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1、第三部分第三部分遗传信息的传递遗传信息的传递第十四章第十四章DNA的生物合成的生物合成第十五章第十五章DNA损伤和修复损伤和修复第十六章第十六章RNA的生物合成的生物合成第十七章第十七章蛋白质的生物合成蛋白质的生物合成第十八章第十八章基因表达调控基因表达调控第十九章第十九章细胞信号转导细胞信号转导基因基因(gene)为生物活性产物编码的为生物活性产物编码的DNA功能片段功能片段.蛋白质蛋白质或各种或各种RNA一个典型的真核基因（断裂基因）：一个典型的真核基因（断裂基因）：编码序列编码序列：外显子：外显子(exon)插入外显子之间的插入外显子之间的非编码序列非编码序列：内合子：内合子(intro
2、n)5-端和端和3-端端非翻译区非翻译区(UTR)调控序列调控序列(可位于上述三种序列中可位于上述三种序列中)基因组基因组(genome)是指一种生物体中的整套遗传信息，一般为一个是指一种生物体中的整套遗传信息，一般为一个受精卵或一个体细胞的细胞核中所有受精卵或一个体细胞的细胞核中所有DNA分子的分子的总和。总和。特定生物体的整套特定生物体的整套(单倍体单倍体)遗传物质的总和遗传物质的总和基因组的大小用全部基因组的大小用全部DNA的碱基对总数表示的碱基对总数表示人的基因组的大小：人的基因组的大小：3109bpJamesWatson(right)andFrancisCrickDNA双螺旋结构的发
3、现双螺旋结构的发现（1953）遗传信息传递的中心法则遗传信息传递的中心法则中心法则的补充（中心法则的补充（1970）DBaltimoreCentral Dogma of genetic information transferDNARNA蛋白质蛋白质复制复制转录转录反转录反转录翻译翻译复制复制转录转录翻译翻译DNA RNA 蛋白质蛋白质描述遗传信息流动的方向描述遗传信息流动的方向1958年，年，F.crick DNA DNADNADNA复制复制转录转录翻译翻译遗传信息遗传信息遗传信息遗传信息遗传信息遗传信息反转录反转录遗传信息遗传信息RNARNA复制复制遗传信息遗传信息 DNA mRNA mR
4、NA 蛋白质蛋白质 RNA DNA RNA RNA DNA的的生物合成生物合成RNA的的生物合成生物合成蛋白质的蛋白质的生物合成生物合成 第十四章第十四章 DNADNA生物合成生物合成生命的起点nDNA的复制的复制n逆转录合成逆转录合成nDNA的修复合成的修复合成生物体内生物体内DNA的合成包括三个方面的合成包括三个方面第一节第一节 复制的基本特征复制的基本特征Section 1 Basic Rules of DNA replicationDNA复制复制( DNA replication)：在细胞分裂过程：在细胞分裂过程中中,以亲代以亲代DNA为模板合成子代为模板合成子代DNA分子的过程分子的
5、过程复制复制 亲代亲代DNADNA 子代子代DNADNA子链继承母链的方式：子链继承母链的方式：三种可能三种可能DNA复制的方式？复制的方式？全保留半保留半保留混合式亲代DNA子代DNA复制“It has not escaped our notice that the specific pairing we have postulated immediately suggests a possible copying mechanism for the genetic material. The structure itself suggested that each strand could
6、 separate and act as a template for a new strand, therefore doubling the amount of DNA, yet keeping the genetic information, in the form of the original sequence, intact. “Molecular structure of Nucleic Acids” Watson&Crick， 1953.4.25, NatureMeselson(左)与Stalh在42年以后在最初他们相遇的一棵树下重逢时的合影Caltech（加州理工学院） Ma
7、tthew MesselsonFranklin Stahl1、半保留复制的实验依据、半保留复制的实验依据(1958年年) the most beautiful experiment in biology首先在首先在1515NHNH4 4ClCl培养基中培养培养基中培养然后转到然后转到1414NHNH4 4ClCl培养基中培养培养基中培养只在只在1515NHNH4 4ClCl中培养中培养只在只在1414NHNH4 4ClCl中中培养培养1414N N对照系统对照系统对照系统对照系统1515N N对照系统对照系统对照系统对照系统第一代第一代第二代第二代提取提取DNA，进行密度梯度超离心，进行密度梯
8、度超离心E.coli 细胞细胞（a）密度梯度离心的）密度梯度离心的DNA带带（b）对应于左侧）对应于左侧DNA带的解释带的解释Meselson-stahl实验实验（一）、（一）、DNADNA复制的方式复制的方式半保留复制半保留复制semi-conservative replicationDNA复复制制时时，母母链链DNA解解开开为为两两股股单单链链，各各自自作作为为模模板板按按碱碱基基配配对对规规律律，合合成成与与模模板板互互补补的的子子链链。子子代代DNA，一一股股链链从从亲亲代代完完整整地地接接受受过过来来，另另一一股股链链则则完完全全重重新新合合成成。两两个个子子代代DNA都都和和亲亲代
9、代DNA碱碱基基序序列列一一致致。这这种种复复制制方方式式称称为为半半保保留留复制复制(semi-conservativereplication)。2 2、半保留复制的意义：、半保留复制的意义：ATCTGGCTAGACCGATCTGGCATCTGGCTAGACCGTAGACCG遗传的保守性，是物遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但种稳定性的分子基础，但不是绝对的不是绝对的。n子代子代DNADNA与亲代与亲代DNADNA的的碱基序列一致碱基序列一致，子代保，子代保留了亲代留了亲代DNADNA的全部遗的全部遗传信息。传信息。体现了遗传的体现了遗传的保守性保守性二、复制的方向：双向复制二、复制的
10、方向：双向复制 双向复制双向复制Bidirectional replication 单向复制单向复制(Col E1质粒质粒)unidirectional replication多数生物复制时，多数生物复制时，DNA从从起始点起始点(origin)向两个向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为为双向复制双向复制。 复制眼复制眼（replication eye）（复制过程的顺序性）（复制过程的顺序性）VisualizationofbidirectionalDNAreplicationLabelingwithtritiumshowsthatboth
11、strandsarereplicatedatthesametime(redandbluelines)(JohnCairns)Only One Replication Origin in E. coli53oriorioriori535533553复制子复制子3真核生物每个染色体有多个真核生物每个染色体有多个ori酵母酵母17号染色体含号染色体含400个个三、半不连续复制三、半不连续复制(领头链）领头链）- continuous （滞后链）滞后链）. . discontinuous复制叉引导的复制方向复制叉引导的复制方向亲代亲代DNA双链双链前导链前导链随从链随从链冈崎片段冈崎片段RNA引物引物
12、n顺着解链方向延长的子链，复制连续进行，称为领头链（领头链（前导链）前导链）延长方向与解链方向相反的链不连续合成，称随从链（随从链（滞后链）滞后链）n1968年，日本科学家冈崎观察到在DNA复制中存在不连续的片段，把这种不连续复制的不连续复制的DNADNA片段称作冈崎片段片段称作冈崎片段（Okazakifragment）小结小结1、半保留复制半保留复制(semi-conservative replication) ： DNA复制时，母链复制时，母链DNA解开为两股单链，解开为两股单链，各自作为模板按碱基配对规律，合成与模各自作为模板按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代板互补的子链。子代D
13、NA，一股链从亲代，一股链从亲代完整地接受过来，另一股链则完全重新合完整地接受过来，另一股链则完全重新合成。成。,复制子复制子(replicon)(replicon)：能够独立完成复制的功能：能够独立完成复制的功能单位。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为单位。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个一个复制子复制子(replicon)(replicon) ,原核生物为单复制子复制，真核生物为多复制原核生物为单复制子复制，真核生物为多复制子复制子复制多数生物的多数生物的DNA复制为定点复制为定点双向复制双向复制2、复制原点与方向、复制原点与方向第二节第二节 DNA复制的酶学和拓扑学复制的酶学和
14、拓扑学原料原料(substrate)：dATP、dTTP、dCTP、dGTPDNA模板模板(template)DNA聚合酶聚合酶(polymerase)3-OH引物引物(primer)其他酶及蛋白因子其他酶及蛋白因子Mg2+参与参与DNA复制的物质（反应体系）复制的物质（反应体系）DNADNA链合成的条件链合成的条件链合成的条件链合成的条件: :一、单链模板一、单链模板真核生物真核生物DNA结构特点结构特点DNA分子大，分子大，108bpDNA与组蛋白结合，以核小体形式存在与组蛋白结合，以核小体形式存在-DNA解旋、解链的酶解旋、解链的酶拓扑异构酶拓扑异构酶（topoisomerase,Top
15、o）解链酶解链酶（DNAhelicase）DNA单链结合蛋白单链结合蛋白（singlestrandbindingprotein,SSB）1、 拓扑异构酶拓扑异构酶（topoisomerase, Topo）定义：定义：能催化能催化DNA拓扑异构体互变拓扑异构体互变的一类酶称为的一类酶称为拓扑异构酶拓扑异构酶A B CDNA分子拓扑异构体分子拓扑异构体分类：分类： 拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶功能：功能：拓扑异构酶拓扑异构酶既能水解、又能连既能水解、又能连接磷酸二酯键接磷酸二酯键解链过程中正超螺旋的形成解链过程中正超螺旋的形成（1 1）拓扑异构酶）拓扑异构酶I（Topo I）切开双链环
16、状切开双链环状DNA的一的一条链，松弛超螺旋后再条链，松弛超螺旋后再连接连接DNA，不需，不需ATP。大肠杆菌拓朴异构酶大肠杆菌拓朴异构酶的结构的结构拓扑异构酶拓扑异构酶（2 2）拓扑异构酶）拓扑异构酶（Topo）松弛和引入超螺旋，需要松弛和引入超螺旋，需要ATP打结与解结打结与解结环连与解环连环连与解环连CutandpassstrandthroughgapResealgapSeparatestrandslength-wiseTwoturns拓扑异构酶拓扑异构酶(又称旋转酶又称旋转酶gyrase) 2、DNA解链酶解链酶（DNA helicase）功能：功能：利用利用ATPATP作用于氢键，作
17、用于氢键， 解开解开DNA双链双链特点：特点：解链沿复制叉行进方向解链沿复制叉行进方向种类：种类：E.coli解链酶解链酶 DnaA,B,CDnaA,B,C E.coli RepRep蛋白蛋白533535Helicases 3、单链结合蛋白单链结合蛋白（single strand binding protein, SSB），又称），又称DNA结合蛋白结合蛋白（DNA binding protein，DBP）功能：功能：在复制中维持模板处于单链状态在复制中维持模板处于单链状态 保护复制新生单链的完整性保护复制新生单链的完整性二、二、DNA聚合酶聚合酶(DNA polymerase)依赖依赖DNA
18、的的DNA聚合酶聚合酶（DNA-dependentDNApolymerase,DDDP）作用作用：以亲代以亲代DNADNA的一条链为模板，催化四种的一条链为模板，催化四种dNTPdNTP与与模板碱基互补配对，合成新的模板碱基互补配对，合成新的DNADNA链。链。 DNA聚合酶聚合酶活性：活性：1. 53 的聚合活性的聚合活性2. 35 外切酶活性外切酶活性3. 53 外切酶活性外切酶活性1. 53 的聚合活的聚合活性性 5 5 3 35 5dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH33 3DNA-poldNTP DNA pol PrimerDNA template作用
19、：作用：形成形成3,5-磷酸二酯键，使磷酸二酯键，使DNA链沿链沿53方向方向延伸延伸nDNA聚合酶催化的反应聚合酶催化的反应(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+PPi 生长点：生长点：3-OH2.35 外切酶活外切酶活性性5AGCTTCAGGAT3|3TCGAAGTCCTAGCGAC5?A C作用：作用： 辨认并水解辨认并水解3 3末端错误碱基，具有末端错误碱基，具有校对校对功能功能 保证保证DNADNA复制的准确性复制的准确性作用：作用：去除去除RNA引物；引物；修正错误碱基，在修正错误碱基，在DNA损伤修复中起作用损伤修复中起作用3.53 外切酶活性外切酶活性5GCUUCAGGA
20、TCGC3| | |3TCGAAGTCCTAGCGAC5PrimerA|1、单链、单链DNA作为模板；作为模板；2、需要寡核苷酸（、需要寡核苷酸（DNA或或RNA）为引物；）为引物；3、以四种、以四种dNTP为原料；为原料；4、延模板链、延模板链35方向复制，方向复制，DNA链合成方向是链合成方向是535.有的有的DNA聚合酶有校对活性。聚合酶有校对活性。DDDP特点：？特点：？DNADNA聚合酶种类聚合酶种类DNA-pol DNA-pol DNA-pol 原核生物原核生物真核生物真核生物DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA聚合酶聚合酶(DNA
21、pol)1958年年由由ArthurKornberg首首先先发发现现的的DNA聚聚合合酶，又称酶，又称Kornberg酶。酶。单一肽链单一肽链,109kD，二级结构二级结构:-螺旋螺旋催化合成短片段催化合成短片段,20bpDNA-pol的主要功能：的主要功能：1.去除引物，填补引物消去除引物，填补引物消除后的空隙；除后的空隙；2.对复制中的错误进行校对复制中的错误进行校读，填补修复中出现的读，填补修复中出现的空隙。空隙。木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶 Klenow片段是实验室合成片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究的常用工具酶进行分子生物学研究的常用工具酶 Klenow片段片段 1959Nobel
22、Prizewinnerinphysiologyormedicine.(jointlywithSeveroOchoa)fortheirdiscoveryofthemechanismsinthebiologicalsynthesisofribonucleicacidanddeoxyribonucleicacid.ArthurKornberg19182007DNA聚合酶聚合酶1970年发现年发现活性只有活性只有DNA-pol的的5%此酶缺陷的大肠杆菌突变株的此酶缺陷的大肠杆菌突变株的DNA复制复制都正常。可能在都正常。可能在DNA的的损伤修复损伤修复中该酶中该酶起到一定的作用。起到一定的作用。DNA
23、聚合酶聚合酶III全酶全酶（polymeraseIIIholoenzyme）功能功能: 是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶 DNA-pol (250kD): 5: 5 3 3聚合聚合酶活活性性: 3: 355外切外切酶活活性性：装配必需：装配必需10105 5/min/min“在老孔伯格获奖十年之后，人们才知道，他所发现的在老孔伯格获奖十年之后，人们才知道，他所发现的DNADNA聚合酶并非细菌真正用于复制聚合酶并非细菌真正用于复制DNADNA的酶，在细胞内执行的酶，在细胞内执行这个任务的是另一种新发现的酶这个任务的是另一种新发现的酶DNADNA聚合酶聚
24、合酶IIIIII。老孔。老孔伯格的酶（被命名为伯格的酶（被命名为DNADNA聚合酶聚合酶I I）只是在）只是在DNADNA复制中起修复制中起修补作用（不过，这种酶后来在分子生物学研究和遗传工程补作用（不过，这种酶后来在分子生物学研究和遗传工程中发挥了巨大的作用）。值得老孔伯格欣慰的是，新的酶中发挥了巨大的作用）。值得老孔伯格欣慰的是，新的酶是他的二儿子托马斯是他的二儿子托马斯孔伯格在哥伦比亚大学读书时发现孔伯格在哥伦比亚大学读书时发现的。托马斯现在是加州大学旧金山分校的生物化学教授。的。托马斯现在是加州大学旧金山分校的生物化学教授。 ”这一家人共发现了这一家人共发现了30多种酶。多种酶。 老孔
25、伯格老孔伯格1975年写了一本年写了一本书书 “For the love of enzymes” （酶的情人）（酶的情人）Roger Kornberg won 2006 Nobel Prize in Chemistry for his work in genetic research. Pol I Pol II Pol III酶活性酶活性 5 3聚合作用聚合作用 + + +3 5外切酶活性外切酶活性 + + +5 3外切酶活性外切酶活性 + - -构成构成（亚基数）（亚基数） 单体单体 单体单体 多亚基多亚基分子大小分子大小（x 103） 109 90 900体外链延长速度体外链延长速度（核苷
26、酸核苷酸/ /分分） 600 30 9000分子数分子数/细胞细胞 400 10-20功能功能 修复合成修复合成 切除引物切除引物 不详不详 复制复制 填补空缺填补空缺原核生物原核生物DNA聚合酶聚合酶真核生物真核生物DNA聚合酶聚合酶填补引物填补引物空隙，切空隙，切除修复，除修复，重组重组延长子延长子链的主链的主要酶，要酶，解螺旋解螺旋酶活性酶活性线粒体线粒体DNA复复制制低保低保真度真度的复的复制制起始引起始引发，引发，引物酶活物酶活性性+-3 5 核酸外切核酸外切酶活性酶活性高高高高高高？中中5 3 聚合活性聚合活性25.512.514.04.016.5分子量（分子量（kD）DNA-po
27、l填补引物填补引物空隙，切空隙，切除修复，除修复，重组重组延长子延长子链的主链的主要酶，要酶，解螺旋解螺旋酶活性酶活性线粒体线粒体DNA复复制制低保低保真度真度的复的复制制起始引起始引发，引发，引物酶活物酶活性性功能功能+-3 5 核酸外切核酸外切酶活性酶活性高高高高高高？中中5 3 聚合活性聚合活性25.512.514.04.016.5分子量（分子量（kD）DNA-pol1.遵守严格的碱基配对规律；遵守严格的碱基配对规律；2.聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；3.复制出错时复制出错时DNA-pol的及时校读功能。的及时校读功能。DNA复制的保真性至少要依
28、赖三种机制复制的保真性至少要依赖三种机制 三、三、RNA引物引物减少突变，提高减少突变，提高DNADNA复制的真实性复制的真实性DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶RNARNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶不能催化两个游离的不能催化两个游离的不能催化两个游离的不能催化两个游离的dNTPdNTP在在在在DNADNA模板上聚合模板上聚合模板上聚合模板上聚合 能催化两个游离的能催化两个游离的能催化两个游离的能催化两个游离的NTPNTP在在在在DNADNA模板上聚合模板上聚合模板上聚合模板上聚合 需要具需要具需要具需要具3-OH3-OH的引物的引物的引物的引物 可提供可提供可提供可提供3-OH3-OH引物最
29、后要被引物最后要被引物最后要被引物最后要被DNADNA聚合聚合聚合聚合酶酶酶酶除去，缺口由该酶补除去，缺口由该酶补除去，缺口由该酶补除去，缺口由该酶补满，再由连接酶连接满，再由连接酶连接满，再由连接酶连接满，再由连接酶连接参与引物合成的酶参与引物合成的酶-引物酶：引物酶：以复制起始部位的以复制起始部位的DNA链为模板，按照碱基互补链为模板，按照碱基互补配对的原则合成引物配对的原则合成引物RNA。特殊的特殊的RNA聚合酶聚合酶引物长度：引物长度：1010至几十个核苷酸至几十个核苷酸3 5 3 5 引物引物3HO5引物引物酶酶引发体（引发体（primosomeprimosome）参与终止的酶参与终
30、止的酶-DNA连接酶：连接酶：连连接接DNA链链3 -OH末末端端和和相相邻邻DNA链链5 -P末末端端，使使二二者者生生成成磷磷酸酸二二酯酯键键，从从而而把把两两段段相相邻的邻的DNA链连接成一条完整的链。链连接成一条完整的链。53535353在复制中接合缺口在复制中接合缺口在在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。基因工程的重要工具酶之一。基因工程的重要工具酶之一。1、底物：、底物：dNTP2、模板：、模板：解开成单链的解开成单链的DNA母链母链(ssDNA)3、 DNA聚合酶：对称单链模板、聚合酶：对称单链模板、RNA引物、引物、5端端3端聚合端聚
31、合4、 RNA引物：引物：提供提供3 -OH末端末端5、其他的酶和蛋白质因子、其他的酶和蛋白质因子小结小结DNA复制的体系：复制的体系：l参与参与DNA复制的酶和蛋白质因子：复制的酶和蛋白质因子：解链（旋）酶：解开解链（旋）酶：解开DNA双螺旋双螺旋SSB：使：使DNA保持单链状态保持单链状态拓扑酶：引入负超螺旋，解缠绕、解结拓扑酶：引入负超螺旋，解缠绕、解结引物酶：合成引物酶：合成RNA引物引物DNA聚合酶：合成子链聚合酶：合成子链DNA连接酶：将连接酶：将DNA片段连接成完整链片段连接成完整链原核生物原核生物DNA聚合酶聚合酶:I(Klenow片段片段),II,III真核生物真核生物DNA
32、聚合酶：聚合酶：1.遵守严格的碱基配对规律；遵守严格的碱基配对规律；2.聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；3.复制出错时复制出错时DNA-pol的及时校读功能。的及时校读功能。DNA复制的保真性至少要依赖三种机制复制的保真性至少要依赖三种机制 复制的基本过程复制的基本过程1、模板准备：、模板准备：DNA超螺旋结构松弛、超螺旋结构松弛、双螺旋结构解链双螺旋结构解链2、 复制的引发复制的引发（Priming ）：）：引物合成引物合成3、多聚核苷酸链、多聚核苷酸链延长延长（Elongation）4、复制的终止复制的终止（Termination）为为DNA聚合酶聚
33、合酶准备条件，启准备条件，启动复制动复制第三节第三节 原核生物原核生物DNA复制复制DNADNA复制起始点复制起始点(origin of replication)E.coli复制起始点复制起始点oriC 串联重复序列串联重复序列 反向重复序列反向重复序列原核生物原核生物DNA复制的起始点复制的起始点 ori CE. coli “ori C” region (245bp)13-Base pairs repeat9-Base pairs repeatori 245bpE.coli原核生物只有原核生物只有1个个ori，约约200 bp的重复序列。的重复序列。复制起始区的结构特点复制起始区的结构特点（
34、1）富含）富含A-T，有利解开双链，起始复制；，有利解开双链，起始复制；（2）含有多个重复序列）含有多个重复序列GATC较保守较保守,GATC中的中的“A”常甲基化常甲基化;（3）具有）具有4个反向重复顺序，作为蛋白结合位点；个反向重复顺序，作为蛋白结合位点；（一）复制的起始（一）复制的起始需要解决两个问题：需要解决两个问题：1.DNA解开成单链，提供模板。解开成单链，提供模板。2.合成引物，提供合成引物，提供3 -OH末端。末端。拓扑异构酶拓扑异构酶解链酶解链酶 形成形成复制叉复制叉 单链结合蛋白（单链结合蛋白（SSBSSB）引物酶：合成引物酶：合成RNARNA引物引物参与起始的酶参与起始的
35、酶：复制叉：复复制叉：复制时双链制时双链DNADNA解链形成的解链形成的“Y Y”形结构。形结构。3 5 3 5 引物是由引物酶催化合成的短链引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。分子。 引物引物3HO5引物引物酶酶引发引发3 5 3 5 Primer3OH5primase解旋酶解旋酶、拓扑异构酶拓扑异构酶、 引物酶引物酶 和引物和引物 以及单链结合蛋白形成以及单链结合蛋白形成的复合体的复合体称为称为引发体引发体(primosome)单链结合蛋白单链结合蛋白解链酶解链酶DNA拓扑异构酶拓扑异构酶DNADNA双链复制起始点双链复制起始点dnaAdnaAdnaB/dnaCdnaB/dnaCDNA
36、DNA双链解开成单链双链解开成单链DNADNASSBSSB引物酶引物酶引物酶引物酶RNARNA引物引物/3/3-OH-OHDNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶dNTPdNTP和和3 3-OH-OH形成形成3 35 5磷酸二酯键磷酸二酯键拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶（二）复制的延长（二）复制的延长复复制制的的延延长长指指在在DNA-pol催催化化下下，dNTP以以dNMP的的方方式式逐逐个个加加入入引引物物或或延延长长中中的的子子链链上上，其化学本质是其化学本质是磷酸二酯键磷酸二酯键的不断生成。的不断生成。 1）模板）模板:亲代亲代DNA的两条链均可作为模板。的两条链均可
37、作为模板。2）原料）原料:dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）。）。3）合成方向（复制叉的方向）：）合成方向（复制叉的方向）：53。4）合成特点：）合成特点：半不连续合成半不连续合成领头链的合成领头链的合成随从链的合成随从链的合成1.在在DNA聚合酶聚合酶的作用下，的作用下，2.前导链前导链合成合成1000-2000个核苷酸后，个核苷酸后，3.随从链随从链开始合成，岗崎片段的长度开始合成，岗崎片段的长度为为1000-2000bp（大肠杆菌（大肠杆菌),100-200bp(真核）真核）4.Pol为不对称二聚体，为不对称二聚体，一个作用于前导链，一个作用于前导链，另一个作用于随从链另
38、一个作用于随从链。DNA pol DNA pol 以不对称二聚体以不对称二聚体形式协同催化前导链和随从链形式协同催化前导链和随从链的合成的合成1）切除）切除RNA引物引物2）填补缺口）填补缺口三、三、DNA复制的终止复制的终止原核生物基因是环状原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制，双向复制的复制片段在复制的终止区片段在复制的终止区(ter)处汇合处汇合teroriter5 5 5 OHP5 DNA-poldNTP5 5 PATPADP+Pi5 5 DNA连接酶连接酶随从链上不连续性片段的连接随从链上不连续性片段的连接RNA酶酶polSSB35DnaBDnaCDnaG5pol前导链前导链5
39、5 5 5 冈崎片段冈崎片段（1000-2000nt）后随链后随链DNA连接酶连接酶第四节第四节 真核生物真核生物DNADNA复制复制哺乳动物的细胞周期哺乳动物的细胞周期DNA合成期合成期DNA复制只发生在复制只发生在S期期每个细胞周期只进行一次每个细胞周期只进行一次DNA复制复制特点：特点：细细胞胞能能否否分分裂裂，决决定定于于进进入入S期期及及M期期这这两两个个关关键键点点。G1S及及G2M的的调调节节，与与蛋蛋白白激激酶酶活活性有关。性有关。复制可分为起始、延伸和终止三个阶段复制可分为起始、延伸和终止三个阶段多多个个复复制制起起始始点点形形成成多多个个复复制制子子，复复制制起起始始点点往
40、往往富含往富含AT碱基碱基复复制制中中多多种种蛋蛋白白的的作作用用类类似似原原核核DNA复复制制所所需需蛋蛋白，但机制更为复杂白，但机制更为复杂复复制制过过程程涉涉及及核核小小体体的的解解体体和和重重新新生生成成，后后续续链链中中冈冈崎崎片片段段的的长长度度就就是是一一个个核核小小体体所所含含的的DNA片片段长度段长度 真核生物真核生物DNADNA复制概况复制概况生核生物生核生物DNA复制所需多种蛋白的功能复制所需多种蛋白的功能与原核类似与原核类似一、DNA复制的起始起点辨认复合物（ORC）辨认复制的起始点序列（此序列含有由11个核苷酸组成的保守序列：A（T）TTTATA（G）TTTA（T），
41、 ORC具有弱解旋酶活性的小染色体维系蛋白(MCM)再与之结合，产生复制叉，形成复制泡，单链DNA结合蛋白（复制蛋白A）与单链DNA结合，解旋酶再结合到复制泡上。与DNA-pol结合的引发酶在起始位点合成约10个核苷酸 的RNA引物，然后由DNA-pol再形成1530个核苷酸的DNA片段。二、DNA链的延伸DNA聚合酶/引发酶产生RNA-DNA后（大约40个核苷酸）， RFC紧密结合到引物-模板接合处，DNA聚合酶与模板DNA脱离。RFC负责组装PCNA滑动夹子，然后DNA聚合酶结合到PCNA组成的滑动夹子上，完成冈崎片段的延伸，最终长度达130-200个核苷酸。 前导链引物合成后由DNA聚合
42、酶连续延伸DNA 链，长度可达5-10kb。增殖细胞核抗原（PCNA ） DNA聚合酶的辅助蛋白质 PCNA的三个亚基绕着DNA形成一个滑动夹子,DNA聚合酶附着于滑动夹子上沿DNA向前移动，进行复制。复制因子C（RFC） 一种装载因子，它帮助PCNA环状滑动夹子的装配。此因子作为DNA聚合酶和之间的连系物或纽带，有助于前导链和后随链的同时合成。核酸酶H（RNaseH）和盖内切核酸酶（FEN1） 参与去除RNA引物的作用。 RNaseH降解RNA引物，留下一个核苷酸连在冈崎片段的末端，由FEN1完成去除最后一个核苷酸。三、DNA链的终止 pol355复制因子复制因子C增殖细胞核抗原增殖细胞核抗
43、原前导链前导链53冈崎片段冈崎片段（130-200nt）53RNaseH和侧翼核酸和侧翼核酸内切酶（内切酶（FEN1）polDNA连接酶连接酶后随链后随链A model for nucleosome replication 真核染色体真核染色体DNA呈线状，复制在末端停止呈线状，复制在末端停止 DNA子链末端子链末端RNA引物去除后留下的空隙引物去除后留下的空隙由由端粒酶端粒酶(telomerase)参与填补复制参与填补复制真核生物的末端复制真核生物的末端复制5 3 3 5 5 3 3 5 +5 3 3 3 3 5 5 端粒端粒(telomere)又称又称端区：端区：指真核生物染色体线指真核生
44、物染色体线性性DNA分子末端的结构，通常膨大成粒状分子末端的结构，通常膨大成粒状从希腊字的末端“telos”和部分“meros”创造了一个全新的单词：端粒 telomeretelomere 端粒帽端粒帽 染色体 端粒帽端粒帽“端粒之于染色体，好像鞋带两头儿端粒之于染色体，好像鞋带两头儿的小塑料套和一根美丽鞋带的关系。的小塑料套和一根美丽鞋带的关系。如果没有小塑料套，由几股绳编起来如果没有小塑料套，由几股绳编起来的鞋带儿就要散架（下图）；同理，的鞋带儿就要散架（下图）；同理，如果没有端粒，你的染色体就劈叉儿、如果没有端粒，你的染色体就劈叉儿、磨秃。你说这么重要的东西值不值一磨秃。你说这么重要的东
45、西值不值一个诺贝尔奖？个诺贝尔奖？”-摘自摘自 “端粒，端粒，好好看住别丢了！好好看住别丢了！”（http:/ FISH（荧光原位杂交）技术荧光原位杂交）技术显示的人染色体端粒显示的人染色体端粒结构特点结构特点由末端单链由末端单链DNA序列和蛋白质构成序列和蛋白质构成末端序列是多次重复富含末端序列是多次重复富含GT碱基的短序列碱基的短序列TTGGGGTTGGGGTTTTTTTTGGGGGGGGTTTTTTTTGGGGGGGG功能功能 维持染色体的稳定性维持染色体的稳定性 维持维持DNADNA复制的完整性复制的完整性人的人的DNA端粒含有端粒含有TTAGGG重复序列，长度重复序列，长度515kb
46、端粒可能因细胞分裂而变短，当缩短到一定程端粒可能因细胞分裂而变短，当缩短到一定程度时，细胞就会死亡度时，细胞就会死亡端粒破损会导致端粒破损会导致DNA脆弱、易变异，可能导致脆弱、易变异，可能导致一些与衰老有关的疾病，如动脉硬化和某些癌症一些与衰老有关的疾病，如动脉硬化和某些癌症端粒酶端粒酶(telomerase)：防止端粒缩短的酶：防止端粒缩短的酶组成组成端粒酶端粒酶RNA与端粒与端粒DNA互补。端粒酶是一种特互补。端粒酶是一种特殊的反转录酶。以端粒酶殊的反转录酶。以端粒酶RNA为模板催化端粒为模板催化端粒DNA重复序列延长。重复序列延长。端粒端粒DNA重复序列与端粒酶对基因组起双重保重复序列
47、与端粒酶对基因组起双重保护作用。护作用。端粒酶端粒酶RNA端粒酶协同蛋白端粒酶协同蛋白端粒酶端粒酶逆转录酶逆转录酶35dGTPTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGAACCCCAACCCCAACCCC335TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGAACCCCAACCCCAACCCC3dGTP结合:端粒DNA与端粒酶RNA互补结合聚合:以端粒酶RNA为模板,在端粒DNA3聚合延长四膜虫端粒增加机制3535TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGAACCCCAACCCCAACCCC335TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG
48、GGGTTGAACCCCAACCCCAACCCC3移位:端粒酶移动到3端,端粒DNA与端粒酶RNA重新结合继续进行聚合爬爬行行模模型型DNADNA聚合酶复制子链聚合酶复制子链进一步加工进一步加工G-G imperfect pairingDNA extensionDNA polymerase5 5 5 5 端粒消耗端粒维持细胞衰老细胞永生化染色体DNA端粒端粒在高等真核生物，端粒酶只在胚胎细胞中有在高等真核生物，端粒酶只在胚胎细胞中有活性，而活性，而成年组织细胞中没有活性或活性极成年组织细胞中没有活性或活性极低低。大约大约90%90%的肿瘤类型发现有端粒酶活性的肿瘤类型发现有端粒酶活性人端粒酶逆
49、转录酶催化亚基人端粒酶逆转录酶催化亚基( (human human telomerase reverse transcriptase, telomerase reverse transcriptase, hTERT)hTERT) 于于19971997年成功克隆年成功克隆端粒酶与细胞的永生性（端粒酶与细胞的永生性（immortalizationimmortalization）及肿瘤发生（及肿瘤发生（tumorogenesistumorogenesis）都密切相关。都密切相关。端粒与衰老端粒与衰老实验实验：在无端粒酶活性的成纤维细胞中表达：在无端粒酶活性的成纤维细胞中表达端粒酶时，端粒的缩短和细胞
50、的衰老都受端粒酶时，端粒的缩短和细胞的衰老都受到抑制。到抑制。结论结论：细胞的衰老是由端粒驱动的。：细胞的衰老是由端粒驱动的。 体外培养的细胞端粒的长度随细胞逐代相体外培养的细胞端粒的长度随细胞逐代相传而缩短，丢失到一定程度便失去对染色传而缩短，丢失到一定程度便失去对染色体的保护作用。细胞随之发生衰老和死亡。体的保护作用。细胞随之发生衰老和死亡。实验表明人体细胞通过监测失去的端粒的重复数实验表明人体细胞通过监测失去的端粒的重复数而计数细胞分裂次数，当端粒长度下降到而计数细胞分裂次数，当端粒长度下降到某一临界值某一临界值时，细胞终止分裂衰老、死亡时，细胞终止分裂衰老、死亡“多莉多莉”的衰老的衰老
51、 研究端粒丢失的速率，预测人类的寿命研究端粒丢失的速率，预测人类的寿命 XX XY why?XX XY why?研究推测端粒酶与肿瘤的关系研究推测端粒酶与肿瘤的关系可把端粒看成一面钟，端粒的长度是钟上的可把端粒看成一面钟，端粒的长度是钟上的刻度，记载了细胞分裂的次数，称为刻度，记载了细胞分裂的次数，称为“端端粒钟粒钟”，或有丝分裂钟，或有丝分裂钟 或或“生命的时钟生命的时钟”，可通过测定端粒的长度预测细胞的寿命。，可通过测定端粒的长度预测细胞的寿命。胚胎细胞和生殖细胞端粒的长度并不随细胞胚胎细胞和生殖细胞端粒的长度并不随细胞分裂次数的增加而缩短，具有无限的分裂分裂次数的增加而缩短，具有无限的分
52、裂能力，原因在于端粒酶的存在。能力，原因在于端粒酶的存在。端粒酶与肿瘤端粒酶与肿瘤人体内除了生殖细胞和少数一些体细胞如淋巴细人体内除了生殖细胞和少数一些体细胞如淋巴细胞等细胞外，绝大多数体细胞中无法检测到端粒胞等细胞外，绝大多数体细胞中无法检测到端粒酶的活性，而在多数肿瘤细胞中能检测到端粒酶酶的活性，而在多数肿瘤细胞中能检测到端粒酶的活性。的活性。肿瘤的端粒长度很短，其继续缩短导致染色体融肿瘤的端粒长度很短，其继续缩短导致染色体融合、细胞死亡，而端粒酶的激活可以维持端粒的合、细胞死亡，而端粒酶的激活可以维持端粒的长度，维持肿瘤的继续分裂、增殖。长度，维持肿瘤的继续分裂、增殖。端粒酶的表达可能是
53、肿瘤形成和发展的共同途径。端粒酶的表达可能是肿瘤形成和发展的共同途径。端粒酶与恶性肿瘤之间有相关性使之在肿端粒酶与恶性肿瘤之间有相关性使之在肿瘤的诊断和治疗上有望成为新的靶目标。瘤的诊断和治疗上有望成为新的靶目标。可以通过各种途径抑制端粒酶的活性有效可以通过各种途径抑制端粒酶的活性有效抑制大多数肿瘤的生长，而对正常细胞没抑制大多数肿瘤的生长，而对正常细胞没有影响。有影响。1、螺旋松弛与解链：拓扑异构酶（、螺旋松弛与解链：拓扑异构酶（Topo、）、）、解链酶（解螺旋酶）、单链结合蛋白（解链酶（解螺旋酶）、单链结合蛋白（SSB）起始方式：复制叉式复制，多数为起始方式：复制叉式复制，多数为定点双向定
54、点双向（双叉）复制（双叉）复制复制时复制时DNA双链打开，形成的双链打开，形成的“Y”字型结构称字型结构称为为“复制叉复制叉”原核生物一般只有原核生物一般只有1个复制原点（个复制原点（ori），属于单），属于单复制子复制；真核生物具有多个复制原点，属于复制子复制；真核生物具有多个复制原点，属于多复制子复制多复制子复制小结小结2、引发（、引发（RNA引物合成）：引物酶（引物合成）：引物酶（DnaG）及引发体（其它的及引发体（其它的Dna蛋白）蛋白）原核生物复制时的原核生物复制时的RNA引物较长，真核生物引物较长，真核生物的引物较短的引物较短3、链延长（形成磷酸二酯键）：、链延长（形成磷酸二酯键）
55、：DNA聚合酶聚合酶(原核原核)、DNA聚合酶聚合酶、（真核）（真核）半不连续复制半不连续复制：领头链、随从链：领头链、随从链冈崎片段（冈崎片段（Okazakifragment）：随从链中不连续合）：随从链中不连续合成的成的DNA片段。原核生物的冈崎片段较长，真核生物片段。原核生物的冈崎片段较长，真核生物的冈崎片段较短的冈崎片段较短新合成链的延长方向：新合成链的延长方向：5端端3端端碱基配对：双链反平行，碱基配对：双链反平行，AT,GC配对配对原核生物的链延长速度大于真核生物原核生物的链延长速度大于真核生物4、终止（水解引物、填补空缺、连接、终止（水解引物、填补空缺、连接DNA片段）：片段）：
56、DNA聚合酶聚合酶（原核）、连接酶（原核）、连接酶原核生物原核生物真核生物真核生物起始点起始点1个个多个多个引物引物长（几十）长（几十）短（十几）短（十几）冈崎片段冈崎片段长长(10002000nt)短短(100200nt)链延长速度链延长速度快快慢慢末端复制末端复制少见少见常见常见DNApol、真核生物与原核生物复制的主要差别真核生物与原核生物复制的主要差别dNTPDNA-pol D环复制环复制(D-loopreplication) 真核生物线粒体真核生物线粒体mtDNA复制复制其他复制方式其他复制方式线粒体DNA复制-D环复制线粒体DNA有两个复制起点。第二个复制起点开始复制时，第一个复制
57、起点已复制达全环的2/3 ，并将外环取代出来。电镜下观察此结构似D形，故称D环复制。D环复制时两条新链的起始时间不同，因此复制是不对称的。1964年，年，Temin发现发现Rous肉瘤病毒等肉瘤病毒等RNA病毒的感染可病毒的感染可被被DNA合成抑制剂遏制。表明：合成抑制剂遏制。表明：RNA肿瘤病毒的复制肿瘤病毒的复制过程中要合成过程中要合成DNA。放线菌素放线菌素D能抑制致癌能抑制致癌RNA病毒的复制，但不能抑制一病毒的复制，但不能抑制一般般RNA病毒的复制。表明：转录对于病毒的复制。表明：转录对于RNA病毒增殖是病毒增殖是必需的。必需的。1970年，年，Temin在在Rouse肉瘤病毒、肉瘤
58、病毒、Baltimore在白血病在白血病病毒中发现逆转录酶。病毒中发现逆转录酶。第五节第五节 反转录作用反转录作用 逆转录酶的发现逆转录酶的发现19701970年在鸡肉瘤中发现了逆转录酶，发展了中心法则。年在鸡肉瘤中发现了逆转录酶，发展了中心法则。19751975年获得诺贝尔奖年获得诺贝尔奖 反转录作用反转录作用（reverse transcription）又称为）又称为反向转录、逆转录反向转录、逆转录:以以RNA为模板，利用为模板，利用4种种dNTP为原料，在引物为原料，在引物的的3端以端以53方向合成与方向合成与RNA互补的互补的DNA链链的过程的过程 Reverse transcript
59、ase Reverse transcriptase Reverse transcriptase反转录酶反转录酶反转录酶反转录酶反转录酶反转录酶反反转录转录酶酶Reverse transcriptaseRNA指导的指导的DNA合成合成（Reverse transcriptase） RNA水解水解（RNase H）DNA指导的指导的DNA合成合成（DNA polymerase）整合作用整合作用（integrase）特点：特点：无外切酶活性，转录错误率高（无外切酶活性，转录错误率高（2X104）反转录酶的功能：反转录酶的功能：补充了中心法则补充了中心法则，说明说明RNA同样兼有遗传信息同样兼有遗传信
60、息传代与表达功能传代与表达功能加深了对加深了对RNA病毒病毒致癌、致病的认识致癌、致病的认识利用利用反转录酶反转录酶，进行基因操作，制备，进行基因操作，制备 cDNA反转录作用的研究意义反转录作用的研究意义Life cycle of retrovirusesTranscription逆转录病毒逆转录病毒DNADNA单链单链单链病毒单链病毒DNADNA复制互补链复制互补链异源重组异源重组病毒病毒RNARNA转录转录免疫系统的敌免疫系统的敌我识别机制失我识别机制失效！效！切割形成病毒切割形成病毒蛋白蛋白组合成组合成新病毒新病毒并攻击并攻击下一个下一个目标目标指导形成病毒蛋白原链指导形成病毒蛋白原链
61、试管内合成试管内合成cDNAcDNAcDNA(complementary DNA)cDNA(complementary DNA) 以以mRNAmRNA为模板，经逆转录合成的与为模板，经逆转录合成的与mRNAmRNA碱基序列互补的碱基序列互补的DNADNA链。链。 本章小结本章小结一、遗传信息传递的中心法则一、遗传信息传递的中心法则DNARNA蛋白质蛋白质转录转录翻译翻译逆转录逆转录复制复制概念：概念：中心法则、复制、转录中心法则、复制、转录逆转录、翻译逆转录、翻译（一）方式：（一）方式：半保留半保留，半不连续性，半不连续性，双向复制双向复制（二）原料：（二）原料：dNTP（三）酶及因子：（三）酶及因子：DNA聚合酶、引物酶、聚合酶、引物酶、DNA连接酶连接酶DNA拓扑异构酶、解链酶、拓扑异构酶、解链酶、DBP（四）方向（四）方向53前导链、随从链、冈崎片断前导链、随从链、冈崎片断二、复制二、复制（五）复制过程（五）复制过程1、复制的起始和引物、复制的起始和引物RNA的合成的合成2、DNA片段的合成片段的合成3、RNA引物的水解引物的水解4、完整、完整DNA分子的形成分子的形成（六）（六）末端复制：端粒和端粒酶末端复制：端粒和端粒酶三、逆转录：三、逆转录：逆转录酶、逆转录酶、RNA病毒致病机理病毒致病机理、
