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1、 细菌性疫苗细菌性疫苗 杨丽华杨丽华 2011 2011年年3 3月月1. 1. 死疫苗死疫苗2. 2. 活疫苗活疫苗 3. 3. 蛋白类疫苗蛋白类疫苗4. 4. 多糖类疫苗多糖类疫苗 5. 5. 多糖蛋白结合疫苗多糖蛋白结合疫苗 细菌性疫苗细菌性疫苗细菌性疫苗种类细菌性疫苗种类23白喉白喉破伤风破伤风百日咳百日咳疫苗疫苗451霍乱霍乱伤寒伤寒副伤寒副伤寒百日咳百日咳疫苗疫苗卡介苗卡介苗鼠疫鼠疫布氏杆菌布氏杆菌伤寒伤寒痢疾痢疾霍乱霍乱疫苗疫苗脑膜炎脑膜炎伤寒伤寒vivi 肺炎肺炎流感嗜流感嗜血杆菌血杆菌多糖疫多糖疫苗苗ACAC脑膜脑膜炎球菌炎球菌多糖结多糖结合疫苗合疫苗HIBHIB脑膜炎脑膜炎
2、伤寒伤寒vivi流感嗜流感嗜血杆菌血杆菌多糖疫多糖疫苗苗百日咳疫苗百日咳疫苗 伤寒疫苗伤寒疫苗结合疫苗结合疫苗 白喉疫苗白喉疫苗白喉疫苗白喉疫苗一、白喉概述一、白喉概述二、病原学二、病原学三、白喉杆菌的致病力及毒素产生的遗传学三、白喉杆菌的致病力及毒素产生的遗传学四、白喉毒素四、白喉毒素五、白喉类毒素五、白喉类毒素六、生产工艺六、生产工艺七、类毒素的质量检定七、类毒素的质量检定外毒素外毒素对神经对神经系统损系统损害害细菌产生细菌产生的外毒素的外毒素对心肌损对心肌损害害外毒素外毒素对肾脏对肾脏损害损害白喉曾经是对儿童威胁非常大的传染病。白喉曾经是对儿童威胁非常大的传染病。它是由白喉棒状杆菌引起的
3、一种呼吸道传染病它是由白喉棒状杆菌引起的一种呼吸道传染病主要临床表现为上呼吸道发炎主要临床表现为上呼吸道发炎，常常表现在咽部，有时在鼻腔、喉部和气管，常常表现在咽部，有时在鼻腔、喉部和气管，白喉疫苗白喉疫苗白喉流行特点白喉流行特点1.1.传染原：白喉杆菌是严格寄生于人类的细菌传染原：白喉杆菌是严格寄生于人类的细菌 没有中间宿主，病人及带菌者是唯没有中间宿主，病人及带菌者是唯 一的传染原。一的传染原。2.2.传播途径：主要是呼吸道飞沫传播，也可通传播途径：主要是呼吸道飞沫传播，也可通 过被污的器具和食物传播。过被污的器具和食物传播。3.3.易感人群：人对白喉普遍易感，新生儿易感人群：人对白喉普遍
4、易感，新生儿1 1岁时岁时白喉易感性达高峰。白喉易感性达高峰。二、病原学二、病原学1.1.细菌形态细菌形态 白喉棒状杆菌菌体一端或两端膨大呈白喉棒状杆菌菌体一端或两端膨大呈 棒状，有着色较深的异染颗粒，革兰棒状，有着色较深的异染颗粒，革兰 氏染色阳性，白喉杆菌无动力，无荚氏染色阳性，白喉杆菌无动力，无荚 膜，不形成芽孢。膜，不形成芽孢。白喉棒状杆菌显微镜下形态白喉棒状杆菌显微镜下形态白喉棒状杆菌显微镜下形态白喉棒状杆菌显微镜下形态 2. 2.培养特性培养特性 白喉杆菌是需氧菌，最适温度为白喉杆菌是需氧菌，最适温度为34343535。能分解。能分解 葡萄糖、麦芽糖和糊精，产酸不产气，能还原硝酸葡
5、萄糖、麦芽糖和糊精，产酸不产气，能还原硝酸 盐，不产生吲哚，不消化蛋白。盐，不产生吲哚，不消化蛋白。 3. 3.抵抗力抵抗力 . .白喉杆菌对抗生素有不同程度敏感，对青霉素和白喉杆菌对抗生素有不同程度敏感，对青霉素和 红霉素极敏感。红霉素极敏感。 . .对消毒剂抵抗力弱，对消毒剂抵抗力弱，3 3苯酚苯酚10min10min可将该菌杀死可将该菌杀死 . .不耐热，不耐热，58 10mi58 10mi或或100 1min100 1min即可被杀死。即可被杀死。二、病原学二、病原学三、白喉杆菌的致病力及毒素产生遗传学三、白喉杆菌的致病力及毒素产生遗传学1. 1. 致病力致病力 自然界中动物不感染白喉
6、，只能在敏感动物中造成自然界中动物不感染白喉，只能在敏感动物中造成 人工感染。猴、马、家兔和豚鼠对白喉敏感实验人工感染。猴、马、家兔和豚鼠对白喉敏感实验 室常用的动物是家室常用的动物是家兔、豚鼠和兔、豚鼠和NIHNIH小鼠小鼠。2.2.毒素产生遗传学毒素产生遗传学 白喉是由白喉杆菌产生毒性很强的外毒素引起的。白喉是由白喉杆菌产生毒性很强的外毒素引起的。 白喉杆菌的产毒基因是由白喉杆菌的产毒基因是由嗜菌体携带。嗜菌体携带。 嗜菌嗜菌 体感染无毒白喉杆菌后嗜菌体体感染无毒白喉杆菌后嗜菌体DNADNA与细菌与细菌DNADNA整合，整合， 形成溶原性白喉杆菌而获得产毒能力（形成溶原性白喉杆菌而获得产毒
7、能力（PW8PW8株目前株目前 用于白喉类毒素生产用于白喉类毒素生产) )。四、白喉毒素四、白喉毒素1.1.白喉外毒素为棒状杆菌白喉外毒素为棒状杆菌-噬菌体噬菌体toxtox基因表达基因表达 产物产物, ,可与细胞表面的特异性受体结合可与细胞表面的特异性受体结合, ,干扰蛋干扰蛋 白质的合成，对人和动物都引起致死性毒性，白质的合成，对人和动物都引起致死性毒性， 如心脏、肾上腺、肝、肾、胰及神经组织等均如心脏、肾上腺、肝、肾、胰及神经组织等均 受到损害。受到损害。2.2.白喉毒素是单一多肽，由白喉毒素是单一多肽，由560560个氨基酸组成，个氨基酸组成， 分子量为分子量为62kDa62kDa,
8、,等电点等电点pH4.1pH4.1，在，在pH6pH6时加热时加热5555 很快失活。很快失活。3.3.通过物理和化学方法将其纯化。通过物理和化学方法将其纯化。细细菌菌毒毒素素甲醛甲醛类毒素类毒素毒素经毒素经甲醛处理后去除毒性甲醛处理后去除毒性 而保留免疫原性而保留免疫原性五、白喉类毒素五、白喉类毒素甲醛甲醛浓度浓度温度温度PH脱毒脱毒影响脱毒因素影响脱毒因素温度、温度、pHpH和甲醛浓度等均影响脱毒效果和甲醛浓度等均影响脱毒效果. .温度越高脱毒越快，超过温度越高脱毒越快，超过4040影响抗原性，影响抗原性， 一般一般373738 38 。. .在酸性时脱毒较慢，但游离甲醛含量高，在在酸性时
9、脱毒较慢，但游离甲醛含量高，在 保存过程中由于甲醛的继续作用，可导致脱保存过程中由于甲醛的继续作用，可导致脱 毒过甚，并影响毒素的稳定性；在碱性时脱毒过甚，并影响毒素的稳定性；在碱性时脱 毒快，但抗原性损失较大，一般采用毒快，但抗原性损失较大，一般采用弱碱性。弱碱性。. .甲醛浓度大则脱毒快，但抗原损失大。甲醛浓度大则脱毒快，但抗原损失大。温度升高温度升高游离甲醛的浓度低游离甲醛的浓度低毒素纯度高毒素纯度高易发生毒易发生毒性逆转性逆转提高甲醛浓度、脱毒提高甲醛浓度、脱毒pHpH、脱毒温度和延长脱毒时间；脱毒温度和延长脱毒时间；增加非蛋白氮含量（于精制增加非蛋白氮含量（于精制毒素中加入赖氨酸、精
10、氨酸毒素中加入赖氨酸、精氨酸等）等）防止或减防止或减轻毒性逆轻毒性逆转转类毒素的毒性逆转类毒素的毒性逆转 六、白喉疫苗工艺流程六、白喉疫苗工艺流程 菌种（菌种（ PW8PW8株株 ） 传代扩增传代扩增 3 34 4代代 发酵罐培养发酵罐培养 34343535培养对数生长培养对数生长 末期收获，甲苯杀菌。末期收获，甲苯杀菌。 离心去菌体离心去菌体 收集清液收集清液 超滤浓缩超滤浓缩 硫酸铵两段盐析硫酸铵两段盐析 除盐除菌除盐除菌 氨离子及无菌检查氨离子及无菌检查 脱毒脱毒 甲醛液甲醛液 37 37 脱毒试验（家兔）脱毒试验（家兔） 原液原液 检定（浓度、纯度、安全等）检定（浓度、纯度、安全等）
11、Al(OH)Al(OH)3 3吸附吸附 成品成品检定检定（安全、效价等）（安全、效价等）七、类毒素的质量检定七、类毒素的质量检定1 絮状单位（絮状单位（Lf）是毒素或类毒素与抗毒素的结合单位，只能代表是毒素或类毒素与抗毒素的结合单位，只能代表“量量”而不能完全代表活性。使用抗毒素絮状单位标准品来测定而不能完全代表活性。使用抗毒素絮状单位标准品来测定类毒素的絮状单位。类毒素的絮状单位。 絮状单位测定絮状单位测定毒素或类毒素与相应抗毒素在适当的含量、比例、温度毒素或类毒素与相应抗毒素在适当的含量、比例、温度反应时间等条件下可在试管中发生抗原抗体结合，产生肉反应时间等条件下可在试管中发生抗原抗体结合
12、，产生肉眼可见的絮状凝集反应，眼可见的絮状凝集反应，根据抗毒素絮状单位标准品可测定类毒素的絮状单位根据抗毒素絮状单位标准品可测定类毒素的絮状单位（Lf）值。）值。2 纯度：纯度： 1500Lf/mgPN3 安全性试验（豚鼠）安全性试验（豚鼠）七、类毒素的质量检定七、类毒素的质量检定4 4效价测定效价测定 类毒素刺激机体产生特异性抗体的免疫应答和对相应抗类毒素刺激机体产生特异性抗体的免疫应答和对相应抗 体的特异性结合反应。体的特异性结合反应。小鼠小鼠VeroVero细胞法细胞法 将标准和待检类毒素将标准和待检类毒素2 2倍稀释倍稀释3 35 5个稀释度，皮下免疫个稀释度，皮下免疫N N IH I
13、H小鼠小鼠8 8只（只（0.5ml/0.5ml/只只) )，免疫，免疫5 5周采血，根据周采血，根据verovero细胞细胞 生长情况，以标准品的效价为标准，用平行线分析法进生长情况，以标准品的效价为标准，用平行线分析法进 行结果计算。行结果计算。豚鼠毒素攻击法豚鼠毒素攻击法 皮下免疫豚鼠皮下免疫豚鼠1010只（只（1ml/1ml/只），免疫只），免疫4 4周后用毒素攻击，周后用毒素攻击， 观察观察5 5天根据存活率以标准品的效价为标准，用平行线分天根据存活率以标准品的效价为标准，用平行线分 析法进行结果计算。析法进行结果计算。百日咳疫苗百日咳疫苗一、百日咳概述一、百日咳概述二、病原学二、病原
14、学三、百日咳疫苗发展简史三、百日咳疫苗发展简史四、无细胞百日咳疫苗四、无细胞百日咳疫苗、生产工艺流程、生产工艺流程、质量检定、质量检定、APVAPV的效果的效果、接种不良反应、接种不良反应急性脑炎、急性脑炎、呕吐、痉挛呕吐、痉挛和昏迷，死和昏迷，死亡或脑损伤亡或脑损伤并发症肺炎并发症肺炎形成肺气肿形成肺气肿肺不张，甚肺不张，甚至死亡。至死亡。营养缺营养缺乏症乏症百日咳是对儿童威胁非常大的传染病，百日咳是对儿童威胁非常大的传染病，它是由百日咳杆菌引起的一种呼吸道传染病。它是由百日咳杆菌引起的一种呼吸道传染病。典型症状为突然阵发性痉咳，并带有吸气性尾典型症状为突然阵发性痉咳，并带有吸气性尾声或伴有
15、呕吐，可持续数月。声或伴有呕吐，可持续数月。百日咳概述百日咳概述百日咳流行特点百日咳流行特点1.1.传染原：人是百日咳唯一的天然宿主百日咳传染原：人是百日咳唯一的天然宿主百日咳 病人是传染原。病人是传染原。2.2.传播途径：主要是呼吸道飞沫传播，也可通传播途径：主要是呼吸道飞沫传播，也可通 过被污的器具和食物传播。过被污的器具和食物传播。3.3.易感人群：主要传染对象是易感人群：主要传染对象是6 6岁以下儿童，岁以下儿童，1 1 岁以内婴幼儿发病率岁以内婴幼儿发病率50%50%。二、病原学二、病原学细菌形态细菌形态百日咳菌呈革兰氏染色阴性，短杆状或椭圆形百日咳菌呈革兰氏染色阴性，短杆状或椭圆形
16、生长特性生长特性1.1.百日咳菌可分四种相变，百日咳菌可分四种相变，相菌毒力最强有免相菌毒力最强有免 疫原性疫原性；相菌毒力消失，无免疫原性；相菌毒力消失，无免疫原性； 相菌介于相菌介于 相之间。相之间。2.2.百日咳菌是需氧菌，最适温度为百日咳菌是需氧菌，最适温度为353536,36,最最 适。适。3.3.不发酵任何糖类、不分解糊精，尿素盐，不液不发酵任何糖类、不分解糊精，尿素盐，不液 化明胶不产生吲哚，不利用枸橼酸盐。化明胶不产生吲哚，不利用枸橼酸盐。 作用作用 PT PT FHA FHAAggsAggsPRNPRN AC ACTCTTCTHLTHLT 呼吸道粘附作用呼吸道粘附作用 - -
17、 - 细胞毒性细胞毒性 免疫原性免疫原性 - - -1 1百日咳百日咳相菌有两大类抗原相菌有两大类抗原 菌体菌体O O抗原抗原 表面表面K K抗原（荚膜物质）抗原（荚膜物质）2 2百日咳菌可产生百日咳菌可产生 外毒素外毒素(PT)(PT) 内毒素内毒素 其他生物活性物质，据报道有其他生物活性物质，据报道有2525种之多。种之多。、主要抗原和生物学活性、主要抗原和生物学活性 百日咳菌粘附在上呼吸道上皮细胞纤毛上繁殖百日咳菌粘附在上呼吸道上皮细胞纤毛上繁殖 重患重患 (FHA PT PRN Agg) (FHA PT PRN Agg) 下呼吸道上皮细胞纤毛上繁殖下呼吸道上皮细胞纤毛上繁殖 细菌不进入
18、组织和血液循环细菌不进入组织和血液循环 干扰吞噬细胞功能干扰吞噬细胞功能 AC AC 分泌大量分泌大量PTPT麻痹上皮细胞功能麻痹上皮细胞功能 TCT TCT 产生血细胞增多产生血细胞增多损伤支气管血管周损伤支气管血管周 HLT HLT 细胞代谢发生变化细胞代谢发生变化 组织胺致敏性增强组织胺致敏性增强 围组织围组织 分泌胰岛素增强和分泌胰岛素增强和 血糖降低血糖降低. . 、致病机理、致病机理三、百日咳疫苗发展简史三、百日咳疫苗发展简史粗制百日咳灭活疫苗粗制百日咳灭活疫苗 第一次世界大战时期，在对病原菌的生物学构造及其第一次世界大战时期，在对病原菌的生物学构造及其 与与 致病机理间的关系缺乏
19、认识的前提下，凭经验制造的灭活致病机理间的关系缺乏认识的前提下，凭经验制造的灭活 疫苗，工艺粗造、含量不确定。疫苗，工艺粗造、含量不确定。全菌体百日咳疫苗全菌体百日咳疫苗(WPV)(WPV) 以标准化方式生产的，制造疫苗的菌株必须含有以标准化方式生产的，制造疫苗的菌株必须含有123123型凝型凝 集原（集原（Agg1Agg1、Agg2Agg2 、Agg3Agg3）。经过）。经过5050多年的临床应用证多年的临床应用证 明该疫苗的免疫效果是肯定的，但接种后的不良反应问题明该疫苗的免疫效果是肯定的，但接种后的不良反应问题 一直未解决。一直未解决。无细胞百日咳疫苗无细胞百日咳疫苗(APV)(APV)
20、 2020世纪世纪8080年代初期，对百日咳菌的成分及其所引起生物学年代初期，对百日咳菌的成分及其所引起生物学 作用的认识，产生了作用的认识，产生了APVAPV。基因工程疫苗正在研究中。基因工程疫苗正在研究中。四、无细胞百日咳疫苗四、无细胞百日咳疫苗19811981年日本的佐藤教授等人在纯化出年日本的佐藤教授等人在纯化出PTPT和和FHAFHA两种抗原的基础两种抗原的基础 上，在世界上第一次研制成功了含有两种抗原成分的无细胞百上，在世界上第一次研制成功了含有两种抗原成分的无细胞百 日咳疫苗，并且与白喉和破伤风类毒素联合制成无细胞百白破日咳疫苗，并且与白喉和破伤风类毒素联合制成无细胞百白破 联合
21、疫苗。该疫苗在日本开始正式使用，目前日本已经全部取联合疫苗。该疫苗在日本开始正式使用，目前日本已经全部取 代了菌体百白破疫苗。代了菌体百白破疫苗。19921992年美国正式批准使用日本生产的无细胞百日咳疫苗。美国年美国正式批准使用日本生产的无细胞百日咳疫苗。美国 获得生产许可证的获得生产许可证的APVAPV还含有还含有Agg2Agg2和和PRNPRN。目前。目前WHOWHO已经将其作已经将其作 为儿童预防免疫推荐用疫苗。为儿童预防免疫推荐用疫苗。我国是于我国是于8080年代中期开始研制无细胞百白破联合疫苗，年代中期开始研制无细胞百白破联合疫苗，9090年代年代 中期获得正式生产文号。中期获得正
22、式生产文号。近期的临床试验证明含有近期的临床试验证明含有5 5种保护性抗原（种保护性抗原（PT FHA PRN Agg2PT FHA PRN Agg2 A A gg3 gg3 ）的）的APVAPV效果最佳。效果最佳。冻干百日咳菌种（冻干百日咳菌种（相相CS菌株）菌株）接种血培养基大管培养接种血培养基大管培养 36 48-72小时培养小时培养传代传代接种发酵罐培养（综合培养基）接种发酵罐培养（综合培养基） 培养培养 48小时小时收集培养物收集培养物第一段硫酸铵盐析及浸提第一段硫酸铵盐析及浸提第二段硫酸铵盐析及浸提第二段硫酸铵盐析及浸提透析透析密度梯度离心密度梯度离心戊二醛脱毒戊二醛脱毒透析透析超
23、声超声无细胞百日咳原液无细胞百日咳原液、生产工艺流程、生产工艺流程检测项目检测项目标准标准蛋白含量蛋白含量 抗原纯度测定抗原纯度测定PTPT和和FHAFHA不低于总蛋白质不低于总蛋白质含量的含量的85%85%热原测定热原测定符合规定符合规定毒毒性性试试验验小鼠体重减轻试验小鼠体重减轻试验不高于不高于10BWDU/ml10BWDU/ml小鼠白细胞增多试验小鼠白细胞增多试验不高于不高于0.5PLU/ml0.5PLU/ml小鼠组胺致敏试验小鼠组胺致敏试验不高于不高于0.8HSU/ml0.8HSU/ml毒性逆转试验毒性逆转试验不高于不高于0.8HSU/ml0.8HSU/ml效价测定（脑腔保护力试验）效
24、价测定（脑腔保护力试验） 不低于不低于4.0IU/4.0IU/剂量剂量、质量检定、质量检定日本和中国的日本和中国的APVAPV和和DTPaDTPa按以上主要检定项目进行质量按以上主要检定项目进行质量 控制。控制。美国、欧洲一些国家及美国、欧洲一些国家及WHOWHO推荐的毒性和效价测定方法推荐的毒性和效价测定方法 等与之不同。等与之不同。毒性试验毒性试验仅要求做仅要求做HSTHST，效价测定效价测定采用采用ELEL ISA ISA法检测疫苗注射小鼠后百日咳抗体应答水平。法检测疫苗注射小鼠后百日咳抗体应答水平。用小鼠脑腔保护力试验用小鼠脑腔保护力试验（MPTMPT）评价疫苗效果，评价疫苗效果，WP
25、V WPV 的的 效价明显高于效价明显高于APVAPV，而且并非所有的而且并非所有的APVAPV均可通过均可通过MPTMPT试试 验。验。因此还没有令人满意的针对因此还没有令人满意的针对APVAPV疫苗的效价试验方疫苗的效价试验方 法。法。免疫原性试验在衡量制品的一致性方面是有用的，但免疫原性试验在衡量制品的一致性方面是有用的，但 与临床保护之间还缺乏相关性。与临床保护之间还缺乏相关性。 效价测定方法探讨效价测定方法探讨接种种类接种种类免疫人数免疫人数病例数病例数发病率（发病率（% %）报道时间报道时间WPVWPV56568 814.314.319831983APVAPV36364 411.3
26、11.3_ _5858484882.882.8APVAPV30303 310.010.019881988_ _4242373780.080.0APVAPV26261 13.83.819881988 _ _2727171762.962.9APVAPV62622 23.23.219901990_ _3737303081.081.0表明表明APVAPV的保护效果是肯定的，能够达到的保护效果是肯定的，能够达到WPAWPA的保护水平。的保护水平。、APVAPV的效果的效果疫苗种类疫苗种类发热发热(%)(%)持续性喊持续性喊(%)(%)红晕红晕(%)(%)肿胀肿胀(%)(%)疼痛疼痛(%)(%)APVAP
27、V0.8-2.80.8-2.84.5-9.04.5-9.01.4-5.51.4-5.51.2-5.51.2-5.51.4-4.81.4-4.8WPVWPV6.66.620.520.59.59.515.415.420.820.8表明表明APVAPV的不良反应明显低于的不良反应明显低于WPVWPV。、接种不良反应、接种不良反应伤寒疫苗伤寒疫苗一、概述一、概述二、病原学二、病原学三、伤寒疫发展简史三、伤寒疫发展简史四、伤寒四、伤寒ViVi疫苗疫苗1.伤伤寒寒病病是是一一种种急急性性全全身身性性感感染染，感感染染网网状状内内皮皮细细胞胞系系统统，肠肠道道淋淋巴巴组组织织及及胆胆囊囊，病病原是伤寒沙门氏
28、菌。原是伤寒沙门氏菌。2.传播途径是食入被污染的食物或水源。传播途径是食入被污染的食物或水源。3.学学龄龄儿儿童童发发病病率率最最高高，两两岁岁以以下下儿儿童童和和35岁以上成人发病率低。岁以上成人发病率低。一、一、 概述概述1潜伏期为潜伏期为7 72121天天病期为一病期为一个月，恢个月，恢复缓慢。复缓慢。3表情迟钝表情迟钝脉搏相对脉搏相对缓慢，肝缓慢，肝脾肿大和脾肿大和白细胞减白细胞减少。少。2长期发热、长期发热、持续高烧持续高烧达达10101414天、腹部天、腹部不适、头不适、头痛等。痛等。2长期发热、长期发热、持续高烧持续高烧达达10101414天、腹部天、腹部不适、头不适、头痛等。痛
29、等。典型的临床症状典型的临床症状二、病二、病 原原 学学1.1.细菌形态细菌形态 伤寒沙门氏菌是革兰氏阴性杆菌，伤寒沙门氏菌是革兰氏阴性杆菌， 有鞭毛，能运动。有鞭毛，能运动。伤寒沙门氏菌革兰染色伤寒沙门氏菌革兰染色伤寒沙门氏菌电镜形态伤寒沙门氏菌电镜形态 2. 2.培养特性培养特性在肉汤琼脂、马丁琼脂或其他适宜培养基上以在肉汤琼脂、马丁琼脂或其他适宜培养基上以易生长，需氧，适宜温度易生长，需氧，适宜温度35-3735-37，适宜的，适宜的pHpH为为7.07.07.27.2。发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇均产酸不产气；发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇均产酸不产气；不发酵乳糖、蔗糖；氧化酶试验阴性。不发
30、酵乳糖、蔗糖；氧化酶试验阴性。1.1.鞭毛（鞭毛（H H）抗原：为蛋白质，煮沸破坏，不受抗原：为蛋白质，煮沸破坏，不受 （1 1）甲醛影响。）甲醛影响。2.2.菌体（菌体（O O）抗原：细胞壁部份，耐热，为脂多抗原：细胞壁部份，耐热，为脂多 糖（糖（LPSLPS）由多糖（重复寡）由多糖（重复寡 糖和核心寡糖）和类脂糖和核心寡糖）和类脂A A组组 成。成。3.3.莢膜（莢膜（ViVi）抗原抗原: :即荚膜多糖（即荚膜多糖（CPSCPS）, ,是伤寒是伤寒 杆菌细胞外壁的一种荚膜抗杆菌细胞外壁的一种荚膜抗 原原, , Vi Vi抗原与其致病性有关抗原与其致病性有关 ViVi来源于毒力的缩写。来源于
31、毒力的缩写。抗原结构抗原结构血清学诊断血清学诊断 1.1.肥达氏试验（肥达氏试验（widal testwidal test） 选择抗原的方法：选择抗原的方法： . .测定测定O O抗体抗体 用伤寒用伤寒09010901株（没有株（没有H H和和ViVi抗原）抗原） 用加热杀菌破坏用加热杀菌破坏H H抗原（不耐热）抗原（不耐热） . .测定测定H H抗体抗体 用伤寒用伤寒S S株（没有株（没有O O菌体抗原）菌体抗原） 用甲醛处理伤寒沙门氏菌破坏用甲醛处理伤寒沙门氏菌破坏O O抗原抗原 2.2.酶联免疫试验酶联免疫试验1234全菌全菌体灭体灭活疫活疫苗苗口服口服Ty21aTy21a减毒减毒活疫活
32、疫苗苗伤寒伤寒ViVi多多糖疫糖疫苗苗伤寒伤寒结合结合疫苗疫苗二、伤寒疫苗的发展简史二、伤寒疫苗的发展简史1 1甲醛杀菌石碳酸防腐疫苗甲醛杀菌石碳酸防腐疫苗2.2.加热杀菌石碳酸防腐疫苗加热杀菌石碳酸防腐疫苗3.3.丙酮杀菌疫苗丙酮杀菌疫苗、全菌体灭活疫苗、全菌体灭活疫苗甲醛杀菌石碳酸防腐疫苗甲醛杀菌石碳酸防腐疫苗 50 50年代初期学自前苏联，为伤寒、副伤寒甲年代初期学自前苏联，为伤寒、副伤寒甲乙三联疫苗。用甲醛杀菌，乙三联疫苗。用甲醛杀菌，0.50.5石炭酸生石炭酸生理盐水制成。每毫升含伤寒沙门氏菌体原为理盐水制成。每毫升含伤寒沙门氏菌体原为1 1亿亿- -亿；副伤寒甲乙由每毫升各亿亿；副
33、伤寒甲乙由每毫升各亿- -.5.5亿，亿，细菌总量原三联疫苗为细菌总量原三联疫苗为2020亿亿-10-10亿。亿。加热杀菌石碳酸防腐疫苗加热杀菌石碳酸防腐疫苗 此法历史最久，此法历史最久，18961896年首创的伤寒疫苗即为此年首创的伤寒疫苗即为此法制成，只用法制成，只用5656水浴水浴3030inin杀菌加石碳酸防腐制杀菌加石碳酸防腐制成。美国仍用此法制作标成。美国仍用此法制作标准品。准品。丙酮杀菌疫苗丙酮杀菌疫苗 1921 1921年创制，认为对稳定年创制，认为对稳定ViVi抗原有益，系抗原有益，系将一份菌液加三份丙酮处理，然后抽气将一份菌液加三份丙酮处理，然后抽气干燥制成。干燥制成。19
34、431943年首次在意大利使用，经年首次在意大利使用，经世界卫生组织做现场考核，认为效果最好。世界卫生组织做现场考核，认为效果最好。观察组观察组观察人数观察人数中强反应中强反应百分率百分率(%)(%)第一组第一组1408140885856.056.05第二组第二组1313131315115111.5011.50合计合计272127212362368.758.75伤寒、副伤寒甲乙三联疫苗接种反应伤寒、副伤寒甲乙三联疫苗接种反应 实践证明，菌体疫苗预防伤寒效果肯定的，但接实践证明，菌体疫苗预防伤寒效果肯定的，但接种后的严重反应一直困扰着人们。种后的严重反应一直困扰着人们。、口服、口服Ty21aTy
35、21a疫苗疫苗 7070年代末期研究成年代末期研究成功的口服伤寒疫苗功的口服伤寒疫苗Ty21aTy21a活疫苗，是以活疫苗，是以Ty21Ty21伤寒毒株作为出发伤寒毒株作为出发株，用亚硝基胍诱变所株，用亚硝基胍诱变所得的突变株。得的突变株。口服口服Ty21aTy21a疫苗的特点疫苗的特点1.1.减毒活疫苗减毒活疫苗此突变株缺少尿苷二磷酸半乳糖此突变株缺少尿苷二磷酸半乳糖-4-4-异构酶半乳糖异构酶半乳糖 激酶和半乳糖激酶和半乳糖1-1-磷酸尿苷酰转移酶的活性降低约磷酸尿苷酰转移酶的活性降低约8 8 0 0。且没有且没有ViVi抗原。所以其毒力减低，但此突变株有抗原。所以其毒力减低，但此突变株有
36、 完整的完整的O O抗原抗原LPSLPS，并具有免疫原性，能诱导较好并具有免疫原性，能诱导较好 的免疫保护性反应。的免疫保护性反应。2.2.经过多年观察证明有效，反应也较轻。一些国家经过多年观察证明有效，反应也较轻。一些国家 批准应用。批准应用。口服口服Ty21aTy21a疫苗的特点疫苗的特点3.Ty21a3.Ty21a菌株营养要求苛刻，生长缓慢，菌株营养要求苛刻，生长缓慢， 产量很低，不易批量生产。产量很低，不易批量生产。4.4.目前无可靠的检定指标。目前无可靠的检定指标。5.5.基因背景不够清楚，因为它是用强诱变基因背景不够清楚，因为它是用强诱变 剂处理而得，作为活疫苗这是它的最大剂处理而
37、得，作为活疫苗这是它的最大 的弱点。的弱点。地区地区疫苗制剂疫苗制剂效果效果效果比较效果比较埃及埃及液体液体NaHcoNaHco3 3 96%96%智利智利肠溶衣胶囊明胶囊肠溶衣胶囊明胶囊 6666ECCECC、1919明胶明胶 ECCECC明胶明胶 智利智利液体胶囊液体胶囊 35% 35% ECCECC、76%76%液体液体 液体液体ECC ECC 印尼印尼液体胶囊液体胶囊 42% 42% ECCECC、53%53%液体液体 液体液体ECC ECC 口服口服Ty21aTy21a减毒活疫苗的免疫效果减毒活疫苗的免疫效果 、 伤寒伤寒ViVi多糖疫苗多糖疫苗1.1.伤寒伤寒ViVi多糖疫苗的概述
38、多糖疫苗的概述2.2.伤寒伤寒ViVi多糖疫苗的免疫效果多糖疫苗的免疫效果3.3.伤寒伤寒ViVi多糖疫苗不良反应观察结果多糖疫苗不良反应观察结果4.4.伤寒伤寒ViVi多糖疫苗的制造工艺多糖疫苗的制造工艺5.5.伤寒伤寒ViVi多糖疫苗的特点多糖疫苗的特点伤寒伤寒ViVi多糖疫苗概述多糖疫苗概述由于由于ViVi抗原是一种表面抗原，是由抗原是一种表面抗原，是由C3C3位乙酰化的位乙酰化的 N- N-乙酰乙酰-D-D-半乳糖醛酸（半乳糖醛酸（1 14 4）连接的同聚体。）连接的同聚体。在美国在美国NIHNIH的的RobbinsRobbins等重新认识伤寒等重新认识伤寒ViVi抗原的免抗原的免 疫
39、原性后，并受流脑多糖疫苗的启发，用与之类疫原性后，并受流脑多糖疫苗的启发，用与之类 似的方法提取似的方法提取ViVi抗原，以不伤害其抗原结构，保抗原，以不伤害其抗原结构，保 持它的免疫原性，制备了伤寒持它的免疫原性，制备了伤寒ViVi多糖疫苗。多糖疫苗。伤寒伤寒ViVi多糖疫苗概述多糖疫苗概述早期提取早期提取Vi Vi 抗原时为了降低抗原时为了降低LPSLPS的含量，的含量， 采取采取1mol/L1mol/L乙酸乙酸100100处理处理24h24h，使，使O-O-乙酰乙酰 基和基和N-N-乙酰基脱落造成乙酰基脱落造成ViVi抗原结构变化，抗原结构变化， 导致其免疫原性发生变化。导致其免疫原性发
40、生变化。新方法是用十六烷基三甲基溴化铵处理伤新方法是用十六烷基三甲基溴化铵处理伤 寒沙门氏菌，所得寒沙门氏菌，所得ViVi抗原可以保留抗原可以保留O-O-乙酰乙酰 基和基和N-N-乙酰基，使其不变性。乙酰基，使其不变性。观察观察地区地区疫苗疫苗人数人数观察观察时间（月）时间（月）保护率保护率（）（）尼泊尔尼泊尔伤寒伤寒Vi Vi 34573457（5 54444岁）岁）17177272南非南非伤寒伤寒Vi Vi 56925692（5 51616岁）岁）21216464伤寒伤寒ViVi多糖疫苗的免疫效果多糖疫苗的免疫效果疫苗疫苗局部反应局部反应发热率发热率 (%) (%) 疼痛疼痛红肿红肿硬结硬
41、结流脑流脑A+CA+C多糖多糖（50g/50g/人）人） N=129 N=129 89 89（6969）2323（1818） 21 21（1616）2 2（2 2）伤寒伤寒ViVi（25g/25g/人）人） N=127 N=127 7878（6161）1010（8 8） 2 2（2 2） 1 1（1 1） 伤寒伤寒ViVi（50g/50g/人）人） N=126 N=126 86 86（6868）9 9（7 7) ) 9 9（7 7）0 0伤寒伤寒ViVi多糖疫苗不良反应观察结果多糖疫苗不良反应观察结果（Ty2株）株）细菌培养细菌培养生物反应液体培养（生物反应液体培养（810h）对数生长期末收获
42、对数生长期末收获,甲醛液灭活甲醛液灭活离心去菌体，收上清液离心去菌体，收上清液浓缩多糖浓缩多糖上清加上清加10%十六烷基三甲基溴化铵十六烷基三甲基溴化铵离心收集沉淀，加氯化钙溶液振离心收集沉淀，加氯化钙溶液振荡解离荡解离除去核酸除去核酸加加95%乙醇至乙醇至25%浓度收集上浓度收集上清清上清中加上清中加95%乙醇至乙醇至80%浓度浓度沉淀粗制多糖，抽干沉淀粗制多糖，抽干除去蛋白除去蛋白加加1：10饱和中性醋酸钠溶液饱和中性醋酸钠溶液溶解多糖溶解多糖按按1：2 2加冷酚提取加冷酚提取3次，离心收次，离心收集上清集上清液并透析液并透析沉淀多糖沉淀多糖透析液加透析液加95%乙醇至乙醇至80%沉淀多糖
43、沉淀多糖用无水乙醇和丙酮各洗用无水乙醇和丙酮各洗3次次原液原液注射用水溶解多糖并除菌注射用水溶解多糖并除菌注射用水稀释分装注射用水稀释分装成品成品伤寒伤寒ViVi荚膜多糖疫苗工艺流程荚膜多糖疫苗工艺流程检定项目检定项目检定指标检定指标固总测定固总测定蛋白含量蛋白含量10mg/g10mg/g核酸含量核酸含量20mg/g20mg/gO O乙酰基含量乙酰基含量2mmol/g2mmol/gKd Kd 值值0.250.25Kd Kd 值值0.250.25回收率回收率50%50%热原检查热原检查0.025g/kg0.025g/kg伤寒伤寒ViVi多糖疫苗检定项目及检定指标多糖疫苗检定项目及检定指标伤寒伤寒
44、ViVi多糖疫苗的特点多糖疫苗的特点安全有效安全有效 副反应较菌体疫苗轻，但却副反应较菌体疫苗轻，但却 有其大致相同的免疫效果。有其大致相同的免疫效果。稳定性好稳定性好 即可以为液体制剂，也可以即可以为液体制剂，也可以 为冻干制品，耐热，易于运输与保存。为冻干制品，耐热，易于运输与保存。使用方便使用方便 注射一针，即可以有一定的注射一针，即可以有一定的 保护力，易于用理化方法标准化。保护力，易于用理化方法标准化。同其他多糖疫苗一样对婴幼儿免疫效果同其他多糖疫苗一样对婴幼儿免疫效果 差。差。 结合疫苗结合疫苗一、结合疫苗的特点一、结合疫苗的特点二、免疫机理二、免疫机理三、用于制备结合疫苗的多糖抗
45、原三、用于制备结合疫苗的多糖抗原四、用于制备结合疫苗的蛋白载体四、用于制备结合疫苗的蛋白载体五、结合化学制备结合疫苗的主要要素五、结合化学制备结合疫苗的主要要素六、结合疫苗应具备的两个共同特征六、结合疫苗应具备的两个共同特征七、结合疫苗的使用和发展现状七、结合疫苗的使用和发展现状八、结合疫苗的研究方向八、结合疫苗的研究方向九、存在问题九、存在问题一、结合疫苗的特点一、结合疫苗的特点1.1.抗原物质（多糖和蛋白质）经化学共价结合形成抗原物质（多糖和蛋白质）经化学共价结合形成 了具有一定空间构象的结合物。了具有一定空间构象的结合物。 抗原物质还包括多肽、甾族激素、脂肪胺、核苷抗原物质还包括多肽、甾
46、族激素、脂肪胺、核苷 等小分子物质。等小分子物质。2.2.它能使多糖抗原的它能使多糖抗原的T T细胞非依赖性转化为细胞非依赖性转化为T T细胞依细胞依 赖性赖性, ,产生具有记忆特征的产生具有记忆特征的IgGIgG抗体抗体, ,提高多糖疫提高多糖疫苗的免疫原性和免疫持久性。苗的免疫原性和免疫持久性。3.3.能够在婴儿产生免疫应答。能够在婴儿产生免疫应答。 二、免疫机理二、免疫机理1.1.胸腺非依赖性抗原（胸腺非依赖性抗原（TI-AgTI-Ag）2.2.胸腺依赖性抗原（胸腺依赖性抗原（TD-AgTD-Ag）胸腺非依赖性抗原（胸腺非依赖性抗原（TI-AgTI-Ag）细菌脂多糖、荚膜多糖等。细菌脂多
47、糖、荚膜多糖等。TI-AgTI-Ag分子结构呈长链，分子结构呈长链，O-O-乙酰基、丙酮酰基、糖苷键和乙酰基、丙酮酰基、糖苷键和 磷酸脂键等抗原表位重复排列而成簇，对每种表位来将磷酸脂键等抗原表位重复排列而成簇，对每种表位来将 可视为多价的，能与可视为多价的，能与B B细胞表面受体结合形成细胞表面受体结合形成“帽状现象帽状现象”。可单独触发可单独触发B B细胞产生抗体，不需细胞产生抗体，不需T T辅助性细胞辅助。辅助性细胞辅助。与与TI-AgTI-Ag发生应答的是发生应答的是B B细胞的抗原识别受体细胞的抗原识别受体IgMIgM（B B细胞成细胞成 熟的标志），产生的抗体仅为熟的标志），产生的
48、抗体仅为IgMIgM, ,且抗体效价低、无且抗体效价低、无IgIg类类 型转换。型转换。不诱导细胞免疫应答，也不引起免疫记，即使再次采用相不诱导细胞免疫应答，也不引起免疫记，即使再次采用相 同抗原刺激也不能引起初次免疫应答，更无抗体亲和力成同抗原刺激也不能引起初次免疫应答，更无抗体亲和力成 熟过程熟过程。TI AgBIgM无记忆无记忆B B细胞（细胞（BmBm）形成，不产）形成，不产生加强应答，因而免疫原性弱。生加强应答，因而免疫原性弱。B B细胞对（细胞对（TI-AgTI-Ag）应答特点）应答特点胸腺依赖性抗原（胸腺依赖性抗原（TD-AgTD-Ag）绝大多数天然抗原（蛋白质）都是绝大多数天然
49、抗原（蛋白质）都是TD-AgTD-Ag。 TD-Ag TD-Ag分子量大，结构复杂，表位种类多且不均匀分子量大，结构复杂，表位种类多且不均匀( (就每就每 种表位而言它是单价的种表位而言它是单价的) )。此类抗原含有此类抗原含有T T细胞和细胞和B B细胞决定簇，蛋白质通过单价表细胞决定簇，蛋白质通过单价表 位的相互作用与位的相互作用与B B细胞表面细胞表面IgMIgM受体结合，但不诱导受体结合，但不诱导“帽帽 状现象状现象”，不足以激活，不足以激活B B细胞细胞, ,但被但被B B细胞胞饮、细胞胞饮、水解后水解后肽肽 表位与表位与T T细胞受体结合诱导细胞受体结合诱导THTH细胞产生细胞因子
50、。细胞产生细胞因子。TD-AgTD-Ag需需THTH细胞产生细胞因子并激活细胞产生细胞因子并激活B2B2细胞产生抗体细胞产生抗体, ,浆浆 细胞在产生抗体中发生细胞在产生抗体中发生IgIg类型转换，合成类型转换，合成IgGIgG和和IgMIgM类抗类抗 体。体。形成记忆形成记忆BmBm细胞，当受到相同抗原再次刺激时引起再次细胞，当受到相同抗原再次刺激时引起再次 应答，而且抗体亲和力较初次应答明显提高。应答，而且抗体亲和力较初次应答明显提高。诱导体液免疫应答，同时诱导细胞免疫应答。诱导体液免疫应答，同时诱导细胞免疫应答。TD-AgIgGIgMTH细胞细胞细胞因子细胞因子B2Bm停止分化停止分化记
51、忆记忆B细胞（细胞（Bm）形成，产生加）形成，产生加强应答，增强免疫原性。强应答，增强免疫原性。B B细胞对（细胞对（TD-AgTD-Ag）应答特点）应答特点多糖多糖蛋白质结合物（蛋白质结合物（TD-AgTD-Ag）将多糖分子与蛋白质共价结合，由于蛋白质将多糖分子与蛋白质共价结合，由于蛋白质 抗原激活抗原激活THTH细胞，能诱导细胞，能诱导THTH细胞产生细胞因子细胞产生细胞因子（如（如r-IFN,IL-2r-IFN,IL-2、4 4、5 5）并传递给）并传递给B2B2细胞，使细胞，使 之参与免疫应答。之参与免疫应答。TD-AgTD-Ag应答存在着应答存在着TH-B2TH-B2细胞间的协作作用
52、细胞间的协作作用 多糖多糖蛋白质结合物（蛋白质结合物（TD-AgTD-Ag） 多糖蛋白质结合疫苗免疫优势多糖蛋白质结合疫苗免疫优势: :1.1.有有THTH细胞参与，刺激机体产生的抗体细胞参与，刺激机体产生的抗体 主要有主要有IgGIgG和少量和少量IgMIgM，能产生细胞免，能产生细胞免 疫和加强免疫应答，免疫原性强。疫和加强免疫应答，免疫原性强。2.2.免疫接种范围广，对所有年龄组人群免疫接种范围广，对所有年龄组人群 均能提供免疫保护。均能提供免疫保护。抗体生成的辅抗体生成的辅助细胞专一地助细胞专一地识别载体决定簇识别载体决定簇 THTH细胞细胞 B2B2细胞细胞是产生抗体的效应细胞是产生
53、抗体的效应细胞 专一地识别多糖（半抗原）专一地识别多糖（半抗原）表面抗原识别受体为表面抗原识别受体为IgGIgG和和IgMIgM产生产生IgGIgG和和IgMIgM。分化增殖过程中有少量分化增殖过程中有少量B B细胞细胞 停止分化变成记忆停止分化变成记忆BmBm细胞细胞出现加强应答免疫原性大大提高出现加强应答免疫原性大大提高细胞因子细胞因子TD-AgTD-AgTD-Ag应答存在着应答存在着TH-B2TH-B2细胞间的协作作用细胞间的协作作用一类是细菌的荚膜一类是细菌的荚膜多糖（多糖（CPSCPS）A/CA/C群脑膜炎群脑膜炎球菌球菌肺炎链球菌肺炎链球菌b b型流感嗜血杆型流感嗜血杆菌（菌（Hi
54、bHib）和伤寒杆菌和伤寒杆菌结合疫苗结合疫苗在动物在动物和人体中均证实和人体中均证实了其安全性和增了其安全性和增强的免疫原性。强的免疫原性。三、用于制备结合疫苗的多糖抗原三、用于制备结合疫苗的多糖抗原另一类为菌体多糖另一类为菌体多糖（OPSOPS）脂多糖（脂多糖（LPSLPS）中）中的的O O特异性多糖特异性多糖（O-PSO-PS）脂寡糖（脂寡糖（LOSLOS）中的寡糖（中的寡糖（OSOS）结合疫苗结合疫苗纯化的纯化的O-PSO-PS和和OSOS没有免疫原性，与蛋白载体制备结没有免疫原性，与蛋白载体制备结合疫苗后可获得免疫原性。抗合疫苗后可获得免疫原性。抗O-PSO-PS的的IgGIgG具有
55、具有型特异性保护，抗型特异性保护，抗OSOS抗体具有杀菌活性及免疫保护抗体具有杀菌活性及免疫保护作用。作用。三、用于制备结合疫苗的多糖抗原三、用于制备结合疫苗的多糖抗原四、四、用于制备结合疫苗的蛋白载体用于制备结合疫苗的蛋白载体1.1.细菌的分泌性毒素（去除毒性细菌的分泌性毒素（去除毒性） 破伤风类毒素（破伤风类毒素（TTTT） 白喉类毒素（白喉类毒素（DTDT）及无毒）及无毒 CRM197CRM197 百日咳毒素（百日咳毒素（PTPT）及无毒）及无毒CRM3201CRM3201 霍乱肠毒素（霍乱肠毒素（CTCT）及其）及其B B亚单（亚单（CTBCTB） 无毒的重组绿脓杆菌外毒素（无毒的重组
56、绿脓杆菌外毒素（rEPArEPA） 大肠杆菌热敏感肠毒素（大肠杆菌热敏感肠毒素（HLTHLT）2.2.细菌菌毛细菌菌毛 绿脓杆菌菌毛（绿脓杆菌菌毛（PAPPAP） 淋球菌淋球菌P-3-2P-3-2菌毛菌毛四、用于制备结合疫苗的蛋白载体四、用于制备结合疫苗的蛋白载体3.3.细菌外膜蛋白细菌外膜蛋白 B B群脑膜炎球菌外膜蛋白（群脑膜炎球菌外膜蛋白（OMPOMP）4.4.病原蛋白质病原蛋白质 如乙肝表面抗原（如乙肝表面抗原（H HsAgsAg）5.B5.B群脑膜炎球菌外膜蛋白（群脑膜炎球菌外膜蛋白（OMPOMP）6.6.伤寒杆菌鞭毛和肺炎球菌溶血素（伤寒杆菌鞭毛和肺炎球菌溶血素（PLYPLY）也是
57、）也是 很有潜力的结合蛋白。很有潜力的结合蛋白。7.7.人工合成的多肽聚合物，常用的是多聚赖氨酸人工合成的多肽聚合物，常用的是多聚赖氨酸 1.1.多糖抗原的选择多糖抗原的选择 细菌的保护性抗原细菌的保护性抗原 荚膜多糖（荚膜多糖（CPSCPS） 菌体多糖（菌体多糖（OPSOPS）2.2.多糖分子大小选择多糖分子大小选择 天然多糖天然多糖 经降解后的寡多糖。经降解后的寡多糖。五、结合化学制备结合疫苗的要素五、结合化学制备结合疫苗的要素3.载体蛋白的选择载体蛋白的选择破伤风类毒素（破伤风类毒素（TTTT） 白喉类毒素（白喉类毒素（DTDT）4.多糖和蛋白质活性功能基团多糖和蛋白质活性功能基团天然的
58、天然的修饰的修饰的5.结合模式结合模式五、结合化学制备结合疫苗的要素五、结合化学制备结合疫苗的要素功能团功能团蛋白质蛋白质多糖多糖一类功能团一类功能团（多糖或蛋白质原有（多糖或蛋白质原有功能团）功能团） 羧基、氨基、巯基羧基、氨基、巯基和芳香基和芳香基 羧基、羟基、氨基羧基、羟基、氨基醛基醛基衍生功能团衍生功能团（经化学反应可引入（经化学反应可引入功能团）功能团）氨基、巯基、酰肼氨基、巯基、酰肼马来亚胺基、卤代马来亚胺基、卤代乙基、乙基、 羧基、氨基、醛基羧基、氨基、醛基马来亚胺基、酰肼马来亚胺基、酰肼巯基、卤代乙酰基巯基、卤代乙酰基4.4.偶联反应可利用的化学功能团偶联反应可利用的化学功能团
59、按照按照结合方法结合方法可分为两种结合模式可分为两种结合模式两种抗原的直接结合两种抗原的直接结合一般限于羧基和具有一级氨基醛基之间的一般限于羧基和具有一级氨基醛基之间的缩合反应，其产物需要进一步还原才能稳定。缩合反应，其产物需要进一步还原才能稳定。两种抗原通过化学双功能连接剂的结合两种抗原通过化学双功能连接剂的结合 在多糖和载体蛋白之间使用一个连接物，不在多糖和载体蛋白之间使用一个连接物，不但可增加结合物的收率，而且可大大增强其但可增加结合物的收率，而且可大大增强其免疫原性。现有的连接剂按其性质可分为两免疫原性。现有的连接剂按其性质可分为两种。种。5.5.结合模式结合模式 5.5.结合模式结合
60、模式 异种双功能连接剂异种双功能连接剂：SPDPSPDP（- -琥珀酰琥珀酰 胺胺-3-3-二硫二硫 代呲啶丙酸）代呲啶丙酸） 同种双功能连接剂同种双功能连接剂 A AH H（已二酰肼）（已二酰肼） EDAC( EDAC(碳二亚胺碳二亚胺) ) 戊二醛。戊二醛。 不同的连接剂所带的活性功能团不同不同的连接剂所带的活性功能团不同, ,因而要因而要求抗原中相应不同的活性功能团与之反应。求抗原中相应不同的活性功能团与之反应。5.5.结合模式结合模式按照多糖蛋白质偶联物的按照多糖蛋白质偶联物的分子构象分子构象分为两种连接模式分为两种连接模式 末端连接模式末端连接模式 交叉连接模交叉连接模 5. 5.结
61、合模式结合模式末端连接模式末端连接模式 一个载体蛋白上可连接一定数量的糖链，每一条一个载体蛋白上可连接一定数量的糖链，每一条糖链上只有一个末端位点与蛋白质结合，糖链与糖链上只有一个末端位点与蛋白质结合，糖链与蛋白质载体可以直接连接，也可以通过小分子桥蛋白质载体可以直接连接，也可以通过小分子桥连接。连接。 5.5.结合模式结合模式交叉连接模交叉连接模 该模式的每一个载体蛋白或每一个糖链上都可以该模式的每一个载体蛋白或每一个糖链上都可以 有多个相互连接位点，结合物形成网状交连体。有多个相互连接位点，结合物形成网状交连体。 随着糖链长度的延长，连接点的增加，交连体的随着糖链长度的延长，连接点的增加，
62、交连体的 分子质量会相应增大，其三维空间结构更为复杂分子质量会相应增大，其三维空间结构更为复杂. .方案方案多糖的活性功能基团多糖的活性功能基团 连接剂选用连接剂选用实例实例-CHO OH-CHO OH直接结合直接结合（氨基还原反应）（氨基还原反应） 付伤寒甲付伤寒甲PSPS 结合疫苗结合疫苗-COOH-COOHADHADH（酰胺化反应）（酰胺化反应）疫疾疫疾CSPCSP结合疫苗结合疫苗苯环上苯环上OHOH-OH-OHCNBrCNBr激活激活ADHADH（酰胺化反应）（酰胺化反应）HibHib结合疫苗结合疫苗-COOH-COOHSPDPSPDP（二硫化物交换）（二硫化物交换）伤寒伤寒ViVi结
63、合疫苗结合疫苗结合疫苗制备常用的四种化学结合方案结合疫苗制备常用的四种化学结合方案 1.1.氨基还原法（直接结合）氨基还原法（直接结合）糖类在水溶液中大多以环状半缩醛形式糖类在水溶液中大多以环状半缩醛形式 存在，在氨基存在的情况下与之形成存在，在氨基存在的情况下与之形成shi shi ff ff氏碱。氏碱。用还原剂将氨基还原成二级亚胺用还原剂将氨基还原成二级亚胺, , 从而从而 形成稳定的多糖蛋白结合物形成稳定的多糖蛋白结合物 。3.CNBr-ADH 3.CNBr-ADH 酰胺化反应法酰胺化反应法在碱性条件下用在碱性条件下用CNBrCNBr活化多糖分子上的羟基活化多糖分子上的羟基（-OH-OH
64、）形成）形成氰酸脂氰酸脂。然后与然后与ADHADH反应将脂酰肼（反应将脂酰肼（AHAH）基团导入多）基团导入多 糖分子形成糖分子形成PS-AHPS-AH衍生物衍生物。最后在最后在EDACEDAC的介导下与蛋白载体形成稳定的的介导下与蛋白载体形成稳定的 结合物结合物。 4.SPDP4.SPDP（二硫化物交换）法（二硫化物交换）法首先在首先在EDACEDAC的介导下将多糖分子中的羧基与的介导下将多糖分子中的羧基与 胱氨酸上的氨基通过肽键结合，形成含有二胱氨酸上的氨基通过肽键结合，形成含有二 硫键（硫键（-S-S-S-S-）的衍生物，然后用二硫基苏）的衍生物，然后用二硫基苏 糖醇将双硫键还原成自由的
65、巯基（糖醇将双硫键还原成自由的巯基（-SH-SH）, ,即即 多糖多糖-SH-SH衍生物衍生物。另将另将SPDPSPDP与蛋白质载体反应形成与蛋白质载体反应形成蛋白质衍生物蛋白质衍生物最终两种衍生物在水溶液中微碱条件下由于二最终两种衍生物在水溶液中微碱条件下由于二 硫基和巯基之间的交换，形成稳定的含有二硫硫基和巯基之间的交换，形成稳定的含有二硫 键的键的多糖蛋白质复合物。多糖蛋白质复合物。六、结合疫苗的两个共同特征六、结合疫苗的两个共同特征 结构特征结构特征1.1.多糖抗原与载体蛋白质之间以化学共多糖抗原与载体蛋白质之间以化学共 价键牢固地接合。价键牢固地接合。2.2.多糖分子大小与载体蛋白的
66、结合比有多糖分子大小与载体蛋白的结合比有 利于刺激机体产生最强的针对多糖利于刺激机体产生最强的针对多糖 免疫应答。免疫应答。3.3.重复制备性及稳定性好，有效期较长。重复制备性及稳定性好，有效期较长。4.4.作为多价或单价疫苗易于标准化。作为多价或单价疫苗易于标准化。六、六、 结合疫苗的两个共同特征结合疫苗的两个共同特征 功能特征功能特征1.1.多糖蛋白质结合疫苗无毒、安全。多糖蛋白质结合疫苗无毒、安全。2.2.注射机体后能同时诱发细胞免疫和细注射机体后能同时诱发细胞免疫和细 胞依赖性免疫，血清中存在高滴度的杀胞依赖性免疫，血清中存在高滴度的杀 菌抗体。菌抗体。3.3.能增强婴幼儿对细菌多糖的
67、免疫应答。能增强婴幼儿对细菌多糖的免疫应答。4.4.对某些细菌衍生物载体蛋白不产生加强对某些细菌衍生物载体蛋白不产生加强 免疫反应。免疫反应。检定项目检定项目检定指标检定指标已二酰肼含量已二酰肼含量16-45g/ml16-45g/ml氰化物残留量氰化物残留量10ng/mg10ng/mg多糖含量多糖含量28g/ml28g/ml蛋白含量蛋白含量48g/ml48g/ml多糖蛋白质比值多糖蛋白质比值0.30-0.590.30-0.59高分子结合物含量高分子结合物含量80%-100%80%-100%Kd Kd 值值0.200.20Kd Kd 值值0.200.20回收率回收率 60%60%EDACEDAC
68、残留量残留量10mol/L10mol/L热原检查热原检查0.025g/kg0.025g/kg细菌内毒素细菌内毒素5EU/g5EU/g结合疫苗检定项目及指标结合疫苗检定项目及指标荚膜多糖结合疫苗荚膜多糖结合疫苗 菌体多糖结合疫苗菌体多糖结合疫苗 型流感嗜血杆菌结合疫苗型流感嗜血杆菌结合疫苗 绿脓杆菌绿脓杆菌OSP-TTOSP-TT结合疫苗结合疫苗 肺炎球菌结合疫苗肺炎球菌结合疫苗 副伤寒杆菌副伤寒杆菌OSP-TTOSP-TT结合疫结合疫苗苗 ACAC群脑膜炎球菌结合疫苗群脑膜炎球菌结合疫苗 大肠杆菌大肠杆菌0157:HT0157:HT结合疫苗结合疫苗 艾希氏大肠杆菌结合疫苗艾希氏大肠杆菌结合疫苗
69、大肠杆菌大肠杆菌01110111结合疫苗结合疫苗 伤寒伤寒ViVi结合疫苗结合疫苗 痢疾结合疫苗痢疾结合疫苗 肺炎克雷伯杆菌结合疫苗肺炎克雷伯杆菌结合疫苗 0101霍乱弧菌结合疫苗霍乱弧菌结合疫苗甲乙型及变异链球菌结合疫苗甲乙型及变异链球菌结合疫苗 O139O139霍乱弧菌结合疫苗霍乱弧菌结合疫苗 新型隐球菌结合疫苗新型隐球菌结合疫苗 金黄色葡萄球菌结合疫苗金黄色葡萄球菌结合疫苗 七、结合疫苗的使用和发展现状七、结合疫苗的使用和发展现状八、结合疫苗的研究方向八、结合疫苗的研究方向1.1.已逐渐扩展到真菌、寄生虫、人体分泌的激素更为广泛的已逐渐扩展到真菌、寄生虫、人体分泌的激素更为广泛的 结合疫
70、苗范围。结合疫苗范围。2.2.由于其接种效果在儿童中尤为显著，更是儿童疫苗研制的由于其接种效果在儿童中尤为显著，更是儿童疫苗研制的 一个热点。一个热点。3.3.免疫细胞被激活不仅需要有效抗原刺激，同时需要多种刺免疫细胞被激活不仅需要有效抗原刺激，同时需要多种刺 激信号，而这种信号部分来源于细胞因子，怎样将结合疫激信号，而这种信号部分来源于细胞因子，怎样将结合疫 苗与细胞因子联合应用，以达到有效免疫的效果是今后的苗与细胞因子联合应用，以达到有效免疫的效果是今后的 研究方向之一。研究方向之一。4.4.发展和使用更具免疫活力的蛋白质载体将是新的焦点，在发展和使用更具免疫活力的蛋白质载体将是新的焦点，
71、在H H ib ib结合疫苗基础研究中，不同载体蛋白，三次免疫后血清结合疫苗基础研究中，不同载体蛋白，三次免疫后血清 抗体水平高于同一载体蛋白的结合疫苗（不同载体蛋白结抗体水平高于同一载体蛋白的结合疫苗（不同载体蛋白结 合同一多糖时激活的合同一多糖时激活的THTH细胞的克隆系多于单一载体蛋白）。细胞的克隆系多于单一载体蛋白）。九、存在问题九、存在问题1.1.作为一个单一多糖疫苗基础上进一步化学结合作为一个单一多糖疫苗基础上进一步化学结合 的疫苗，其制造成本较高，发展受到一定限制。的疫苗，其制造成本较高，发展受到一定限制。2.2.在具体化学合成中还存在许多问题，其中如多糖在具体化学合成中还存在许多问题，其中如多糖 和载体蛋白质在结合中均存在自身交联而变形，和载体蛋白质在结合中均存在自身交联而变形， 产生一种新抗原（副反应物）的可能，如何控制产生一种新抗原（副反应物）的可能，如何控制 它的发生还是一个比较棘手的问题。它的发生还是一个比较棘手的问题。
