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1、 第十一章第十一章 Chapter11Chapter11疾病产生的分子基础疾病产生的分子基础 MolecularBasisofDiseasesFormation 1基因结构与表达异常与疾病基因结构与表达异常与疾病人类疾病如白血病、恶性肿瘤、糖尿病、神经退行性疾病、心脑血管、高血压等的发生和发展都涉及到有关蛋白质及其复合物的结构、功能和相互作用异常。人体内蛋白质蛋白质分子结构和功能的异常是疾病的发生和发展的主要原因 。2基因结构与表达异常与疾病基因结构与表达异常与疾病细胞微环境的变化，包括基因甲基化的变异以及各种特定基因表达的异常都和疾病发生有关。越来越多的证据显示基因表达的异常将导致各种疾病的
2、发生，尤其是肿瘤形成。3基因结构与表达异常与疾病基因结构与表达异常与疾病人的基因组中有相当一部分基因，甚至染色体片段，在精子或卵细胞形成过程中，会因某种结构修饰而不能表达，称为基因印迹基因印迹（geneticimprinting）。这种在生物进化中形成的、有规律而又受控的基因失活是机体中基因表达调节的一种重要方式。基因印迹的异常往往会导致多种遗传性疾病。4一、一、基因结构与表达异常与疾病发生基因结构与表达异常与疾病发生 1 1基因结构改变基因结构改变 2细胞间信号异常细胞间信号异常3细胞内因素细胞内因素5(一) 基因突变的多种类型1.点突变点突变是单个碱基的改变2.缺失缺失是一个或多个核苷酸的
3、丢失3.插入插入是一个或多个核苷酸的增加4.倒位倒位是一段核苷酸序列方向倒转5.基因突变还分为配子突变配子突变与体细胞突变体细胞突变6.动态突变动态突变指串联重复拷贝数随世代的传递而改变6基因突变基因突变由于体内外各种因素改变了某基因特定由于体内外各种因素改变了某基因特定的的DNA序列碱基组成和排列顺序，导致序列碱基组成和排列顺序，导致DNA一级结构发生改变，改变了基因结一级结构发生改变，改变了基因结构；其分子机制可以是替换、插入或缺构；其分子机制可以是替换、插入或缺失，因而产生不同的突变类型。失，因而产生不同的突变类型。7基因突变基因突变的类型的类型1.1.点突变点突变: :单个碱基的改变单
4、个碱基的改变 在基因一级结构的某个位点上，一种碱基在基因一级结构的某个位点上，一种碱基被另一种碱基取代。被另一种碱基取代。分为：分为： 转换转换 （transitiontransition） 颠换颠换 （transversiontransversion）8基因突变的类型2.2.缺失（缺失（delelationdelelation）是一个或多个核苷酸的丢失：在基因一级结构中某个位点上，一个核苷酸或一段核苷酸序列丢失造成的基因结构改变。3.插入（插入（insertioninsertion）9基因突变的类型4.倒位倒位是一段核苷酸序列方向倒转：基因内部的DNA序列重组，使一段DNA序列的方向倒转。5
5、.配子突变配子突变与体细胞突变体细胞突变6.动态突变动态突变指串联重复拷贝数随世代的传递而改变（dynamicmutation）10(1)(1)碱基置换突变碱基置换突变 ( (substitution mutation)substitution mutation)(二) 不同的基因突变引起不同的遗传效应a. a. 同义突变 (consense mutation)b.错义突变(missensemutation)c.无义突变(nonsensemutation)d.终止密码子突变或延长突变e.起始密码子突变(initiationcodonmutation)f.非编码序列点突变(pointmutati
6、oninnoncodingsequence)11同义突变(same sense mutation)：密码子发生改变, 但所编码的氨基酸不变。例如：CUUCUCCUG亮氨酸12错义突变错义突变（missensemutation）指DNA改变后mRNA中相应密码子发生改变，编码另一种氨基酸，使蛋白质中的氨基酸发生改变。错义突变结果产生异常蛋白质和酶。但也有不少基因由于错义突变产生部分降低活性和异质组分的酶，不完全抑制了催化反应，这种基因称为漏出基因漏出基因（leakygene）。）。有些错义突变不影响蛋白质或酶的生物活性，不表现出明显的表型效应。13由于一对或几对碱基对的改变而使决定某一氨基酸的密
7、码子变成一个终止密码子的基因突变叫无义突变无义突变 (nonsense mutation) 。亮氨酸的密码子亮氨酸的密码子UUA，中间的，中间的U变为变为A这样这样一个碱基变化就会成为（终止密码子）一个碱基变化就会成为（终止密码子）UAA。酪氨酸的密码子是UAC，置换突变使UAC变为密码子UAG后翻译便到此停止。14当当DNA分子中一个终止密码发生突变，成分子中一个终止密码发生突变，成为编码氨基酸的密码子时，多肽链的合成为编码氨基酸的密码子时，多肽链的合成将继续进行下去，肽链延长直到遇到下一将继续进行下去，肽链延长直到遇到下一个终止密码子时方停止，因而形成了延长个终止密码子时方停止，因而形成了
8、延长的异常肽链，这种突变称为的异常肽链，这种突变称为终止密码突变终止密码突变（terminationcodonmutation）或或延长突延长突变变（elongtionmutation）。15当基因内部不同位置上的不同碱基发生了两次突变，其中一次抑制了另一次突变的遗传效应，这种突变称为抑制基因抑制基因突变（突变（suppressorgenemutation）。如单纯6谷氨酸缬氨酸，则可产生HbS病，往往造成死亡。但HbHarlem临床表现却较轻，即73的突变抑制了6突变的有害效应。16(2)缺失或插入突变(deletionorinsertionmutation)a.密码子缺失或插入(codon
9、deletionorcodoninsertion)b.移码突变(frame-shiftmutation)c.整基因或大片段缺失(deletionofawholegeneoralargesegment)(3)融合突变(fusionmutation)细胞减数分裂时同源染色体不等交换而致基因间错位配对，产生两种含不同等位基因的染色体。17移码突变移码突变(frame-shiftmutation)：指DNA链上插入或丢失1个、2个甚至多个碱基（但不是三联体密码子及其倍数），在读码时，由于原来的密码子移位，导致在插入或丢失碱基部位以后的编码都发生了相应改变。移码突变造成的肽链延长或缩短，取决于移码终止密
10、码子推后或提前出现。18(4) (4) 基因突变影响基因突变影响 hnRNA hnRNA 的剪接的剪接基因突变发生在hnRNA的一级结构上特定的剪接位点上，导致hnRNA的剪接错误，产生异常的mRNA，最终产生异常的蛋白表达产物，改变生物性状。19(三三)结构基因改变导致蛋白质变化引起疾病结构基因改变导致蛋白质变化引起疾病1.血红蛋白病(hemoglobinopathy)：血红蛋白(hemoglobin,Hb)的结构特点珠蛋白(globin)基因的时、空特异性表达20血红蛋白结构血红蛋白结构血血红蛋白是由蛋白是由4条条肽链（两个（两个和两个和两个链）组成成的。每条的。每条肽链都都类似于肌似于肌
11、红蛋白的蛋白的肽链，都，都结合合一个血一个血红素。素。血红蛋白的脱氧（血红蛋白的脱氧（T）和氧合（）和氧合（R）构象在氧）构象在氧的亲和性方面有很大区别。由于结构上的相互的亲和性方面有很大区别。由于结构上的相互作用是与它的三级和四级结构有关，所以血红作用是与它的三级和四级结构有关，所以血红蛋白在结合氧的过程中显示出别构效应和协同蛋白在结合氧的过程中显示出别构效应和协同性。性。21血血红蛋白分子一蛋白分子一级结构上的构上的轻微差微差别就可能就可能导致功能上的很大不同，致功能上的很大不同，正常成年人血正常成年人血红蛋白中的蛋白中的链的第的第六位的谷氨酸残基被六位的谷氨酸残基被缬氨酸取代就氨酸取代就
12、会会导致致镰刀形刀形细胞胞贫血病的异常血血病的异常血红蛋白蛋白HbS HbS 的生成。的生成。22血红蛋白病血红蛋白病镰刀形细胞贫血症镰刀形细胞贫血症2324(1) (1) 人人-珠蛋白基因簇及珠蛋白基因簇及珠蛋白基因结构珠蛋白基因结构25(2) (2) 人人-珠蛋白基因簇及珠蛋白基因簇及珠蛋白基因结构珠蛋白基因结构26血红蛋白病类型血红蛋白病类型异常血红蛋白异常血红蛋白: : 珠蛋白结构珠蛋白结构( (质质) )变异，导致贫血。变异，导致贫血。地中海贫血地中海贫血: : 珠蛋白合成珠蛋白合成( (量量) )减少，又称珠蛋减少，又称珠蛋白合成障碍性贫血。白合成障碍性贫血。27( (四四) )
13、常见单基因病：常见单基因病：疾病名称疾病名称发病频率发病频率()遗传方式遗传方式致病基因致病基因典型症状典型症状血友病血友病A0.1X连锁连锁凝血因子凝血因子不规则出血不规则出血血友病血友病B0.03X连锁连锁凝血因子凝血因子不规则出血不规则出血杜氏肌营养不良杜氏肌营养不良0.3X连锁连锁肌营养因子肌营养因子肌萎缩肌萎缩贝氏肌营养不良贝氏肌营养不良0.05X连锁连锁肌营养因子肌营养因子肌萎缩肌萎缩脆性脆性X综合征综合征0.5X连锁连锁FMR1智力障碍智力障碍舞蹈病舞蹈病0.5常染色体显性常染色体显性舞蹈病因子舞蹈病因子痴呆痴呆神经纤维神经纤维0.4常染色体显性常染色体显性NF-1,2癌变癌变珠
14、蛋白生成障碍性贫血珠蛋白生成障碍性贫血0.05常染色体隐性常染色体隐性珠蛋白基因簇珠蛋白基因簇贫血贫血镰刀细胞贫血镰刀细胞贫血0.1常染色体隐性常染色体隐性珠蛋白基因珠蛋白基因贫血贫血,局部缺血局部缺血苯丙酮酸尿苯丙酮酸尿0.1常染色体隐性常染色体隐性苯丙氨酸羟基化酶苯丙氨酸羟基化酶无苯丙酮酸代谢能力无苯丙酮酸代谢能力囊性纤维化囊性纤维化0.4常染色体隐性常染色体隐性CFTR进行性肺损伤及其他进行性肺损伤及其他28基因突变类型基因突变类型异常异常Hb氨基酸变化氨基酸变化临床特征临床特征错义突变错义突变HbShuangfeng27GluLys(GAGAAG)不稳定Hb病HbS6GluVal(GA
15、GGUG)镰刀型细胞贫血HbBibba136LeuPro(CUGCCA不稳定Hb病无义突变无义突变HbMckeesRocks145Tyr终止(UAUUAA)不稳定Hb病终止密码突变终止密码突变HbConstantSpring142UAACAA-地贫(延长：142Gln-173UAA)密码子缺失密码子缺失HbGunHill9195缺失不稳定Hb病密码子插入密码子插入HbGrady118与119间插入3个氨基酸无明显症状移码突变移码突变HbTak147UAAACUAA-不稳定Hb病-158UAA(Thr)融合突变融合突变HbLepore-Boston87(Gln)-116(His)-地贫HbKen
16、ya81(Leu)-86(Ala)-地贫29囊性纤维化病囊性纤维化病(cysticfibrosis,CF)30囊囊 性性 纤纤 维维 化化 病病囊性纤维化跨膜传导调节蛋白囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTCR)的基的基因突变所致，产生缺陷型蛋白，致使使氯离子的因突变所致，产生缺陷型蛋白，致使使氯离子的转运障碍，黏液在呼吸道黏膜内淤滞，黏膜形成转运障碍，黏液在呼吸道黏膜内淤滞，黏膜形成囊性增生，造成呼吸道堵塞；因反复感染，导致囊性增生，造成呼吸道堵塞；因反复感染，导致患者呼吸衰竭而死亡。患者呼吸衰竭而死亡。3132GenetherapyofCF将重组将重组CFTCR基因基因cDNA-病毒载体，用
17、涂病毒载体，用涂布鼻腔、或喷雾吸入气管及肺部等方法，转布鼻腔、或喷雾吸入气管及肺部等方法，转入患者呼吸道上皮细胞中，获得正常入患者呼吸道上皮细胞中，获得正常CFTCR基因的表达，纠正基因的表达，纠正Cl转运缺陷，转运缺陷，减少黏液分泌。减少黏液分泌。33( (五五) )细胞间信号异常导致基因表达异常引起疾病细胞间信号异常导致基因表达异常引起疾病人体各细胞间通过激素、神经递质、旁分泌信号人体各细胞间通过激素、神经递质、旁分泌信号等保持细胞间的联系，调节彼此的代谢。基因表等保持细胞间的联系，调节彼此的代谢。基因表达也受到细胞间信号的调控。达也受到细胞间信号的调控。AFP AFP 接受异常的细胞增殖
18、信号成为肝癌发生的重接受异常的细胞增殖信号成为肝癌发生的重要因素。要因素。粉尘刺激粉尘刺激 肺支气管上皮、肺泡巨噬细胞肺支气管上皮、肺泡巨噬细胞 分泌分泌TGF-TGF-1 1 成纤维细胞成纤维细胞 促细胞分裂和促细胞分裂和ECM ECM 蛋白基因表达蛋白基因表达 ECM ECM 增加增加 矽肺发生矽肺发生34（六）细胞内因素导致基因表达异常引起疾病（六）细胞内因素导致基因表达异常引起疾病异常的细胞内信号异常的细胞内信号高血糖DAGPKCACEAng病原生物基因的体内表达病原生物基因的体内表达异常的异常的DNADNA甲基化甲基化 hCG5转录起始区低甲基化低甲基化非滋养层细胞hCG 受体结合
19、cAMP Tumor 35二、二、基因结构和表达与疾病的研究策略基因结构和表达与疾病的研究策略1通过结构分析确定基因变异通过结构分析确定基因变异 核糖核酸酶切分析、杂合双链分析、核糖核酸酶切分析、杂合双链分析、 化学切割错配、酶促切割错配化学切割错配、酶促切割错配3通过功能学研究确定致病基因通过功能学研究确定致病基因转基因技术、基因敲除、转基因技术、基因敲除、反义技术、基因诱导超表达反义技术、基因诱导超表达2基因表达水平分析基因表达水平分析差异显示、抑制消减杂交、基因表达系列分析差异显示、抑制消减杂交、基因表达系列分析36核糖核酸酶切分析核糖核酸酶切分析基本原理基本原理:在一定条件下，异源双链
20、核酸分子RNA：RNA或RNA：DNA中错配碱基可被核糖核酸酶RNase识别并切割，通过凝胶电泳分析酶切片段的大小，即可确定错配的位置。37核糖核酸酶切分析核糖核酸酶切分析（RNase cleavageRNase cleavage） Watterson et al., J Clin Microbiol (1998) Mutation scanning Nested PCR of wild type and patient Inner promoter primers SP6 and T7 In vitro transcription of each RNA strand RNA:RNA het
21、eroduplexes RNA proficiency required Cleave with RNase 1 and T1 (not RNase A) Gel detection; could include isotope incorporation38核糖核酸酶切分析（核糖核酸酶切分析（RNase cleavageRNase cleavage）缺点：缺点：当RNA探针上错配的碱基为嘌呤嘌呤时，核糖核酸核糖核酸酶切割效率低甚至不切割；酶切割效率低甚至不切割；分析分析DNADNA的一条链，突变检出率为的一条链，突变检出率为 30%30%；同时；同时分析分析DNADNA的两条链，突变检出率为
22、的两条链，突变检出率为 70%70%；需要制备特异性的需要制备特异性的RNA探针39杂合双链分析法杂合双链分析法（heteroduplexanalgsis,HA）直接在非变性凝胶上分离杂交的突变型直接在非变性凝胶上分离杂交的突变型-野野生型生型DNA双链。由于突变型和野生型双链。由于突变型和野生型DNA形成形成的异源杂合双链的异源杂合双链DNA在其错配处会形成单链环在其错配处会形成单链环形突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相形突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应同源双链应同源双链DNA不同的迁移率。不同的迁移率。40杂合双链分析杂合双链分析（ heteroduplexes analysi
23、sanalysis） Lanes 10 and 11 show the mixture of M and S samples with the control samples where besides the homoduplex line we are able to observe a heteroduplex line (top arrow).41化学切割错配法化学切割错配法（Chemicalcleavageofmismatch,CCM）基本原理基本原理：将待测含DNA片段与相应的野生型DNA片段或RNA片段混合变性杂交，在异源杂合的双链核酸分子中，错配的C能被羟胺和哌啶切割，错配的T
24、能被四氧化锇切割，经变性凝胶电泳可确定是否存在突变。42化学切割错配法化学切割错配法特点特点：突变检出率高；如使用荧光检测系统，灵敏度较高；可检测长度达2Kb的核酸片段；步骤多、费时、有毒；碳化二亚胺检测法43酶促切割错配酶促切割错配(enzymemismatchcleavage)polymorphismscanbeidentifiedbyEMCinDNADNAheteroduplexes.T4EndonucleaseVIIsamplesarePCRamplified,denaturedandhybridizedtocreateDNADNAheteroduplexesEnzymescleave
25、adjacenttothemismatchandproductsareresolvedviagelorcapillaryelectrophoresis.thecleavageenzymesoftennickcomplementaryregionsofDNAaswell.(increasesbackgroundnoise,lowersspecificity,reducesthepoolingcapacityoftheassay)44RFLP-RestrictionFragmentLengthPolyhmorphism4546RFLPs47Microsatelliterepeats48差异显示技术
26、(mRNAdifferentialdisplayreversetranscriptionchainreaction,DDRT-PCR)在不同的生长时期、在个体的发育与分化的不同阶段、在生物体对疾病的反应以及不同的环境下调控基因的表达是不同的，这就是基因的差别表达（differentialexpression）。49原理：利用两组特殊的引物对差别表达的基因进行扩增。33端引物端引物：利用mRNA的polyA尾巴设计。根据mRNA结构分析知道，polyA尾巴之前的两个碱基只有12种可能的排列组合：50根据这12种排列组合，设计12种不同的引物，这样就将所有mRNA分成了12组。这些引物由1112个
27、T及两个其它的碱基组成，用通式5-T11MN或5-T12MN表示，M为A、G、C的任一种，N为A、G、C、T的任一种。这种引物称锚定引物。5端引物：5端为10个碱基（10-mer）组成的随机引物。每一个随机引物都可能与总mRNA中的某一些分子发生杂交，杂交位点也可能在mRNA的不同位点上。用一种3锚定引物和一种5随机引物进行扩增，可获得50100条100500bp的DNA扩增带。为了要寻找更多的DNA差异带，应使用全部的12种锚定引物以及尽可能多的5随机引物。5152抑制性差减杂交抑制性差减杂交(SSH) - Diatchenko L, et al. PNAS 1996; 93:6025-60
28、30Suppression subtractive hybridization: a method for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries53 抑制性差减杂交抑制性差减杂交 (suppressive subtractive hybridization, SSH)原理原理SSH是差减杂交与是差减杂交与PCR结合的快速分离差异基因结合的快速分离差异基因的方法。运用杂交动力学原理，丰度高的单链的方法。运用杂交动力学原理，丰度高的单链DNA退退火时产生同源杂交的速度快于丰度
29、低的单链火时产生同源杂交的速度快于丰度低的单链DNA，使，使不同丰度的单链不同丰度的单链DNA得到均衡得到均衡；抑制；抑制PCR利用链内退利用链内退火优于链间退火的优点，使非目的基因片段两端反向重火优于链间退火的优点，使非目的基因片段两端反向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构复序列在退火时产生类似发卡的互补结构,无法作为模无法作为模板与引物配对，选择性地抑制了非目的基因片段的扩增，板与引物配对，选择性地抑制了非目的基因片段的扩增，从而使从而使目的基因得到富集、分离。目的基因得到富集、分离。54n方法方法提提取取实实验验组组和和对对照照组组mRNA合合成成双双链链cDNA，经经识别识别 4
30、碱基的限制性内切酶切割碱基的限制性内切酶切割实验组实验组cDNA平均分为平均分为2份，分别连接份，分别连接2个接头个接头进行进行2轮差减杂交和抑制性轮差减杂交和抑制性PCR获得富集的目的基因获得富集的目的基因55 抑制性抑制性 差减杂交差减杂交 (SSH) 流程图流程图56 检测组检测组(Tester)含目的基因含目的基因cDNA，加接头，加接头驱逐组驱逐组(Driver)不含目的基因不含目的基因cDNA，不加接头，不加接头*接头接头含含PCR 引物引物正向正向SSH:易感者易感者(Tester) +不易感者不易感者(Driver)易感者特异表达或高表达基因易感者特异表达或高表达基因反向反向S
31、SH:不易感者不易感者(Tester) +易感者易感者(Driver)不易感者特异表达或高表达基因不易感者特异表达或高表达基因抑制性差减杂交抑制性差减杂交(SSH) 57优点优点 采用两次差减杂交和采用两次差减杂交和PCRPCR，保证了高特保证了高特异性异性 ( (假阳性率可降至假阳性率可降至6 6); ); 在杂交过程中可在杂交过程中可使不同丰度基因均衡化，获得低丰度差异表达使不同丰度基因均衡化，获得低丰度差异表达基因基因; ;操作相对简便，是目前分离新基因的主操作相对简便，是目前分离新基因的主要方法要方法缺点缺点 起始材料需要起始材料需要 g级量级量mRNA;SSHSSH差减差减克隆片段较
32、小，获取克隆片段较小，获取cDNAcDNA全长序列有一定难度全长序列有一定难度 抑制性差减杂交抑制性差减杂交(SSH)58Elkeles A,et al. Mol Cell Biol 1999; 19: 2594-2600 The c-fos proto-oncogene is a target for transactivation by the p53 tumor suppressor 采用采用SSH法证实法证实, 在在p53介介导的细胞凋亡过程中，导的细胞凋亡过程中，c-fos是是p53转转录刺激的靶基因录刺激的靶基因, ,从而提供了这两种重要调控蛋白相互作用的直接从而提供了这两种重要调
33、控蛋白相互作用的直接依据依据抑制性差减杂交抑制性差减杂交( (SSH)SSH)59nKostic C and Shaw PH. Oncogene 2000; 19:3978-3987nIsolation and characterization of sixteen novel p53 response genesn通过通过SSH比较了比较了p53缺失和含缺失和含p53的结肠癌细胞株间基因差异表的结肠癌细胞株间基因差异表达，发现达，发现16个个p53依赖的下游靶基因依赖的下游靶基因 抑制性差减杂交抑制性差减杂交( (SSH)SSH)60基因表达系列分析基因表达系列分析(SerialAnalys
34、isofGeneExpression, SAGE) 是一种用于定量、高通量基因表达分析的实是一种用于定量、高通量基因表达分析的实验方法验方法(Velculescu et al., 1995)。SAGE原理原理: 分分离每个转录本的特定位置的较短的单一的序列标签离每个转录本的特定位置的较短的单一的序列标签（约（约9-14个碱基对），这些短的序列被连接、克隆个碱基对），这些短的序列被连接、克隆和测序，特定的序列标签的出现次数就反应了对应和测序，特定的序列标签的出现次数就反应了对应基因的表达丰度。基因的表达丰度。61Serialanalysisofgeneexpression(SAGE)技术流程技术
35、流程反转录反转录酶切酶切连接连接测序测序单条测序对单条测序对3040条条EST测序测序分析分析由于采样量大大提高，可对低表达基因进行分析：由于采样量大大提高，可对低表达基因进行分析：基因表达量分析、寻找新基因等等基因表达量分析、寻找新基因等等实实实实验验验验步步步步骤骤骤骤较较较较长长长长要要要要求求求求较较较较高高高高62转基因技术转基因技术指在生物基因组中带有插入或整合入指在生物基因组中带有插入或整合入的外源基因，生物个体能将它一传给的外源基因，生物个体能将它一传给后代，并表达出该基因的生物活性物后代，并表达出该基因的生物活性物质，从而使受体生物获得新的性状。质，从而使受体生物获得新的性状
36、。63TransgenicAnimalAnimalinwhichasegmentofDNAhasbeenphysicallyinsertedintothegenome.ThegenomeofallcellsoftheorganismcontainstheDNAsegment.TheDNAsegmentispresentinthegermlinesoitcanbetransmittedtoprogenyasaMendeliantrait.64RetroviralMediatedGeneTransferMoMuLV Producing CellsMouseembryosInsertion of v
37、iral DNA containingtransgene into embryosTransgenic Mouse65X1-cell pronuclear stagemouse embryo.PMS + HCGto superovulate Pregnant Foster MotherOviduct Transfer+2-cell stage embryoHolding PipetteInjection Pipette66基因敲除（基因敲除（Knock outKnock out）67Step1.Isolatedevelopingembryoatblastocyststage.Thisembry
38、oisfromastrainofmicewithgrayfur.68Step2.Removeembryonicstemcellsfromgray-furblastocyst.Growstemcellsintissueculture.69Step3.Transfectstemcellswithhomologousrecombinationconstruct.SelectforhomologousrecombinationbygrowingstemcellsinneomycinandGCV.+neomycin+gancyclovir70Step4.Removehomologouslyrecombi
39、nedstemcellsfrompetridishandinjectintoanewblastocystthatwouldhaveonlywhitefur.71Step5.Implantseveralchimericblastocystsintopseudo-pregnant,whitefurmouse.72Step6.Motherwillgivebirthtoarangeofmice.Somewillbenormalwhitefurmicebutotherswillbechimericmice.Chimericmicehavemanyoftheircellsfromtheoriginalwh
40、itefurblastocystbutsomeoftheircellswillbederivedfromrecombinantstemcells.Furcellsfromrecombinantstemcellsproducegraypatcheswhichareeasilydetected.73Step7.Matethechimericmicewithwild-typewhitefurmice.Ifthegonadsofthechimericmicewerederivedfromrecombinantstemcells,alltheoffspringwillhavegrayfur.Everyc
41、ellingraymiceareheterozygousforthehomologousrecombination.74Step8.Mateheterozygousgraymice(+/H)andgenotpyethegrayoffspring.Identifyhomozygousrecombinants(H/H)andbreedthemtoproduceastrainofmicewithbothallelesknockedout.Thepurebreedingmousestrainisaknockoutmouse.knockoutmouse75核酶技术确定基因在疾病中的作用核酶技术确定基因在
42、疾病中的作用1.RNA分子，催化核糖体RNA中内含子的自我拼接；除了催化RNA的剪切，还可催化DNA的剪切、RNA的聚合、RNA链的复制等。2.优点:其底物的碱基配对特异性。核酶与底物结合常形成“发夹”结构或“锤头”结构。3.设计核酶特异性地结合于靶点，以其本身酶活性进行剪切。7677WhatisRNAi?RNA干扰（干扰（RNAinterference，RNAi）内源性或外源性双链内源性或外源性双链RNA介导的细胞内介导的细胞内mRNA发发生特异性降解，导致靶基因的表达沉默，产生相生特异性降解，导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表型的缺失现象。应的功能表型的缺失现象。78转录后基因表达抑制
43、现象的发现转录后基因表达抑制现象的发现CHS GeneCHS Gene矮牵牛花矮牵牛花(Jorgensen, R, 1990)79RNAi 现象的发现现象的发现线虫（线虫（C. elegans)C. elegans)(Fire, 1998)+Par-1 Gene DisruptionExpressionDownDouble Strand RNA线线 虫，虫， 果果 蝇蝇微生物，微生物， 植植 物物 80dsRNADicer cleavage of dsRNAsiRNARNAi 抑制基因表达的机理抑制基因表达的机理siRNA associatedWith RISC complexCell Mem
44、brane5POH3Target mRNA81RNA干扰干扰(RNAinterference,RNAi)RNAi是将一段双链的RNA序列导入机体或细胞中,机体或细胞中与之有同源序列的基因的表达将会受到抑制,甚至表达受到完全抑制82基因诱导超表达技术确定基因在疾病中的作用将目的基因全长序列与高活性启动子或组织将目的基因全长序列与高活性启动子或组织特异性启动子融合，经过转化后，在诱导剂特异性启动子融合，经过转化后，在诱导剂的作用下或在特定的组织细胞中，目的基因的作用下或在特定的组织细胞中，目的基因超表达，相应的基因表达产物大量积累。比超表达，相应的基因表达产物大量积累。比较加入诱导剂前后的表型变化
45、，从而确定目较加入诱导剂前后的表型变化，从而确定目的基因在疾病发生中的作用。的基因在疾病发生中的作用。83三、三、疾病相关基因的功能克隆和定位克隆疾病相关基因的功能克隆和定位克隆1 1 疾病相关基因疾病相关基因2 2 功能克隆功能克隆3 3 定位克隆定位克隆84疾病相关基因与疾病单基因病(一个基因位点上的缺陷)多基因病(涉及两个以上的基因位点)染色体病(染色体结构与数目的改变)获得性基因病(遗传易感性或病原微生物)85功能克隆(Functionalcloning)以获得的蛋白质表达及功能信息为线索，以获得的蛋白质表达及功能信息为线索，分离鉴定出相应的基因，叫未知基因的分离鉴定出相应的基因，叫未
46、知基因的功能克隆。功能克隆。86 基因克隆基因克隆（genecloning)功能克隆功能克隆（functionalcloning）-根据特异蛋白质分离目的基因的策略根据特异蛋白质分离目的基因的策略表型克隆表型克隆（phenotypecloning）-根据特异根据特异mRNA分离目的基因的策略分离目的基因的策略 87 功能克隆功能克隆氨基酸序列核苷酸序列氨基酸序列核苷酸序列PCR特异蛋白质特异蛋白质目的基因目的基因抗体抗体基因文库筛选基因文库筛选评价评价优点优点 -在单基因性状的基因分离方面仍为在单基因性状的基因分离方面仍为常用常用策略策略缺点缺点 -特异蛋白质确定、鉴定及其纯化困难特异蛋白质确
47、定、鉴定及其纯化困难* -难以分离微量表达基因难以分离微量表达基因 -无法研究无无法研究无蛋白质蛋白质产物的基因产物的基因 -难以进行多基因控制性状的基因分离难以进行多基因控制性状的基因分离88通过蛋白质的抗原抗体反应分离鉴定未知基因通过蛋白质的抗原抗体反应分离鉴定未知基因基因转录后在核糖体上翻译合成蛋白质，基因转录后在核糖体上翻译合成蛋白质，形成核糖体形成核糖体-mRNA-蛋白质产物部分氨基酸蛋白质产物部分氨基酸序列的复合体，运用抗体与蛋白质产物的序列的复合体，运用抗体与蛋白质产物的免疫共沉淀反应，可以分离此复合体，进免疫共沉淀反应，可以分离此复合体，进而分离到而分离到mRNA，最终克隆到未
48、知基因最终克隆到未知基因。89西红柿女孩西红柿女孩一女孩患苯丙酮一女孩患苯丙酮一女孩患苯丙酮一女孩患苯丙酮尿症，不食尿症，不食尿症，不食尿症，不食“ “人人人人间烟火间烟火间烟火间烟火” ”，仅能，仅能，仅能，仅能吃西红柿。吃西红柿。吃西红柿。吃西红柿。智力智力发育不全、严重发育不全、严重的呕吐，皮肤、的呕吐，皮肤、毛发颜色变浅，毛发颜色变浅，虹膜颜色减退、虹膜颜色减退、尿、汗有特殊腐尿、汗有特殊腐臭。臭。目前以低苯目前以低苯目前以低苯目前以低苯丙氨酸饮食治疗。丙氨酸饮食治疗。丙氨酸饮食治疗。丙氨酸饮食治疗。90定位克隆定位克隆又称为又称为“逆向遗传学逆向遗传学”，始于，始于2020世纪世纪8
49、080年代后年代后期期利用遗传连锁或细胞学利用遗传连锁或细胞学定位技术将致病基因定定位技术将致病基因定位于染色体的特定区带。位于染色体的特定区带。定位：通过连锁分析找定位：通过连锁分析找出与目的基因紧密连锁出与目的基因紧密连锁的遗传标记在染色体上的遗传标记在染色体上的位置。的位置。克隆：从定位的染色体克隆：从定位的染色体区段内分离克隆所要的区段内分离克隆所要的基因，并进一步研究其基因，并进一步研究其功能。功能。疾病遗传标记，染色体定位基因序列mRNAcDNA蛋白质产物生物学功能 疾病疾病 基因基因功能功能91定位克隆：通过遗传标记定位克隆：通过遗传标记 ，先获得某一表型基因，先获得某一表型基因
50、在染色体上的定位在染色体上的定位 ，再在候选区域内选择已知基，再在候选区域内选择已知基因，进行致病突变的筛选因，进行致病突变的筛选 ，并获得，并获得cDNA及全基及全基因。因。 基本思路基本思路是通过连锁分析原理进行基因是通过连锁分析原理进行基因定位定位。 若多态标记与待定基因距离较远若多态标记与待定基因距离较远 ，则它们在，则它们在向子代传递时会发生自由分离向子代传递时会发生自由分离 ，呈，呈“连锁平衡连锁平衡”；反之；反之 ，则不发生自由分离，则不发生自由分离 ，而呈现，而呈现“共分离共分离”现象现象 ，即，即“连锁不平衡连锁不平衡”。据此可在染色体上定。据此可在染色体上定位与某一位与某一
51、DNA标记相连锁的基因。标记相连锁的基因。921.将基因定位将基因定位于染色体于染色体2. 特定区段特定区段2. 候选基因筛候选基因筛选鉴定选鉴定93定位克隆的主要步骤之一是将目标定位克隆的主要步骤之一是将目标基因定位于特定染色体上。基因定位于特定染色体上。主要方法：主要方法： 家系遗传调查分析法、染色体断裂点分析家系遗传调查分析法、染色体断裂点分析 （家系选择、分离分析、连锁分析家系选择、分离分析、连锁分析） 体细胞杂交法体细胞杂交法 核酸杂交技术核酸杂交技术 突变分析技术突变分析技术 94家系遗传分析法选择一个含有40多个能提供信息的减数分裂事件的三代以上的家系，要排除家系的异质性；除了对
52、照基本遗传表型的各种表现型的几率外，还要考虑外显不全；以数学计算机模型模拟分析；选择一定的遗传标记，进行基因分型，确定疾病基因在染色体上的位置。95基因连锁分析基因连锁分析连锁分析主要是应用限制酶片段长度多态性（连锁分析主要是应用限制酶片段长度多态性（RFLP）为遗）为遗传标志进行家系分析传标志进行家系分析在人类基因组中，平均约在人类基因组中，平均约200bp可发生一对变异可发生一对变异（称为（称为中心突变中心突变）中心突变造成了序列上的多态性，不少序列多态性发生在限中心突变造成了序列上的多态性，不少序列多态性发生在限制酶识别位点上，产生了限制酶酶切位点的多态性制酶识别位点上，产生了限制酶酶切
53、位点的多态性用该限制酶水解用该限制酶水解DNA就会产生长度不同的片段，称就会产生长度不同的片段，称RFLP。96定位候选克隆定位候选克隆该方法是定位克隆的进该方法是定位克隆的进一步发展一步发展将疾病相关基因定位于将疾病相关基因定位于染色体相关区域染色体相关区域该染色体区域得到若干该染色体区域得到若干候选基因候选基因进一步分析得到目的进一步分析得到目的cDNAcDNA蛋白质功能研究蛋白质功能研究疾病染色体定位若干候选基因确定目的基因蛋白质功能97cDNAcDNA筛选筛选染色体定位只是定位克隆的其染色体定位只是定位克隆的其中一步。由于中一步。由于DNADNA筛选、确认的困难筛选、确认的困难 ，是定
54、，是定位克隆策略的位克隆策略的“瓶颈瓶颈”。目前获得基因序列的方法大致有目前获得基因序列的方法大致有: :(1)(1)对对 500kb 500kb 的关键部位进行直接测序；的关键部位进行直接测序；(2)(2)比较基因组作图和测序；比较基因组作图和测序； (3)(3)基因结构特征分析；基因结构特征分析； (4)cDNA(4)cDNA捕获，主要有捕获，主要有pGpG岛捕捉层析法、岛捕捉层析法、 外显子捕捉法、直接筛选外显子捕捉法、直接筛选PCRPCR法等方法法等方法98cDNAcDNA筛选筛选直接法：用基因组直接法：用基因组DNADNA直接从直接从cDNAcDNA文库文库中筛选位于该基因组片段内的
55、中筛选位于该基因组片段内的cDNAcDNA。选择法：将基因组选择法：将基因组DNADNA固定在膜上，与固定在膜上，与总总cDNAcDNA或或cDNAcDNA文库的文库的PCRPCR产物杂交，找产物杂交，找到能杂交到膜上的到能杂交到膜上的cDNAcDNA片段，再用片段，再用PCRPCR扩增这些扩增这些cDNAcDNA片段。片段。99通过通过EST拼接拼接如：已知小鼠某基因在人当中有高度同源序列如：已知小鼠某基因在人当中有高度同源序列用该小鼠用该小鼠cDNAcDNA比对人的比对人的ESTEST数据库数据库得到一簇得到一簇ESTEST后，将相邻的后，将相邻的ESTEST通过相互重叠部通过相互重叠部分
56、进行拼接。分进行拼接。得到人对应的完整得到人对应的完整cDNAcDNA的序列后，两端设计引的序列后，两端设计引物在物在cDNAcDNA文库中进行文库中进行PCRPCR，得到该，得到该cDNAcDNA的克隆。的克隆。至此，与小鼠对应的人的该基因得以克隆出来。至此，与小鼠对应的人的该基因得以克隆出来。100基因芯片技术的应用基因芯片技术的应用使用传统方法寻找新基因，不仅需要投使用传统方法寻找新基因，不仅需要投入大量的资金，而且针对性不强，效率入大量的资金，而且针对性不强，效率低下，大部分工作繁琐重复低下，大部分工作繁琐重复。通过基因芯片分析正常组织和疾病组织通过基因芯片分析正常组织和疾病组织基因表
57、达情况的差异，往往能够从那些基因表达情况的差异，往往能够从那些表达异常的基因中发现新的致病基因。表达异常的基因中发现新的致病基因。101四、四、HGP与疾病相关基因的研究与疾病相关基因的研究102随随着着人人类类基基因因组组草草图图测测定定的的完完成成，宣宣告告了了“后后基基因因组组时时代代”的的到到来来。功功能能基基因因组组学学成成为为研研究究的的重重心心，蛋蛋白白质质组组学学的的研研究究受受到到了了空空前前的的关关注注，也也为为疾疾病病相相关基因的克隆创造了条件。关基因的克隆创造了条件。103同同一一种种细细胞胞或或组组织织，处处于于不不同同的的状状态态（生生理理与与病病理理等等），发发育
58、育的的不不同同阶阶段段，受受到到外外界界的的不不同同影影响响时时，都都可可能能使使细细胞胞中中蛋蛋白白质质的的情情况况产产生生相相应应的的变变化化，从从而而产产生生不不同同的的蛋蛋白白质质组组。蛋蛋白白质质组组学学关关注注和研究的就是这些变化。和研究的就是这些变化。104研究蛋白质与疾病相互关系的方法研究蛋白质与疾病相互关系的方法ELISAELISA免疫印迹免疫印迹免疫沉淀免疫沉淀蛋白质亲和层析蛋白质亲和层析毛细管电泳毛细管电泳105106107噬菌体展示技术108丝状噬菌体基因丝状噬菌体基因基因基因基因基因编码产物编码产物编码产物编码产物功能功能功能功能gIgIpIpI噬菌体装配噬菌体装配噬
59、菌体装配噬菌体装配gIIgIIpIIpII噬菌体基因组复制噬菌体基因组复制噬菌体基因组复制噬菌体基因组复制gIIgIIpIIIpIII尾端外壳蛋白，与尾端外壳蛋白，与尾端外壳蛋白，与尾端外壳蛋白，与F F因子结合因子结合因子结合因子结合gIVgIVpIVpIV噬菌体装配噬菌体装配噬菌体装配噬菌体装配gVgVpVpV噬菌体基因组复制噬菌体基因组复制噬菌体基因组复制噬菌体基因组复制gVIgVIpVIpVI外壳蛋白，末端外壳蛋白，末端外壳蛋白，末端外壳蛋白，末端“ “塞子塞子塞子塞子” ”gVIIgVIIpViIpViI外壳蛋白，高度疏水，组装起始信号外壳蛋白，高度疏水，组装起始信号外壳蛋白，高度疏
60、水，组装起始信号外壳蛋白，高度疏水，组装起始信号gVIIIgVIIIpVIIIpVIII主要外壳蛋白主要外壳蛋白主要外壳蛋白主要外壳蛋白gIXgIXpIXpIX外壳蛋白，高度疏水，末端外壳蛋白，高度疏水，末端外壳蛋白，高度疏水，末端外壳蛋白，高度疏水，末端“ “塞子塞子塞子塞子” ”gXgXpXpXgIIIgIII启动子激活蛋白启动子激活蛋白启动子激活蛋白启动子激活蛋白109110111建 库112筛选113114核糖体展示(ribosomedisplay)核心是利用体外核糖体表达载体构建scFv抗体库,并于体外转录为mRNA,体外翻译表达,随后以固相化的抗原分子亲和筛选出核糖体-mRNA-s
61、cFv复合物中的高亲和力scFv。这种技术在实验中不用任何细胞,是第一个完全在体外筛选有功能蛋白的方法。115特点不需转化细菌或真核细胞不需转化细菌或真核细胞避免了宿主随细胞基因组复制过程中可能丢失而产生的避免了宿主随细胞基因组复制过程中可能丢失而产生的库库容下降容下降,亦解决了因抗体筛选条件不利于宿主细胞生亦解决了因抗体筛选条件不利于宿主细胞生存而导致抗体丢失这一难题。存而导致抗体丢失这一难题。由于核糖体展示技术的体外翻译、体外筛选的特点由于核糖体展示技术的体外翻译、体外筛选的特点,大大大大缩短了实验周期缩短了实验周期,具有省时省力、方便快速的特点。具有省时省力、方便快速的特点。116蛋白质
62、组分离技术蛋白质组分离技术双向凝胶电泳技术双向凝胶电泳技术双双向向凝凝胶胶电电泳泳技技术术(2DE)(2DE)：又又称称二二维维电电泳泳，其其原原理理是是在在相相互互垂垂直直的的两两个个方方向向上上，分分别别基基于于蛋蛋白白质质不不同同的的等等电电点点和和分分子子量量，运运用用等等电电聚聚焦焦(isoelectric (isoelectric focusingfocusing，IEF)IEF)和和十十二二烷烷基基硫硫酸酸钠钠聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳(SDS-PAGE)(SDS-PAGE)，把把复复杂杂的的蛋蛋白白质质混混合合物物中中的的蛋蛋白白在在二二维维平平面面上上分分离离展展开
63、开。完完整整的的双双向向凝凝胶胶电电泳泳分分析析，包包括括样样品品制制备备、等等电电聚聚焦焦、平平衡衡转转移移、SDSPAGESDSPAGE、斑斑点点染色、图像捕捉和图谱分析等步骤。染色、图像捕捉和图谱分析等步骤。117118双向凝胶电泳技术的应用双向凝胶电泳技术的应用用于分离细胞或组织蛋白质粗提物用于分离细胞或组织蛋白质粗提物构建特定组织或细胞的蛋白质构建特定组织或细胞的蛋白质“二维参考图谱二维参考图谱”；分分析析特特定定时时间间与与病病理理、生生理理状状态态下下蛋蛋白白质质的的表表达达情情况，进行蛋白质组差异比较。况，进行蛋白质组差异比较。已构建特定组织或细胞的蛋白质已构建特定组织或细胞的
64、蛋白质2DE2DE图谱数据库图谱数据库不不同同生生物物、不不同同器器官官、组组织织、细细胞胞的的专专一一性性2DE2DE数数据据库库，为为实实现现对对已已知知蛋蛋白白质质的的分分析析鉴鉴定定、未未知知蛋蛋白白的的发发现现、总总结结蛋蛋白白质质结结构构、性性质质与与功功能能的的规规律律以以及及实实现模拟与预测等奠定了基础。现模拟与预测等奠定了基础。1191 1疾病的蛋白质组研究疾病的蛋白质组研究 （1 1）肿瘤蛋白质组研究）肿瘤蛋白质组研究 （2 2）心血管疾病蛋白质组研究）心血管疾病蛋白质组研究 （3 3）神经系统疾病研究）神经系统疾病研究 2 2病原微生物的蛋白质组研究病原微生物的蛋白质组研
65、究 3 3蛋白质组药物开发蛋白质组药物开发 120生物信息学主要研究领域生物信息学主要研究领域 建立和管理各种生物信息数据库建立和管理各种生物信息数据库核酸序列数据库核酸序列数据库三维结构数据库三维结构数据库基因组序列信息的提取和分析基因组序列信息的提取和分析序列比对（序列比对（Alignment）和结构比对）和结构比对蛋白质结构预测蛋白质结构预测蛋白质编码基因的计算机辅助识别蛋白质编码基因的计算机辅助识别非编码区分析和非编码区分析和DNA语言研究语言研究 分子进化和比较基因组学分子进化和比较基因组学 、遗传密码的起源、遗传密码的起源 序列重叠群（序列重叠群（Contigs）的装配）的装配生物
66、大分子结构模拟及其与疾病、药物设计生物大分子结构模拟及其与疾病、药物设计 DNA DNA芯片和微阵列的发展芯片和微阵列的发展121与疾病的关系研究与疾病的关系研究基因多态性分析基因多态性分析即使一个基因的序列已经确定，它只是有代表性的序列即使一个基因的序列已经确定，它只是有代表性的序列之一，在群体分布中，仍存在有基因的多态性。正是由之一，在群体分布中，仍存在有基因的多态性。正是由于多态性的存在，生物表型及对环境、外源物和药物的于多态性的存在，生物表型及对环境、外源物和药物的反应即不同。研究基因多态性可以对群体的基因共性及反应即不同。研究基因多态性可以对群体的基因共性及其中的基因个性其中的基因个
67、性(SNPs)都有明确的认识。都有明确的认识。基于遗传的流行病学研究基于遗传的流行病学研究流行病学研究是医学信息学的重要课题之一。将流行流行病学研究是医学信息学的重要课题之一。将流行病学的遗传和非遗传性的研究与分子基因信息结合起来，病学的遗传和非遗传性的研究与分子基因信息结合起来，会导致对疾病的机理、个体对某种疾病的易感性和疾病会导致对疾病的机理、个体对某种疾病的易感性和疾病在群体中的分布有更明确的认识，对疾病的预防和治疗在群体中的分布有更明确的认识，对疾病的预防和治疗有极大的指导意义。有极大的指导意义。125单单基因病的研究基因病的研究蛋白质二维电泳：蛋白质二维电泳：蛋白质提取蛋白质提取样品
68、前处理样品前处理一向等一向等电聚焦电聚焦二向二向SDSPAGE凝胶银染及扫描凝胶银染及扫描双向电泳分双向电泳分析软件分析析软件分析差异蛋白差异蛋白质点的质质点的质普分析普分析生物信息数据查询、建立蛋白质数据库生物信息数据查询、建立蛋白质数据库126功能基因组和蛋白质组功能基因组和蛋白质组基因序列基因序列编码蛋白质结构预测编码蛋白质结构预测基于结构的同源模建基于结构的同源模建基于蛋白质结构知识基于蛋白质结构知识基因功能预测基因功能预测药物先导化合物的开发药物先导化合物的开发潜在靶标的识别潜在靶标的识别127128医学分子生物学作业以所学分子生物学知识为基础,试述一种与基因有关的疾病。（小综述）要求：1.文稿文稿论点明确、资料可靠，层次清楚。15002000字，小四号字（行距1.5）A4打印;可有插图和图表。可交电子版(Word或PPT格式)。2.文题自拟，署班级、作者姓名；参考文参考文献不少于3篇，按先后编序。3.来稿请交：电子版（邮件主题：作业学号）可交至Email：，纸质稿请于5月31日实验课前由班长统一交给分子生物学研究中心任课老师。如有雷同，不计成绩。129
