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1、第五节第五节 乙肝五项指标检测乙肝五项指标检测 （ELISA双抗体夹心法）双抗体夹心法）一、目的和要求一、目的和要求掌握乙肝五项指标检测的掌握乙肝五项指标检测的ELISA方法。方法。二、内容二、内容（一）原理（一）原理 乙型肝炎的微生物学检查中以抗原抗体检测最常用，其中尤以酶联免疫吸附试验（ELISA）为主，采用双抗体夹心法（一步法）。如乙肝表面抗原（HBsAg）检测：包被马抗-HBs的单克隆抗体于微孔板上，血清标本中HBsAg与其结合后，再加入辣根过氧化酶（HRP）标记的抗-HBs，结果形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，加入酶的底物后使底物显色。（二）材料（二）材料1.疑似乙型肝炎患者待检血清
2、。2.检测HBV“两对半”血清标志（HBsAg）的ELISA试剂盒：包被有相应抗体或抗原的反应条，酶结合物，阳性与阴性对照，洗涤液，显色剂A、B，终止液。（三（三）操作方法）操作方法参照所购试剂盒的操作说明书进行1.乙肝表面抗原（HBsAg）检测（1）每孔加待测血清50l，每板设HBsAg阳性、阴性及空白对照各一孔；再向每孔加入酶结合物50l（空白孔不加），用不干胶封孔后，37水浴30min。（2）弃去孔内液体，用洗涤液注满每孔，弃去拍干，反复5次。（3）每孔加显色剂A、B各一滴，37孵育10min后加终止液一滴（2mol/L H2SO4，50l），终止反应。结结果判断：果判断：（1）目测法：
3、阳性对照呈蓝色、阴性及空白对照为无色，以此为依据来判断标本孔。（2）比色法：以空白孔调零，用酶标仪测492 nm吸光度，读取各孔A值，以标本吸光度A值/阴性对照吸光度A值 2.1者判为阳性。2.乙型肝炎病毒表面抗体（抗-HBs）、e抗原（HBeAg）检测 取出相应检测试剂盒中的包被板（或条） 进行同1的操作，结果观察亦同1（略）。3.乙型肝炎病毒核心抗体（抗-HBc）、e抗体（抗-HBe）检测（1）抗-HBc检测 先用生理盐水将待测血清作1:30稀释，然后取50l加入相应的包被板（或条）中，同时设阳性、阴性及空白对照各一孔（对照血清不必稀释）；再向每孔加入酶结合物50l（空白孔不加），再进行同1的操作。但结果观察需反看：目测法是以不显色（无色）孔为阳性；比色法是以标本吸光度A值0.5N（阴性对照值）为阴性，标本吸光度A值0.5N者判为阳性。（2）抗-HBe检测 取出相应的包被板（或条），每孔加待测血清50l，同时设立对照，每孔加中和试剂50l（试剂盒中配备），再加入酶结合物50l（空白孔不加），然后进行同抗-HBc检测的操作过程，结果观察亦同抗-HBc，需反看。三、作业三、作业撰写实验小论文1篇。四、思考题四、思考题简述乙肝五项指标各自的医学意义？ （黄升海）
