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1、安捷伦安捷伦HPLCHPLC色谱柱选择与色色谱柱选择与色谱柱维护保养谱柱维护保养AgilentTechnologies2页页安捷伦安捷伦HPLC色谱柱选择色谱柱选择AgilentTechnologies3页页AgilentTechnologies4页页AgilentTechnologies5页页AgilentTechnologies6页页AgilentTechnologies7页页AgilentTechnologies8页页AgilentTechnologies9页页A类硅胶类硅胶OriginalZORBAXSIL(1970s)由于带负电荷的残留硅羟基和酸性表由于带负电荷的残留硅羟基和酸性表面
2、上金属含量高面上金属含量高(硅羟基的硅羟基的pKa低低),导致碱性化合物发生拖尾导致碱性化合物发生拖尾B类硅胶类硅胶(高纯高纯)ZORBAXRx-Sil(1987)由于金属含量低由于金属含量低,硅羟基硅羟基pKa高高,碱性化合物不发生拖尾碱性化合物不发生拖尾ZorbaxRx-SIL:11种金属种金属35ppm(未检出其他杂质未检出其他杂质,4,000,选择选择300的孔径的孔径AgilentTechnologies14页页大孔径填料适用于大分子分析大孔径填料适用于大分子分析* *大孔径大孔径大孔径大孔径300300全多孔色谱柱全多孔色谱柱全多孔色谱柱全多孔色谱柱可用于分离蛋白质和多肽可用于分离
3、蛋白质和多肽可用于分离蛋白质和多肽可用于分离蛋白质和多肽分子量虽小但分子量虽小但分子量虽小但分子量虽小但hydrodynamicvolume(hydrodynamicvolume(水动力学体积水动力学体积水动力学体积水动力学体积) )较大的分子较大的分子较大的分子较大的分子* *PoroshellPoroshell色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱高流速下高流速下高流速下高流速下,高柱效分析大分子的蛋白质和多肽高柱效分析大分子的蛋白质和多肽高柱效分析大分子的蛋白质和多肽高柱效分析大分子的蛋白质和多肽色谱柱填料孔径必须适合色谱柱填料孔径必须适合待测物分子自由进出填料待测物分子自由进出填料孔孔,与孔内表面的
4、键合相与孔内表面的键合相进行分离分配进行分离分配AgilentTechnologies15页页300孔径可改善蛋白质和多肽峰形孔径可改善蛋白质和多肽峰形0.2000.020.040.060.080.100.120.140.160.18300SB-C18(300)SB-C18(80)PW1/2LeuEnkephalinM.W.=556AngiotensinII(血管紧张素血管紧张素II)M.W.=1046InsulinBM.W.=3,496CytCM.W.=12,327Rnase(核糖核酸酶核糖核酸酶)M.W.=13,684Lysozyme(溶菌酶溶菌酶)M.W.=13,900孔径孔径,分子量对
5、峰宽的影响分子量对峰宽的影响(梯度分离梯度分离)选择合适的选择合适的填料孔径分析填料孔径分析大分子可获得大分子可获得最佳峰形最佳峰形AgilentTechnologies16页页300孔径可改善大分子的峰形孔径可改善大分子的峰形色谱柱色谱柱:4.6x150mm,5mm流动相流动相:60%MeOH:40%0.1%三氟乙酸三氟乙酸流速流速:0.75mL/min温度温度:RT 检测器检测器:UV282nm溶液中的分子尺寸决定适宜的色谱柱孔径溶液中的分子尺寸决定适宜的色谱柱孔径窄的峰宽表明待测分子进入填料孔没有受到阻碍窄的峰宽表明待测分子进入填料孔没有受到阻碍SB-C3(80)300SB-C3(300
6、)Pw1/2=0.442Pw1/2=0.125OONHOHOCHOHOO HO HOOOOOOOCH3CH3OCH3OCH3CH3CH2CH2CH2CH3CH3CH3H3CH3CH3C0510Time(min)0510Time(min)Tylosin(泰乐菌素泰乐菌素)MW.926分子量虽小但分子量虽小但hydrodynamicvolume(水动力学体积水动力学体积)较大的分子较大的分子AgilentTechnologies17页页键合类型键合类型-对色谱分离的影响对色谱分离的影响 单齿键合：单齿键合：提高传质速率提高传质速率,加快色谱柱平衡加快色谱柱平衡双齿键合：双齿键合：增加色谱柱稳定性增
7、加色谱柱稳定性,增加色谱柱的载样增加色谱柱的载样量量C-18柱柱-性能影响因素性能影响因素CHCHCHCHCHCHOSiOOOOSiSiSiCHCHCHCHCHCHSi333333333333SiSiOOSiSiOOAgilentTechnologies18页页碳覆盖率碳覆盖率-对色谱分离的影响对色谱分离的影响 高碳覆盖率：提高分辨率高碳覆盖率：提高分辨率,分析时间长分析时间长低碳覆盖率：缩短运行时间低碳覆盖率：缩短运行时间封端封端-对色谱分离的影响对色谱分离的影响 封端：减轻待测组份与硅胶表面残留的酸封端：减轻待测组份与硅胶表面残留的酸性硅羟基反应而引起的色谱峰拖尾现象性硅羟基反应而引起的色
8、谱峰拖尾现象对于极性样品对于极性样品,未封端与经过封端处理的未封端与经过封端处理的色谱柱在选择性上有明显差异色谱柱在选择性上有明显差异C-18柱柱-性能影响因素性能影响因素AgilentTechnologies19页页固定相键合固定相键合二甲基硅烷二甲基硅烷封端封端四甲基硅烷四甲基硅烷SiOOHOOCH3SiRCH3CH3SiCH3CH3SiRCH3R=C8,C18,etc.OOHOHOCH3SiRCH3CH3SiRCH3+ClCH3SiCH3CH3OHOHOHOHCH3ClRCH3(TMS)传统键合及封端技术传统键合及封端技术AgilentTechnologies20页页取代基：五个取代基：
9、五个旁侧基团旁侧基团:异丙基异丙基ZorbaxStableBond空间位阻保护空间位阻保护-抗水解能力抗水解能力键合相键合相流失流失,保留减弱保留减弱另一个裸露的硅羟基另一个裸露的硅羟基,潜在的拖尾因素潜在的拖尾因素普通硅胶柱低普通硅胶柱低pH2不稳定不稳定,发生水解发生水解安捷伦专利的空间位阻保护安捷伦专利的空间位阻保护AgilentTechnologies21页页液相柱液相柱-保留值与保留值与pH的关系的关系pH变化值变化值0.1RS变化值变化值1.6色谱柱：色谱柱：ZorbaxStableBondC184.6X250mm,5um部件号：部件号：880975-906流动相：流动相：27%甲
10、醇：甲醇：73%磷酸磷酸pH2.5&2.6温度：温度：500C流速：流速：1.0mL/min.AgilentTechnologies22页页12346 750123456Time(min)01234561234675Time(min)pH7.00pH7.25色谱柱色谱柱:ZORBAXEclipseXDB-C84.6x75mm,3.5m流动相流动相:44%25mM磷酸磷酸,pH7.00:56%甲醇甲醇流速流速:1.0mL/min温度温度:25C检测检测:UV250nm可电离的组份的分离可能会随可电离的组份的分离可能会随pH变化发生显著变化变化发生显著变化甚至很小的甚至很小的0.050.25个个p
11、H变化单位变化单位.样品样品:1.ketoprofen2.ethylparaben3.Hydrocortisone4.fenoprofen5.propylparaben6.Propranolol7.ibuprofen液相柱液相柱-保留值与保留值与pH的关系的关系0.25个个pHAgilentTechnologies23页页液相柱液相柱-保留值与保留值与pH的关系的关系pH变化：变化：0.2个个pH(7.07.2)保留时间改变：保留时间改变：1.2分钟分钟(13.614.8分钟分钟)保留时间随保留时间随pH改变不明显改变不明显保留时间随保留时间随pH改变改变不明显不明显(酸性环境中酸性环境中)A
12、gilentTechnologies24页页保留时间保留时间酸性组份酸性组份中性组份中性组份碱性组份碱性组份方法稳定区方法稳定区方法波动区方法波动区(pKa+1.5)方法稳定区方法稳定区液相柱液相柱-保留值与保留值与pH的关系的关系AgilentTechnologies25页页液相柱液相柱-保留值与保留值与pH的关系的关系StableBondC18pH18Bonus-RPpH29ExtendC18pH211.5EclipseXDBC18pH29AgilentTechnologies26页页复杂组分的流动相复杂组分的流动相pH选择技巧选择技巧色谱柱色谱柱:ZORBAXExtend-C184.6x
13、150mm,5mm流动相流动相:30%缓冲液缓冲液:70%MeOHpH7缓冲液缓冲液20mMNa2HPO4pH11缓冲液缓冲液20mMTEA流速流速:1.0mL/min温度温度:RT 检测器检测器:UV254nm0512,345Time(min)76Extend-C18pH71.Maleate马来酸盐马来酸盐2.Scopolamine东莨菪碱东莨菪碱pKa7.63.PseudoEphedrine假麻黄碱假麻黄碱pKa9.84.Doxylamine抗敏安抗敏安(多西拉敏多西拉敏)pKa9.25.Chlorpheniramine氯苯吡胺氯苯吡胺pKa9.16.Triprol内径内径ine苯丙烯啶苯
14、丙烯啶pKa6.57.Diphenhydramine苯海拉明苯海拉明pKa9.0Extend-C18pH1105101234Time(min)657高高pH下下,碱性成分的保留增加碱性成分的保留增加待测物待测物pKa+1.5以外以外的流动相的流动相pH可保证方法的稳定性可保证方法的稳定性AgilentTechnologies27页页Zorbax 色谱柱发展史色谱柱发展史19731973ZORBAXSILZORBAXSIL发明专用于发明专用于发明专用于发明专用于HPLCHPLC分离的球状、小颗粒硅胶分离的球状、小颗粒硅胶分离的球状、小颗粒硅胶分离的球状、小颗粒硅胶( (专利专利专利专利) )19
15、771977ZORBAXODSZORBAXODS单官能团单官能团单官能团单官能团,单层键合相发明者之一单层键合相发明者之一单层键合相发明者之一单层键合相发明者之一19781978ZORBAXcolumnZORBAXcolumn首先推出色谱柱的质量信誉保证首先推出色谱柱的质量信誉保证首先推出色谱柱的质量信誉保证首先推出色谱柱的质量信誉保证19821982ZORBAXGF-250ZORBAXGF-250改善了蛋白质尺寸分离的稳定性改善了蛋白质尺寸分离的稳定性改善了蛋白质尺寸分离的稳定性改善了蛋白质尺寸分离的稳定性19871987ZORBAXRx-SILZORBAXRx-SIL推出适合碱性化合物的推
16、出适合碱性化合物的推出适合碱性化合物的推出适合碱性化合物的HPLCHPLC分离的全新硅溶胶技术分离的全新硅溶胶技术分离的全新硅溶胶技术分离的全新硅溶胶技术( (专利专利专利专利) )19901990ZORBAXStableBondZORBAXStableBond增强了低增强了低增强了低增强了低pHpH条件下键合相的稳定性条件下键合相的稳定性条件下键合相的稳定性条件下键合相的稳定性( (专利专利专利专利) )19961996ZORBAXEclipseXDBZORBAXEclipseXDB双封端技术提高了中等双封端技术提高了中等双封端技术提高了中等双封端技术提高了中等pHpH条件下键合相的稳定性条
17、件下键合相的稳定性条件下键合相的稳定性条件下键合相的稳定性( (专专专专利利利利) )19971997ZorbaxLC/MScolumnZorbaxLC/MScolumn1515和和和和3030mm(3.5um)mm(3.5um)快速快速快速快速,高分辨率高分辨率高分辨率高分辨率,高通量高通量高通量高通量LC/MSLC/MS色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱19981998ZORBAXBonus-RPZORBAXBonus-RP极性键合技术使碱性化合物的分离得到改善极性键合技术使碱性化合物的分离得到改善极性键合技术使碱性化合物的分离得到改善极性键合技术使碱性化合物的分离得到改善( (专利专利专利专利)
18、)19991999ZORBAXCombiHTZORBAXCombiHT专为小规模组合化学样品制备设计的高通量色谱柱专为小规模组合化学样品制备设计的高通量色谱柱专为小规模组合化学样品制备设计的高通量色谱柱专为小规模组合化学样品制备设计的高通量色谱柱19991999ZORBAXEclipsedsDNAZORBAXEclipsedsDNA用于分析双链用于分析双链用于分析双链用于分析双链DNADNA的多孔硅胶柱的多孔硅胶柱的多孔硅胶柱的多孔硅胶柱19991999ZORBAXCarbohydrateZORBAXCarbohydrate分析单分析单分析单分析单,双双双双,三糖和糖醇的专用柱三糖和糖醇的专用
19、柱三糖和糖醇的专用柱三糖和糖醇的专用柱19991999ZorbaxExtendC18ZorbaxExtendC18独特宽独特宽独特宽独特宽pHpH跨度跨度跨度跨度,高高高高pHpH下使用的硅胶基质色谱柱下使用的硅胶基质色谱柱下使用的硅胶基质色谱柱下使用的硅胶基质色谱柱( (专利专利专利专利) )20012001ZorbaxSB-aqZorbaxSB-aq可在低可在低可在低可在低pHpH下下下下(18)(18)使用使用使用使用100%100%水相的填料水相的填料水相的填料水相的填料( (专利专利专利专利) )20022002ZorbaxPoroshell300SBZorbaxPoroshell3
20、00SB蛋白蛋白蛋白蛋白质质高速高速高速高速,高效反相分离新填料高效反相分离新填料高效反相分离新填料高效反相分离新填料20022002ZORBAX3.0mmZORBAX3.0mm内径内径内径内径. .3-3-mmmm柱径溶剂节省柱柱径溶剂节省柱柱径溶剂节省柱柱径溶剂节省柱20032003ZORBAXsub2micronZORBAXsub2micron1.8um1.8um粒径的高通量粒径的高通量粒径的高通量粒径的高通量,超高速色谱柱超高速色谱柱超高速色谱柱超高速色谱柱 (5(5月月月月1 1日上市日上市日上市日上市) )20032003ZORBAXPrepHTZORBAXPrepHT高高高高通通
21、通通量量量量全全全全系系系系列列列列制制制制备备备备柱柱柱柱-分分分分析析析析柱柱柱柱向向向向制制制制备备备备柱柱柱柱直直直直接接接接放放放放大大大大 (6(6月月月月1 1日日日日上上上上市市市市) )AgilentTechnologies28页页键合相键合相-适用适用pH范围范围StableBond,pH1-81.使用空间位阻大的硅烷使用空间位阻大的硅烷2.未未-封端封端EclipseXDB,pH2-91.致密键合的二甲基烷基硅烷致密键合的二甲基烷基硅烷2.专利技术双专利技术双-封端封端Bonus-RP,pH2-91.极性烷基固定相极性烷基固定相2.使用空间位阻大的硅烷使用空间位阻大的硅烷
22、3.三封端三封端Extend-C18,pH2-11.51.独特的双齿键合结构独特的双齿键合结构2.双封端双封端SiOSiOSilicaSupportC18C18SiONHOSilica-based 色谱柱 Packing with Alkyl/am内径e Stationary PhaseORRSiOHSiOSiRRROOHRCHCHCHCHCHCHOSiOOOOSiSiSiCHCHCHCHCHCHSi333333333333ORSiSiOSiORR1CH3CH3CH3CH3RR1CH3R1R1R1CH3R111SiSiPGPGPGR1R1极性官能团极性官能团低低pH下下,分析酸性分析酸性,碱性
23、和中性组分碱性和中性组分,峰形优异峰形优异,柱寿命柱寿命长长中等中等pH下下,分析酸性分析酸性,碱性和中性组分碱性和中性组分,尤尤其碱性组分峰形优异其碱性组分峰形优异,柱寿命长柱寿命长中等中等pH下下,分析酸性分析酸性,碱性和中性组分碱性和中性组分,可用可用于于100%全水相全水相,尤其极尤其极性组分峰形优异性组分峰形优异,柱寿柱寿命长命长中中高高pH下下,分析酸性分析酸性,碱性和中性组分碱性和中性组分,尤尤其碱性组分峰形优异其碱性组分峰形优异,柱柱寿命长寿命长AgilentTechnologies29页页SB-C1880A&300ApH:18SB-C880A&300ApH:18SB-苯基苯基
24、80ApH:18反相色谱柱反相色谱柱Bonus-RP空间位阻保护空间位阻保护+三封端三封端80ApH:29Extend-C1880A&300ApH:211.5EclipseXDB双封端双封端EclipseXDB-C1880ApH:29EclipseXDB-C880ApH:29EclipseXDB-苯基苯基80ApH:29StableBond空间位阻保护空间位阻保护Poroshell300SB-C18实心核多孔壳实心核多孔壳pH:18SB-CN80A&300ApH:18SB-C380A&300ApH:18Zorbax产品系列产品系列SB-AQ空间位阻保护空间位阻保护80ApH:18可使用可使用1
25、00%水相水相Extend双齿键合双齿键合+双封端双封端低低pH中中pH高高pHAgilentTechnologies30页页安捷伦安捷伦HPLC色谱柱维护保养色谱柱维护保养AgilentTechnologies31页页Zorbax色谱柱色谱柱=高柱效高柱效+长寿命长寿命min00.511.52Norm.01020304050 色谱柱色谱柱:ZORBAXSB-C184.6x30mm,1.8um流动相流动相:60%甲醇甲醇:40水水流速流速:1mL/min温度温度:室温室温检测检测:UV254nm柱效柱效进样次数进样次数#3#41663561381006857637220068826381300
26、6895638140068836294500681563126006687623670066536115800669562219006781630010506810630210511300 6858652810522034 682363431234样品样品1.尿嘧啶尿嘧啶2.苯酚苯酚3.4-Cl-硝基硝基苯苯4.甲苯甲苯AgilentTechnologies32页页色谱柱柱内体积和平衡时间色谱柱柱内体积和平衡时间单次样品运行时间单次样品运行时间=分析时间分析时间+色谱柱平衡时间色谱柱平衡时间色谱柱平衡时间色谱柱平衡时间=10倍柱内体积倍柱内体积流速流速4.6x500.5mL5min4.6x30
27、0.3mL3min4.6x150.15mL1.5min4.6x1501.54mL15min2.1x500.10mL5min60sec2.1x300.06mL3min36sec2.1x150.03mL1.5min18sec色谱柱色谱柱柱内柱内平衡时间平衡时间尺寸尺寸体积体积流速流速(mm)(Vm)1.0mL/min色谱柱色谱柱柱内柱内平衡时间平衡时间尺寸尺寸体积体积流速流速(mm)(Vm)0.2mL/min1.0mL/minAgilentTechnologies33页页清洗液相色谱柱清洗液相色谱柱冲洗色谱柱冲洗色谱柱冲洗色谱柱冲洗色谱柱-用比用比用比用比流动相更强的溶剂流动相更强的溶剂流动相更强
28、的溶剂流动相更强的溶剂反相色谱柱反相色谱柱用以下溶剂至少各用以下溶剂至少各25mL冲洗色谱柱冲洗色谱柱(分析柱分析柱)不含缓冲盐的流动相不含缓冲盐的流动相100%甲醇甲醇100%乙腈乙腈75%乙腈乙腈+25%异丙醇异丙醇100%异丙醇异丙醇100%二氯甲烷二氯甲烷*100%己烷己烷*若使用己烷或二氯甲烷冲洗色谱柱若使用己烷或二氯甲烷冲洗色谱柱,则在重新使用反相则在重新使用反相流动相以前流动相以前,必须用异丙醇冲洗色谱柱必须用异丙醇冲洗色谱柱!正相色谱柱正相色谱柱用以下溶剂至少各用以下溶剂至少各50mL冲洗色谱柱冲洗色谱柱(分析柱分析柱)50%甲醇甲醇+50%三氯甲烷三氯甲烷100%乙酸乙酯乙酸
29、乙酯AgilentTechnologies34页页0.12mm内径管线用于毛细管内径管线用于毛细管HPLC中中2.1内径色谱内径色谱柱柱0.17mm内径管线用于分析型内径管线用于分析型HPLC中中2.14.6内径色谱内径色谱柱柱0.25mm内径管线用于半制备型内径管线用于半制备型HPLC中中9.4内径色谱柱内径色谱柱0.5mm内径管线用于制备型内径管线用于制备型HPLC中中21.2内径色谱柱内径色谱柱连接管线与接头连接管线与接头色谱柱色谱柱:StableBondSB-C18,4.6x30mm,3.5mm流动相流动相:85%H2Owith0.1%三氟乙酸三氟乙酸:15%ACN流速流速:1.0mL
30、/min温度温度:35C50 m mL柱外体积（管线）柱外体积（管线）4321Time(min)0.00.51.01.52.010m mL柱外体积柱外体积Time(min)0.00.51.01.52.04321样品样品:1.苯丙胺酸苯丙胺酸2.5-苯基苯基-3,6-二氧二氧-2-哌嗪乙酸哌嗪乙酸3.Asp-Phe4.天冬甜素天冬甜素AgilentTechnologies35页页HPLC常用的色谱柱接头常用的色谱柱接头Troubleshooting LC Fittings, Part II. J. W. Dolan and P. Upchurch. LC/GC Magazine 6:788 (1
31、988)0.09in.=2.33mmSwagelok安捷伦安捷伦1100液相液相ParkerValcoUptight0.09in.=2.33mm0.08in.=2.07mm0.09in.=2.33mm0.13in.=3.37mm0.17in.=4.40mmWatersRheodyneAgilentTechnologies36页页如果伸出的管线长度过长，可能漏液如果伸出的管线长度过长，可能漏液螺母坡度不匹配，密封性差螺母坡度不匹配，密封性差死体积区死体积区如果伸出的管线长度不够，可能产生死体积如果伸出的管线长度不够，可能产生死体积HPLC常用的色谱柱接头常用的色谱柱接头AgilentTechno
32、logies37页页活塞杆与密封圈活塞杆与密封圈蓝宝石活塞杆蓝宝石活塞杆1/包装包装部件号：部件号：5063-6586活塞杆密封圈活塞杆密封圈（Vespel聚酰亚胺用于聚酰亚胺用于反相反相） 2/包装包装部件号：部件号：5063-6589*己烷对己烷对Vespel聚酰亚胺有溶涨作用聚酰亚胺有溶涨作用活塞杆密封圈活塞杆密封圈（聚乙烯用于（聚乙烯用于正相正相）2/包装包装部件号：部件号：0905-1420AgilentTechnologies38页页样品样品:1.尿嘧啶尿嘧啶2.苯酚苯酚3.N,N-二甲基苯胺二甲基苯胺更换前更换前更换后更换后色谱柱色谱柱:Bonus-RP4.6x75mm,3.5m
33、m流动相流动相:30%H2O:70%MeOH流速流速:1.0mL/min温度：室温温度：室温检测器检测器:UV254nm0.00.51.01.5Time(min)2130.00.51.01.52.0Time(min)213塔板数塔板数USP拖尾因子拖尾因子(5%)1.22351.722.34911.483.54321.15塔板数塔板数 USP拖尾因子拖尾因子(5%)1. 36701.452. 104571.093. 100851.00活塞杆与密封圈活塞杆与密封圈AgilentTechnologies39页页检测器用灯检测器用灯AgilentTechnologies40页页检测器用灯检测器用灯A
34、gilentTechnologies41页页检测器用灯检测器用灯AgilentTechnologies42页页1.DAD1.DAD的氘灯替代的氘灯替代的氘灯替代的氘灯替代VWDVWD的氘灯的氘灯的氘灯的氘灯* *关闭灯电源关闭灯电源关闭灯电源关闭灯电源, ,冷却冷却冷却冷却5 5minmin以上以上以上以上* *将将将将lamplamp设定的设定的设定的设定的VWDconfigurationVWDconfiguration的灯类型改为的灯类型改为的灯类型改为的灯类型改为2140-05902140-05902.2.灯能量测试灯能量测试灯能量测试灯能量测试* *以水为流动相以水为流动相以水为流动相
35、以水为流动相* *灯预热灯预热灯预热灯预热1010minmin以上以上以上以上* *在化学工作站在化学工作站在化学工作站在化学工作站DiagnosisDiagnosis状态下状态下状态下状态下进行波长校准进行波长校准进行波长校准进行波长校准, ,将紫外灯的使用时间归零将紫外灯的使用时间归零将紫外灯的使用时间归零将紫外灯的使用时间归零DAD的氘灯替代的氘灯替代VWD的氘灯的氘灯AgilentTechnologies45页页样品溶剂溶解强度样品溶剂溶解强度样品溶剂溶解能力强于流动相导致色谱峰峰形问题：裂分峰或宽峰样品溶剂溶解能力强于流动相导致色谱峰峰形问题：裂分峰或宽峰色谱柱色谱柱:ZORBAXS
36、tableBondSB-C8,4.6x150mm,5mm流动相流动相:82%H2O:18%ACN进样体积进样体积:30mLA.样品溶剂样品溶剂100%乙腈乙腈010Time(min)12B.样品溶剂样品溶剂流动相流动相010Time(min)12样品样品:1.Caffeine(咖啡因咖啡因)2.Salicylamide(水杨酰胺水杨酰胺)AgilentTechnologies46页页中性分析时为何要使用缓冲液？中性分析时为何要使用缓冲液？色谱柱色谱柱:ZORBAXEclipseXDB-C8,4.6x75mm,3.5m流动相流动相:44%A:56%甲醇甲醇流速流速:1.0mL/min温度温度:2
37、5C检测检测:UV250nm含缓冲液的流动相可改善保留含缓冲液的流动相可改善保留,分离和色谱峰峰形分离和色谱峰峰形.样品样品:1.ketoprofen2.ethylparaben3.hydrocortisone4.fenoprofen5.propylparaben6.propranolol7.ibuprofenA=pH7.0水水A=pH7.0水水+25mM磷酸缓冲液磷酸缓冲液012345Time(min)1234675012341,4,6,7235Time(min)AgilentTechnologies47页页0 2.5 5.0 7.5Time (min)1234560 2.5 5.0Time
38、 (min)123456增加缓冲液浓度减少拖尾增加缓冲液浓度减少拖尾色谱柱色谱柱:ZORBAXEclipseXDB-C84.6x150mm,5mm流动相流动相:40%磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液60%ACN流速流速:1.5mL/min.温度温度:40CUSPTf1.1.622.1.653.1.634.1.775.1.836.1.1210mM磷酸盐磷酸盐pH7.0USPTf1.1.412.1.503.1.334.1.395.1.366.1.0025mM磷酸盐磷酸盐pH7.0在中等在中等pH下下,离子强度较高离子强度较高,能有效掩蔽硅羟基的二次作用减少拖尾能有效掩蔽硅羟基的二次作用减少拖尾样品样品:T
39、ricyclicAntidepressants（三环抗抑郁剂）三环抗抑郁剂）1.Desipramine（脱甲丙咪嗪）脱甲丙咪嗪）2.Nortriptyline（去甲替林）去甲替林）3.Doxepin（多塞平）多塞平）4.Imipramine（丙咪嗪）丙咪嗪）5.Amitriptyline（阿米替林）阿米替林）6.TrImipramine（三甲丙咪嗪）三甲丙咪嗪）AgilentTechnologies48页页TEA对碱性成分峰形的影响对碱性成分峰形的影响02.55.0Time(min)12345色谱柱色谱柱:ZORBAXEclipseXDB-C8,4.6x150mm,5mm流动相流动相:85%2
40、5mMNa2HPO4:15%ACN流速流速:1.0mL/min.温度温度:35CUSPTF5%1.1.292.1.333.1.634.2.355.1.57NoTEA10mMTEAUSPTF5%1.1.192.1.183.1.204.1.265.1.14Time(min)0.02.55.035421pH 7样品样品:1.Phenylpropanolamine（去甲麻黄碱）去甲麻黄碱）2.Ephedrine（麻黄素）麻黄素）3.Amphetamine（苯丙胺）苯丙胺）4.MethAmphetamine（脱氧麻黄碱）脱氧麻黄碱）5.Phenteramine（苯丁胺）苯丁胺）AgilentTechno
41、logies49页页竞争酸对酸性组分的峰形的影响竞争酸对酸性组分的峰形的影响色谱柱色谱柱:ZORBAXStableBondSB-C184.6x150mm,5mm流动相流动相:40%A:60%ACN流速流速:1.0mL/min.温度温度:室温室温样品样品:Ibuprofen（异丁苯丙酸）异丁苯丙酸）pKa4.4pH35mMNaH2PO4Tf=1.8pH35mMNaH2PO41%乙酸乙酸pH2.50.1%三氟乙酸三氟乙酸Tf=1.0Tf=1.09A:乙酸和三氟乙酸均能作为竞争酸填加至流动相中乙酸和三氟乙酸均能作为竞争酸填加至流动相中三氟乙酸由于所需浓度较低三氟乙酸由于所需浓度较低,可作为首选可作为
42、首选AgilentTechnologies50页页色谱柱技术色谱柱技术5988-6467EN流动相对色谱的影响流动相对色谱的影响(TE40)液相色谱柱液相色谱柱:ZORBAXEclipseXDB-C8色谱柱尺寸色谱柱尺寸:4.6x50mm3.5m部件号部件号:935967-906UV:254nm流速流速:1mL/min.室温室温1.Uracil2.Butylparaben3.Naphthalene4.Dipropylphthalate5.Acenaphthene1.尿嘧啶尿嘧啶2.尼帕尔金丁酯尼帕尔金丁酯3.萘萘4.二丙基邻苯二甲酸酯二丙基邻苯二甲酸酯5.苊苊刻度混合刻度混合:Dial-a-M
43、ixA:水水B:甲醇甲醇,用泵抽取用泵抽取50%B体积比混合体积比混合:Vol/Vol250mL水水+250mL甲醇甲醇,用泵抽取用泵抽取100%混合液混合液定容混合定容混合:Mix-to-Mark250mL甲醇甲醇,用水定容至用水定容至500mL,用泵抽取用泵抽取100%混合液混合液预混合（重量比混合）预混合（重量比混合）:Premixed(w/w)200g甲醇甲醇+200g水水,用泵抽取用泵抽取100%混混合液合液改变流动相配比方改变流动相配比方式式,可增加柱效可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）AgilentTechnologies51页页液相分析液相分析-小诀窍小诀窍1.1.提高柱温
44、，可增加柱效（提高灵敏度）提高柱温，可增加柱效（提高灵敏度）提高柱温，可增加柱效（提高灵敏度）提高柱温，可增加柱效（提高灵敏度）2.2.减小柱内径，可增加柱效（提高灵敏度）减小柱内径，可增加柱效（提高灵敏度）减小柱内径，可增加柱效（提高灵敏度）减小柱内径，可增加柱效（提高灵敏度）3.3.缩短检测器响应时间，可增加柱效（提高灵敏度）缩短检测器响应时间，可增加柱效（提高灵敏度）缩短检测器响应时间，可增加柱效（提高灵敏度）缩短检测器响应时间，可增加柱效（提高灵敏度）4.4.减小柱外体积，可增加柱效（提高灵敏度）减小柱外体积，可增加柱效（提高灵敏度）减小柱外体积，可增加柱效（提高灵敏度）减小柱外体积，
45、可增加柱效（提高灵敏度）5.5.使用超纯硅胶，可增加柱效（提高灵敏度）使用超纯硅胶，可增加柱效（提高灵敏度）使用超纯硅胶，可增加柱效（提高灵敏度）使用超纯硅胶，可增加柱效（提高灵敏度）6.6.使用高能量氘灯，可增加柱效（提高灵敏度）使用高能量氘灯，可增加柱效（提高灵敏度）使用高能量氘灯，可增加柱效（提高灵敏度）使用高能量氘灯，可增加柱效（提高灵敏度）7.7.使用中孔透光氘灯，可增加柱效（提高灵敏度）使用中孔透光氘灯，可增加柱效（提高灵敏度）使用中孔透光氘灯，可增加柱效（提高灵敏度）使用中孔透光氘灯，可增加柱效（提高灵敏度）8.8.改变流动相改变流动相改变流动相改变流动相pHpH，可增加柱效（提
46、高灵敏度），可增加柱效（提高灵敏度），可增加柱效（提高灵敏度），可增加柱效（提高灵敏度）9.9.改变有机相改变有机相改变有机相改变有机相% ，可增加柱效（提高灵敏度），可增加柱效（提高灵敏度），可增加柱效（提高灵敏度），可增加柱效（提高灵敏度）10.10.改变键合相改变键合相改变键合相改变键合相 ，可增加柱效（提高灵敏度），可增加柱效（提高灵敏度），可增加柱效（提高灵敏度），可增加柱效（提高灵敏度）11.11.改变有机添加剂改变有机添加剂改变有机添加剂改变有机添加剂 ，可增加柱效（提高灵敏度），可增加柱效（提高灵敏度），可增加柱效（提高灵敏度），可增加柱效（提高灵敏度）12.12.改变流动相配
47、比方式改变流动相配比方式改变流动相配比方式改变流动相配比方式 ，可增加柱效（提高灵敏度），可增加柱效（提高灵敏度），可增加柱效（提高灵敏度），可增加柱效（提高灵敏度）AgilentTechnologies52页页生化生化多肽多肽-5988-6316EN升温对于反相升温对于反相HPLC分离强疏水肽的影响分离强疏水肽的影响(B27)Polypeptide流动相流动相:A:含含0.05%三氟乙酸的水三氟乙酸的水B:含含0.05%三氟乙酸的乙腈三氟乙酸的乙腈2%B/min进样量进样量:100L(50g的的6M脲脲/5%乙酸乙酸)UV:210nm流速流速:1mL/min室温室温液相色谱柱液相色谱柱:ZO
48、RBAXStableBond-C18色谱柱尺寸色谱柱尺寸:4.6x250mm5m部件号部件号:880975-902室温室温300C400C500C600C700C提高柱温，可增加柱提高柱温，可增加柱效（提高灵敏度）效（提高灵敏度）AgilentTechnologies53页页环保环保样品样品:除草剂除草剂流动相流动相: 52/480.1M乙乙酸酸钠钠/甲甲醇醇,pH6流速流速: 0.45mL/min温度温度: 40,90检测检测: UV除草剂除草剂:柱温的影响柱温的影响Herbicides:EffectofColumnTemperature1.西玛津西玛津2.敌草隆敌草隆3.扑灭津扑灭津4.扑
49、灭净扑灭净5.异丙甲草胺异丙甲草胺1.Simazine2.Diuron3.Propazine4.Prometryn5.Metolachlor液相色谱柱液相色谱柱:ZorbaxStableBond-C18色谱柱尺寸色谱柱尺寸:4.6x150mm,5m部件号部件号:883975-902目录目录P6254090提高柱温，可增加柱提高柱温，可增加柱效（提高灵敏度）效（提高灵敏度）AgilentTechnologies54页页生物制药生物制药液相色谱柱液相色谱柱:Zorbax300StableBond-C3色谱柱尺寸色谱柱尺寸:4.6x150mm,5m部件号部件号:883995-909肽类肽类/蛋白质蛋
50、白质:升温对分离的影响升温对分离的影响Peptides/Proteins:EffectofElevatedTemperature样品样品:多肽多肽流动相流动相: A=5:95,乙腈乙腈:水水,0.10%三氟乙酸三氟乙酸(V/V%)B=95:5,乙腈乙腈:水水,0.085%三氟乙酸三氟乙酸(V/V%)梯度梯度:在在 20 min内内 15-53%, 后后运运行行时时间间 12 min流速流速:l.0mL/min温度温度:室温室温-60检测检测:UV215nm1.亮氨酸脑啡呔亮氨酸脑啡呔2.血管紧张素血管紧张素II3.核糖核酸酶核糖核酸酶A4.牛胰岛素牛胰岛素5.细胞色素细胞色素C6.溶菌酶溶菌酶
51、7.肌红蛋白肌红蛋白8.碳酸酐酶碳酸酐酶1.LeucineEnkephalin2.AngiotensinII3.RnaseA4.Insulin(BOV)5.CytochromeC6.Lysozyme7.Myoglobin8.Carbonicanhydrase目录目录P611提高柱温，提高柱温，可增加柱效可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）AgilentTechnologies55页页生物制药生物制药液相色谱柱液相色谱柱:ZorbaxStableBond-C8色谱柱尺寸色谱柱尺寸:150mm,5m减小毛细管内径来提高减小毛细管内径来提高低浓度样品的检测灵敏度低浓度样品的检测灵敏度Reducin
52、gCapillaryIDtoImproveSensitivityforConcentration-LimitedSamples流动相流动相:60%乙腈乙腈/40%水水流速流速:内径内径0.3mm-4uL/min内径内径0.5mm-10uL/min内径内径1.0mm-50uL/min内径内径4.6mm-1.0uL/min温度温度:室温室温检测器检测器:UV254nm样品样品:200ng联二苯联二苯(100nl)目录目录P611减小柱径，可增减小柱径，可增加柱效（提高灵加柱效（提高灵敏度）敏度）AgilentTechnologies56页页色谱柱技术色谱柱技术5988-6454EN使用小体积色谱柱
53、对于检测器使用小体积色谱柱对于检测器响应时间的重要性响应时间的重要性(TE32)液相色谱柱液相色谱柱:ZORBAXStableBond-C18色谱柱尺寸色谱柱尺寸:4.6x15mm3.5m部件号部件号:831975-902流动相流动相:乙腈乙腈:1%甲酸甲酸=32:68UV:254nm流速流速:1.0mL/min.30C进样量进样量:5L响应时间响应时间:4.0秒秒响应时间响应时间:2.0秒秒响应时间响应时间:1.0秒秒响应时间响应时间:0.5秒秒响应时间响应时间:0.1秒秒1.尿嘧啶尿嘧啶2.乙酰水杨酸乙酰水杨酸3.N-乙酰苯胺乙酰苯胺1.Uracil2.Acetylsalicylicaci
54、d3.Acetanilide缩短检测器响应时间，可缩短检测器响应时间，可增加柱效（提高灵敏度）增加柱效（提高灵敏度）AgilentTechnologies57页页色谱柱技术色谱柱技术5988-6428EN不同硅胶类型比较不同硅胶类型比较(TE1)流动相流动相:含含0.05%甲醇的二氯甲烷甲醇的二氯甲烷液相色谱柱液相色谱柱1.toluene2.benzanilide3.phenol4.benzylalcoholZorbaxSilSpherisorbZorbaxRx-Sil1.甲苯甲苯2.N-苯甲酰苯胺苯甲酰苯胺3.苯酚苯酚4.苯甲醇苯甲醇使用高纯硅胶，使用高纯硅胶，可增加柱效可增加柱效（提高灵敏
55、度）（提高灵敏度）AgilentTechnologies58页页有机化学有机化学5988-6366ENpH对苯胺取代物分析的影响对苯胺取代物分析的影响(ORCH1)流动相流动相25mM磷酸磷酸:甲醇甲醇=58:42流速流速:1mL/min22C液相色谱柱液相色谱柱:ZORBAXStableBond-C18色谱柱尺寸色谱柱尺寸:4.6x150mm5m部件号部件号:883975-9021.对位甲氧基苯胺对位甲氧基苯胺2.间位苯甲胺间位苯甲胺3.3-氨基氨基-苯甲腈苯甲腈4.对位氯苯胺对位氯苯胺5.间位氯苯胺间位氯苯胺6.邻位氯苯胺邻位氯苯胺1.p-anisidine2.m-toluidine3.3
56、-amino-benzonitrile4.p-chloroaniline5.m-chloroaniline6.o-chloroanilinepH:2.5pH:7.0改变流动相改变流动相pH，可增加柱效可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）AgilentTechnologies59页页生化生化肽肽5988-6293EN三氟乙酸浓度对于反相肽的分离的影响三氟乙酸浓度对于反相肽的分离的影响(B10)Peptide流动相流动相:A:水和三氟乙酸水和三氟乙酸B:乙腈和三氟乙酸乙腈和三氟乙酸0-30%B（30min.内）内）流速流速:1mL/minUV:254nm进样量进样量:6uL十肽菌素标样十肽菌素标
57、样S1-S5（疏水性有略微差异）疏水性有略微差异）40C液相色谱柱液相色谱柱:ZORBAX300SB-C8色谱柱尺寸色谱柱尺寸:4.6x150mm5m部件号部件号:883995-9061.0%三氟乙酸三氟乙酸0.05%三氟乙酸三氟乙酸0.25%三氟乙酸三氟乙酸改变流动相改变流动相pH，可增加柱效可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）AgilentTechnologies60页页食品分析食品分析5988-6360EN流动相强度对单糖和二糖分离的影响流动相强度对单糖和二糖分离的影响(FD4)流动相流动相:乙腈乙腈/水如图水如图流速流速:1mL/min示差折光检测器示差折光检测器液相色谱柱液相色谱柱
58、:ZORBAXNH2色谱柱尺寸色谱柱尺寸:4.6x250mm5m部件号部件号:880952-7081.果糖果糖2.葡糖葡糖3.蔗糖蔗糖4.Palatinose5.海藻糖海藻糖6.异麦芽糖异麦芽糖1.Fructose2.Glucose3.Saccharose4.Palatinose5.Trehalulose6.Isomaltose乙腈乙腈/水水70/30乙腈乙腈/水水75/25改变有机相改变有机相%，可增加柱效可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）AgilentTechnologies61页页色谱柱技术色谱柱技术5988-6468EN有机改性剂和有机改性剂和pH对于选择性的影响对于选择性的影响(
59、TE5)流动相流动相:25mM磷酸缓冲液磷酸缓冲液流速流速:1.0mL/min.22C液相色谱柱液相色谱柱:ZORBAXStableBond-CN色谱柱尺寸色谱柱尺寸:4.6x150mm5m部件号部件号:883975-9051.anisidine2.m-toluidine3.4-cl-aniline4.3-aminobenzonitrile5.3-cl-aniline6.2-cl-aniline1.甲氧基苯胺甲氧基苯胺2.间位苯甲胺间位苯甲胺3.4-氯氯-苯胺苯胺4.3-氨基苯甲腈氨基苯甲腈5.3-氯氯-苯胺苯胺6.2-氯氯-苯胺苯胺42%甲醇甲醇：58%缓冲液缓冲液30%甲醇甲醇：70%缓冲
60、液缓冲液pH2.6pH3.0改变有机相改变有机相%，可增加柱效可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）AgilentTechnologies62页页色谱柱技术色谱柱技术5988-6453ENZORBAXEclipse系列色谱柱系列色谱柱的选择性的选择性(TE31)液相色谱柱液相色谱柱:ZORBAXEclipseXDB-Phenyl色谱柱尺寸色谱柱尺寸:4.6x150mm5m部件号部件号:993967-912流动相流动相:甲醇甲醇:水水=70:30UV:254nm流速流速:1.0mL/min.室温室温ZorbaxEclipseXDB-苯基苯基ZorbaxEclipseXDB-C8ZorbaxEcl
61、ipseXDB-C181.尿嘧啶尿嘧啶2.苯酚苯酚3.4-氯氯-硝基苯硝基苯4.甲苯甲苯5.萘萘1.Uracil2.Phenol3.4-Cl-nitrobenzene4.Toluene5.Naphthalene改变键合相，改变键合相，可增加柱效可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）AgilentTechnologies63页页生物制药生物制药液相色谱柱液相色谱柱:ZorbaxExtend-C18色谱柱尺寸色谱柱尺寸:2.1x150mm,5um部件号部件号:773700-902三氟乙酸和氢氧化铵用于肽类三氟乙酸和氢氧化铵用于肽类RP-HPLCESI-MS分离的选择性比较分离的选择性比较Selec
62、tivityComparisonofTFAandNH4OHforPeptideRP-HPLCESI-MSAnalysis流速流速:0.25mL/min.温度温度:25梯度梯度:5-60%Bin20min.LC/MS: 正离子正离子,ESI-Vf70V,Vcap4.5kV,N2-35psi,12L/min.,300样品样品:4L(各各50ng)三氟乙酸条件三氟乙酸条件:A-0.1%三氟乙酸水溶液三氟乙酸水溶液B-0.085%三氟乙酸三氟乙酸80%的乙腈溶液的乙腈溶液NH4OH条件条件:A-20mMNH4OH水溶液水溶液B-20mMNH4OH80%的乙腈溶液的乙腈溶液目录目录P613改变有机添加剂
63、，改变有机添加剂，可增加柱效可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）AgilentTechnologies64页页生化生化肽肽十肽菌素十肽菌素5988-6299EN酸对于反相肽的分离的影响酸对于反相肽的分离的影响(B16)decapeptide流动相流动相:A:含相应的酸的水相含相应的酸的水相B:含相应的酸的乙腈含相应的酸的乙腈0%-30%B（30min.内）内）进样量进样量:6L肽标样肽标样UV:254nm流速流速:1mL/min40C液相色谱柱液相色谱柱:ZORBAX300SB-C8色谱柱尺寸色谱柱尺寸:4.6x150mm5m部件号部件号:883995-9061.十肽菌素十肽菌素S12.十肽
64、菌素十肽菌素S23.十肽菌素十肽菌素S34.十肽菌素十肽菌素S45.十肽菌素十肽菌素S51.decapeptideS12.decapeptideS23.decapeptideS34.decapeptideS45.decapeptideS50.1%三氟乙酸三氟乙酸0.025MH3PO4改变有机添加剂，改变有机添加剂，可增加柱效可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）AgilentTechnologies65页页色谱柱技术色谱柱技术5988-6467EN流动相对色谱的影响流动相对色谱的影响(TE40)液相色谱柱液相色谱柱:ZORBAXEclipseXDB-C8色谱柱尺寸色谱柱尺寸:4.6x50mm3
65、.5m部件号部件号:935967-906UV:254nm流速流速:1mL/min.室温室温1.Uracil2.Butylparaben3.Naphthalene4.Dipropylphthalate5.Acenaphthene1.尿嘧啶尿嘧啶2.尼帕尔金丁酯尼帕尔金丁酯3.萘萘4.二丙基邻苯二甲酸酯二丙基邻苯二甲酸酯5.苊苊刻度混合刻度混合:Dial-a-MixA:水水B:甲醇甲醇,用泵抽取用泵抽取50%B体积比混合体积比混合:Vol/Vol250mL水水+250mL甲醇甲醇,用泵抽取用泵抽取100%混合液混合液定容混合定容混合:Mix-to-Mark250mL甲醇甲醇,用水定容至用水定容至5
66、00mL,用泵抽取用泵抽取100%混合液混合液预混合（重量比混合）预混合（重量比混合）:Premixed(w/w)200g甲醇甲醇+200g水水,用泵抽取用泵抽取100%混混合液合液改变流动相配比方改变流动相配比方式，可增加柱效式，可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）AgilentTechnologies66页页倍数倍数前缀前缀符号符号1,000,000,000,000,000,000=1018exa-E1,000,000,000,000,000=1015peta-P1,000,000,000,000=1012tera-T1,000,000,000=109giga-G1,000,000=10
67、6mega- M1,000=103kilo-K100=102hecto- H10=101deka-da0.1=10-1deci-d0.01=10-2centi-c0.001=10-3milli-m0.000001=10-6micro- u0.000000001=10-9nano-n0.000000000001=10-12pico-p0.000000000000001=10-15femto- f0.000000000000000001=10-18atto-appm(partpermillion)=mg/kg,ug/g,ng/mg,pg/ug,mg/L,ug/mL,ng/uLppb(partper
68、billion)=ug/kg,ng/g,pg/mg,ug/L,ng/mL,pg/uLppt(partpertrillion)=ng/kg,pg/g,fg/mg,ng/L,pg/mL,fg/uL附录附录-1mg/mL=1,000ppmAgilentTechnologies67页页反相反相HPLC常用缓冲液常用缓冲液缓冲液缓冲液pKapH范围范围磷酸盐磷酸盐pK12.11.13.1柠檬酸盐柠檬酸盐pK13.12.14.1甲酸盐甲酸盐3.82.84.8柠檬酸盐柠檬酸盐pK24.73.75.7乙酸盐乙酸盐4.83.85.8柠檬酸盐柠檬酸盐pK35.44.46.4磷酸盐磷酸盐pK27.26.28.2羟甲基甲胺羟甲基甲胺8.37.39.3氨氨9.28.210.2硼酸盐硼酸盐9.28.210.2甘氨酸甘氨酸9.88.810.81-甲基甲基-哌啶哌啶10.39.311.3四氢化吡咯四氢化吡咯10.59.511.5二乙胺二乙胺10.59.511.5三乙胺三乙胺10.79.711.7磷酸盐磷酸盐pK312.311.313.3pH2.5磷酸磷酸0.1%三氟乙酸三氟乙酸0.1%附录附录-2结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！68
