还原电位进行间接测定4、经济节约配制培养基时应尽量利用廉价且易于获得的原配制培养基时应尽量利用廉价且易于获得的原料作为培养基成份料作为培养基成份, ,特别是在发酵工业中特别是在发酵工业中, ,以降以降低生产成本。低生产成本。以粗代精以粗代精以以“野野”代代“家家”以废代好以废代好以简代繁以简代繁以烃代粮以
12、烃代粮以纤代糖以纤代糖以无机氮代蛋白以无机氮代蛋白对微生物来说对微生物来说, ,各种粗原料营养更加完全各种粗原料营养更加完全, ,效果更好效果更好. .而且在经济上也节约。而且在经济上也节约。以野生植物原料代替栽培植物原料以野生植物原料代替栽培植物原料, ,如木薯如木薯橡子、薯芋等都是富含淀粉质的野生植物橡子、薯芋等都是富含淀粉质的野生植物, ,可以部分取代粮食用于工业发酵的碳源。可以部分取代粮食用于工业发酵的碳源。 以工农业生产中易污染环境的废弃物作为培养微以工农业生产中易污染环境的废弃物作为培养微生物的原料生物的原料. .例如例如, ,糖蜜糖蜜( (制糖工业中含有蔗糖的废液制糖工业中含有蔗
13、糖的废液) )乳清乳清( (乳制品工业中含有乳糖的废液乳制品工业中含有乳糖的废液) )、豆制品工业、豆制品工业废液及黑废液废液及黑废液( (造纸工业中含有戊糖和己糖的亚硫造纸工业中含有戊糖和己糖的亚硫酸纸浆酸纸浆) )等都可作为培养基的原料等都可作为培养基的原料. .工业上的甲烷发工业上的甲烷发酵主要利用废水、废渣作原料酵主要利用废水、废渣作原料, ,在我国农村在我国农村, ,已推广已推广利用粪便及禾草为原料发酵生产甲烷作为燃料利用粪便及禾草为原料发酵生产甲烷作为燃料. .另另外外, ,大量的农副产品或制品，如麸皮、米糠、玉米浆大量的农副产品或制品，如麸皮、米糠、玉米浆酵母浸膏、酒糟、豆饼、花
14、生饼、蛋白胨等都是常酵母浸膏、酒糟、豆饼、花生饼、蛋白胨等都是常用的发酵工业原料。用的发酵工业原料。某制药厂改进链霉素发酵液中的原有配方某制药厂改进链霉素发酵液中的原有配方, ,设法减去设法减去30-50%的黄豆饼粉、的黄豆饼粉、25%的葡萄的葡萄糖和糖和20%硫酸铵，结果反而提高了产量。硫酸铵，结果反而提高了产量。开发利用纤维素这种世界上含量最丰富的可开发利用纤维素这种世界上含量最丰富的可再生资源再生资源. .将大量的纤维素农副产品转变为优将大量的纤维素农副产品转变为优质饲料质饲料,工业发酵原料工业发酵原料, ,燃料燃料, ,人类的食品及饮料人类的食品及饮料以大气氮、铵盐、硝酸盐或尿素等一类
15、非以大气氮、铵盐、硝酸盐或尿素等一类非蛋白质或非氨基酸廉价原料用作发酵培养蛋白质或非氨基酸廉价原料用作发酵培养基的原料让微生物转化成菌体蛋白质或含基的原料让微生物转化成菌体蛋白质或含氮的发酵产物供人们利用。氮的发酵产物供人们利用。二、配制培养基的基本原则二、配制培养基的基本原则以石油或天然气副产品代替糖质原料来培以石油或天然气副产品代替糖质原料来培养微生物。生产石油蛋白将石油产品转化养微生物。生产石油蛋白将石油产品转化成一些产值更高的高级醇、脂肪酸、环烷成一些产值更高的高级醇、脂肪酸、环烷酸等化工产品和若干合成物；对石油产品酸等化工产品和若干合成物；对石油产品的品质进行改良，如脱硫、脱蜡等。的
16、品质进行改良，如脱硫、脱蜡等。5 5、精心设计、试验比较、精心设计、试验比较* *进行生态模拟进行生态模拟, ,研究某种微生物的培养条件研究某种微生物的培养条件; ;* *文献查阅文献查阅, ,设计特定微生物的培养基配方设计特定微生物的培养基配方; ;* *试验比较试验比较, ,确定特定微生物的最佳培养条件确定特定微生物的最佳培养条件. .二、配制培养基的基本原则二、配制培养基的基本原则三、三、培养基的类型及应用培养基的类型及应用1 1按成份不同划分按成份不同划分天然培养基天然培养基(complex medium)以化学成分还不清楚的或化学成分不恒定以化学成分还不清楚的或化学成分不恒定的天然有
17、机物组成的天然有机物组成合成培养基合成培养基(synthetic medium)是由化学成份完全了解的物质配制而成的是由化学成份完全了解的物质配制而成的培养基，也称化学限定培养基培养基，也称化学限定培养基 (chemically defined medium)2 2根据物理状态划分根据物理状态划分固体培养基固体培养基;半固体培养基半固体培养基;液体培养基液体培养基.三、三、培养基的类型及应用培养基的类型及应用 固体培养基：在液体培养基中加入1.5-2.0%的凝固剂制成的呈固体状态的培养基。常用于微生物的分离、纯化、计数等方面的研究。 半固体培养基：在液体培养基中加入0.2-0.7的琼脂构成的培
18、养基。常用来观察细菌运动的特征，以进行菌种鉴定和噬菌体效价滴定等方面的实验工作。 液体培养基：液体培养基不含任何凝固剂，它常用于大规模的工业生产以及在实验室进行微生物生理代谢等基本理论的研究工作。 科研与生产中常用的凝固剂有琼脂、明胶和硅胶三种，除在液体培养基中加入凝固剂之外，一些由天然的固体基质制成的培养基也属于固体培养基 琼脂琼脂：属于凝固剂，其化学成份主要是：属于凝固剂，其化学成份主要是酸性多糖。其特点是当温度达到酸性多糖。其特点是当温度达到9898以以上可融化于水，上可融化于水，4545以下则凝固。以下则凝固。琼脂、明胶和硅胶琼脂、明胶和硅胶三种凝固剂性质比较三种凝固剂性质比较：明胶和
19、硅胶明胶和硅胶：不可以重复使用，一旦凝固：不可以重复使用，一旦凝固将不会再熔化。将不会再熔化。 各种培养基各种培养基固体基斜面半固体2 2根据物理状态划分根据物理状态划分液体三、三、培养基的类型及应用培养基的类型及应用3 3按用途划分按用途划分厌氧培养基厌氧培养基增菌培养基增菌培养基选择培养基选择培养基鉴别培养基鉴别培养基（参见P86）3按用途划分按用途划分1）基础培养基）基础培养基(minimum medium) 在一定条件下含有某种微生物生长繁殖所需在一定条件下含有某种微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基的基本营养物质的培养基,也称为基本培养基也称为基本培养基.2）完全培养基）完全培养
20、基(complete medium) 在一定条件下含有某种微生物生长繁殖所需在一定条件下含有某种微生物生长繁殖所需的所有营养物质的培养基的所有营养物质的培养基.牛肉膏蛋白胨培养基就是枯草芽孢杆菌等牛肉膏蛋白胨培养基就是枯草芽孢杆菌等的完全培养基的完全培养基三、三、培养基的类型及应用培养基的类型及应用3 3按用途划分按用途划分3)3)加富培养基和富集培养基加富培养基和富集培养基(enrichment medium) 在普通培养基在普通培养基( (如肉汤蛋白胨培养基如肉汤蛋白胨培养基) )中加入某些特殊营养物质制成的一类营养中加入某些特殊营养物质制成的一类营养丰富的培养基丰富的培养基. . 这些特
21、殊营养物质包括这些特殊营养物质包括血液、血清、血液、血清、酵母浸膏动植物组织液酵母浸膏动植物组织液等。等。 用来培养营养要求比较苛刻的异养型用来培养营养要求比较苛刻的异养型微生物微生物, ,如培养百日咳博德氏菌如培养百日咳博德氏菌(Bordetella pertussis)需要含有血液的需要含有血液的加富培养基。加富培养基。根据待分离微生物的特点设计的培养基根据待分离微生物的特点设计的培养基,用用于从环境中富集和分离某种微生物于从环境中富集和分离某种微生物.(目的微目的微生物在这种培养基中较其他微生物生长速生物在这种培养基中较其他微生物生长速度快度快,并逐渐富集而占优势并逐渐富集而占优势,从而
22、容易达到分从而容易达到分离该种微生物的目的离该种微生物的目的.)三、三、培养基的类型及应用培养基的类型及应用3按用途划分按用途划分4）鉴别培养基）鉴别培养基（differential medium） 用于鉴别不同类型微生物的培养基用于鉴别不同类型微生物的培养基 特定的化学反应特定的化学反应,产生明显的特征性变化，产生明显的特征性变化， 根据这种特征性变化根据这种特征性变化,可将该种微生物与可将该种微生物与其他微生物区分开来。其他微生物区分开来。三、三、培养基的类型及应用培养基的类型及应用4 4）鉴别培养基）鉴别培养基（differential medium） 伊红和美蓝二种苯胺染料可抑制伊红和
23、美蓝二种苯胺染料可抑制G+细菌细菌和和一些难培养的一些难培养的G-细菌细菌.在低酸度时在低酸度时,这二种染这二种染料结合形成沉淀，起着产酸指示剂的作用料结合形成沉淀，起着产酸指示剂的作用.试试样中的多种肠道菌会在样中的多种肠道菌会在EMB培养基上产生相培养基上产生相互易区分的特征菌落互易区分的特征菌落, ,因而易于辨。例如大肠因而易于辨。例如大肠杆菌强烈分解乳糖而产生大量的混合酸杆菌强烈分解乳糖而产生大量的混合酸, ,菌体菌体呈酸性呈酸性, ,菌落被染成深紫色，从菌落表面的反菌落被染成深紫色，从菌落表面的反射光中还可看到绿色金属闪光。射光中还可看到绿色金属闪光。三、三、培养基的类型及应用培养基
24、的类型及应用5）选择培养基）选择培养基(selective medium) 用于将某种或某类微生物从混杂的微生用于将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基物群体中分离出来的培养基. 根据不同种类微生物的特殊营养需求或根据不同种类微生物的特殊营养需求或对某种化学物质的敏感性不同对某种化学物质的敏感性不同,在培养基中在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质加入相应的特殊营养物质或化学物质,抑制抑制不需要的微生物的生长不需要的微生物的生长,有利于所需微生物有利于所需微生物的生长。的生长。3按用途划分按用途划分三、三、培养基的类型及应用培养基的类型及应用5 5）选择）选择培养基培养基(
25、selective medium)5 5）选择培养基）选择培养基(selective medium)四、四、培养基的应用培养基的应用传染病病原的诊断和鉴定传染病病原的诊断和鉴定细菌学研究细菌学研究生物制品的制备生物制品的制备菌种的保存菌种的保存制造各种产品制造各种产品基因工程中的应用基因工程中的应用五、五、微生物的分离纯化和培养方法（补）微生物的分离纯化和培养方法（补）1 1、倒平板技术、倒平板技术2 2、微生物的接种技术、微生物的接种技术2 2、微生物的接种技术、微生物的接种技术2 2、微生物的接种技术、微生物的接种技术2 2、微生物的接种技术、微生物的接种技术3 3、微生物分离纯化与培养技
26、术（以细菌为例）、微生物分离纯化与培养技术（以细菌为例）（一）分离培养法l微生物分离纯化目的是获得纯种（单个菌落）。l分离培养成纯种菌的方法有平板划线法、倾注平板法和动物接种分离法等，其中以划线法最为常用。接种环灭菌冷却接种环沾取菌液接种1 1平行划线法：平行划线法：l标记l涂基线l划线l划线完毕，将琼脂平板培养基复盖皿盖，并在培养皿底玻璃上，用笔蜡注明接种菌名、接种者姓名及班级、日期等，将培养皿倒置放在孵育箱培养，以避免培养过程中凝结水自皿盖滴下。平行划线法的示意图平行划线法的示意图2 2分区划线法：分区划线法：基本步骤与平行划线法相同，不同之处是在每次划线前要烧灼接种环，以杀灭环上留剩的菌液。 三段分区法 四段分区法 五段分区法五段分区法培养后情况培养后情况培养后群体形态培养后群体形态（二）细菌纯种接种法（二）细菌纯种接种法1.斜面培养基接种法2.液体培养基接种法3.半固体培养基穿刺接种法 取菌的方法取菌的方法斜面接种法及接种后菌落生长示意图斜面接种法及接种后菌落生长示意图接种后菌落生长示意图菌苔(lawn)液体培养基接种法、半液体培养基接种法、半/ /固体琼脂培养基种接法固体琼脂培养基种接法液体培养时的群体形态：2.液体培养基接种法穿刺培养的生长特征3.3.半固体培养基穿刺接种法半固体培养基穿刺接种法作业：作业： P79(8.10) P79(8.10)
