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1、气单胞菌检验及研究进展v概述v流行病学v微生物特性v嗜水气单胞菌的鉴定要点 概 述 气单胞菌在自然界分布广泛 ,普遍存在于淡水、 污水、 淤泥、土壤和人类粪便中 ,有致病性菌株和非致病性菌株之分。致病菌株可感染鱼类、 两栖类、 爬行类、 鸟类和哺乳类等动物 。临床上以急性出血性败血症为主要特征。v气单胞菌可引起人肠道感染和肠道外感染 ,如败血症、 伤口、 眼、 骨关节、 腹腔感染和其它感染 ,其中嗜水气单胞菌是一种典型的人 -畜 -鱼共患病原菌 ,人类可因致病性嗜水气单胞菌感染而发生腹泻、 食物中毒、 继发感染等等。分类与地位 1984年第 8版伯杰氏系统细菌学手册 中列为弧菌科 ,气单胞菌属
2、。嗜水气单胞菌：嗜水气单胞菌嗜水亚种、 嗜水气单胞菌无色亚种和嗜水气单胞菌解朊亚种豚鼠气单胞菌温和气单胞菌杀鲑气单胞菌：杀鲑亚种、不产色亚种、杀日本鲑亚种维隆气单胞菌：温和生物亚种和维氏生物亚种 v至今，发展到l4个气单胞菌表型种和 16个基因种 ,把以往被归类为弧菌科的气单胞菌属划为一个独立的科 ,即气单胞菌科。 流 行 病 学自然栖息地 主要存在于水生环境包括食品、 地面水、 海水、 河水、 湖泊、 蓄水池和供水系统中 ,其生长密度较低 ,可小于 11 000个细胞 /mL; 在废水、 处理过或未处理的污水、 家庭污水泥浆中密度很高 ,可高达 1亿个细胞 /mL以上。 许多气单胞菌可在新鲜
3、或储存食品中广泛存在 ,并且数量很高。 在瓶装天然矿泉水中 ,甚至手术使用的医疗用品中也能检出气单胞菌。致病因素 在温血和冷血脊椎动物 (包括青蛙、 鱼、 爬虫、蛇、 鸟和人 )中 ,气单胞菌与许多种类的疾病有关 ,对人感染主要有两类: 肠道感染和肠道外感染 (败血症、 伤口、 眼、 骨关节、 腹腔感染和其他感染 )。 毒力因子：外毒素、胞外蛋白酶、s蛋白、菌毛、外膜蛋白、脂多糖等 外毒素包括肠毒素、溶血素和细胞毒素 文献报道 食物及环境中分离到的气单胞菌 29 . 4%产生肠毒素 , 43 . 1%产生溶血素 , 89 . 0%产生细胞毒素 , 从食物中分离到的气单胞菌 18 . 2%产生肠
4、毒素 , 17 . 1%产生溶血素 , 72 .7%产生细胞毒素 。 温和气单胞菌和维隆气单胞菌比其他菌种产生更多的肠毒素和溶血素 ,维隆气单胞菌和杀鲑气单胞菌可产生细胞游离性溶血素。嗜水气单胞菌致病因子v嗜水气单胞菌可以通过饮水、 皮肤创伤等途径感染动物机体， 并在体内经过不同途径对机体的不同器官进行破坏。v嗜水气单胞菌可产生多种致病因子 气溶素(aerolysin) 、 溶血素(hemolysin)、 溶血毒素(hemolytic toxin ) 、 细胞毒性肠毒素( cytolyti- centerotoxin ) 、 胞外蛋白酶 、型菌毛、 s层蛋白及载铁体等。嗜水气单胞菌致病因子v外
5、毒素外毒素( exotoxin) 由于嗜水气单胞菌基因型的多样性， 其外毒素的基因差异也很大， 包括气溶素、 溶血素、 溶血毒素和细胞毒性肠毒素等。虽然外毒素名称各异，但这些毒素在结构和功能上都极为相似：它们都是单一多肽分子，并且其生物学活性相同，都具有溶血性、肠毒性和细胞毒性， 因此外毒素属于同一基因家族。v国际上将外毒素统一命名为气溶素( Aer ) 。在国内， 涂小林、 陆承平等将毒素命名为 HEC毒素。 嗜水气单胞菌致病因子v胞外酶胞外酶 是嗜水气单胞菌重要的致病因子之 一， 研究得较多的是金属蛋白酶和丝氨酸蛋 白酶。 G o b i u s、A n g u i t a等分别克隆得 到
6、了嗜水气单胞菌的胞外淀粉酶、 蛋白酶、 脂肪酶及磷脂酶。嗜水气单胞菌致病因子v胞外蛋白酶有的具有直接致病性，有的则不具有直接致病性 ， 但可以活化其他致病因子，外毒素是以无活性的前体形式存在的， 必须经过蛋白酶将其前体 C末端的蛋白降解后才具有生物学活性。v总之， 嗜水气单胞菌的致病因子繁多复杂，它们对机体发挥毒性作用时也不是单个因子独立作用， 而是相互协同作用于机体的 。胃肠道感染腹泻病是气单胞菌感染最常见的临床表现 v好发人群主要是 5岁以下儿童 ,成人也有报道 ,但很少引起旅游者腹泻。v夏季发病率最高 v主要由嗜水气单胞菌、 豚鼠气单胞菌和温和气单胞菌引起气单胞菌相关性胃肠道感染 。v倾
7、向于轻度的、自限性的水样腹泻。但也有出现血便和粪便白细胞的严重病例 ,与志贺菌所致的痢疾非常相似。v少数情况下还可引起霍乱样腹泻。 肠道外感染 菌血症 伤口感染 通常继发于胃肠炎或外伤性损害以及接触 污染水体后发生。 主要是嗜水气单胞菌和维隆气单胞菌引起 气单胞菌有致病性菌株和非致病性菌株之分。从肠道外来源分离的气单胞菌特别是以纯培养物的形式分离时比较有临床意义。在没有分离到其他肠道病原 (包括儿童轮状病毒 )的情况下 , 从10岁以下患者分离的大多数菌株比较有意义。而成人只有嗜水气单胞菌和维隆气单胞菌比较有意义。 药物敏感性多数菌株产生内酰胺酶 ，大多数气单胞菌对青霉素、 氨苄青霉素、 替卡
8、西林耐药 ，对广谱抗生素先锋霉素、 氨基糖苷类、 碳青霉烯、 氯霉素、 四环素、 复方新诺明和喹诺酮类敏感。我国气单胞菌对抗生素的耐药比较普遍 , 气单胞菌主要 3个种的耐药率比较 ,对头孢噻肟和头孢美唑的敏感率温和气单胞菌明显高于嗜水气单胞菌和豚鼠气单胞菌,对其他抗生素的耐药率各种之间无明显差异。我中心的食品中气单胞菌药敏试验结果表明，气单胞菌对利福平、氨苄青霉素的耐药率较高，对丁胺卡那、庆大霉素、氟哌酸的敏感性高。 微生物特性 形态和染色特征形态和染色特征 革兰阴性、 直杆状或略弯、球形、 末端钝圆的菌体 无荚膜 ,无芽孢 ,有时也可呈双球状或丝状。单极鞭毛 ,固体培养基上的幼龄培养物可形
9、成周鞭毛。杀蛙气单胞菌和中间气单胞菌幼菌株无运动性。 培养与鉴定培养与鉴定 触酶和氧化酶均为阳性 还原硝酸盐为亚硝酸盐 发酵葡萄糖以及其他许多糖类产酸或产酸产气 生长温度范围广 (045) ,人分离菌株 (嗜常温菌株 )在 1042 间生长 ,而无运动性的嗜冷菌种生长的最高温度为 37(如中间气单胞菌 )或更低一些 (如杀蛙气单胞菌 )。在脑心浸液培养基 28培养条件下 ,可在 pH 4 . 59 . 0和 0% 4%的NaCl浓度生长。气单胞菌可在许多普通常规培养基上生长 ,如血、巧克力平板及许多肠道鉴别培养基。培养与鉴定培养与鉴定 28培养 24小时普通营养琼脂平板 菌落为光滑、 凸起、
10、圆整、 无色或淡黄色 ,有特殊芳香气味。菌落大小因培养时间温度而异 ,小如针尖 ,大的直径可达 23mm,不产生色素。血琼脂 某些菌株即使在 10也可产生清晰的-溶血环。培养与鉴定培养与鉴定注：许多气单胞菌 ,如豚鼠气单胞菌蔗糖或乳糖利用阳性 ,在选择性培养基上发酵乳糖 ,与肠道的常居菌群不易鉴别。因此使用麦康凯等肠道选择性培养基来分离气单胞菌时 ,一些菌株很容易被漏检。 碱性蛋白胨水是气单胞菌最有效的增菌培养基。血清分型 气单胞菌血清学分型主要用于流行病学调查。 多年来的研究表明 ,嗜水气单胞菌、 温和气单胞菌 和豚鼠气单胞菌的分离频率在所有气单胞菌中占有 绝对优势地位 ,其中尤以嗜水气单胞
11、菌为最 ,而其他 种类则极少从环境和腹泻患者中分离出 ,难以形成 种群优势。国际上对气单胞菌的血清学分型研究比较系统的是 日本国立康复研究院 (N I H)和荷兰国立公共健康和 环境卫生研究院 (N IPHEH)对嗜温群气单胞菌的血 清学分型 ,前者共分 44个 O抗原血清型 ,后者分 30 个 O抗原血清型。血清分型英国学者 Thomas等将 N I H系统在原有 44个 O型血清基础上扩大到 96个。Thomas的分型结果显示 03、 016、 017和034是优势血清型 ,其中 011、 016和 034毒力强大 ,被认为是引起人类腹泻的重要病原 。鱼源气单胞菌的优势血清型主要为011、
12、 019和034引起。国内则多认为 05和 09是引起家养鱼类暴发性流行病的优势血清型,而人源主要也是 011、 016、 034。检验程序标本标本 增菌增菌 分离培养分离培养（血平板、（血平板、Mac）全面生化反应全面生化反应可疑菌落可疑菌落肠毒素测定肠毒素测定初步生化反应初步生化反应 涂片涂片染色镜检染色镜检血标本血标本氧化酶氧化酶TCBS生长生长O/129耐盐试验耐盐试验鉴定试验v与肠道杆菌、非发酵菌鉴别v与邻单胞菌属和弧菌属鉴别v气单胞菌属种间鉴别。 致病性嗜水气单胞菌检验方法 GB/ T 1 8 6 5 2 -2 0 0 2 v本标准在嗜水气单胞菌的鉴定中， 参考了 伯杰氏鉴定细菌学
13、手册 (第九版， 1 9 9 4 ) 中有关嗜水气单胞菌的内容。v在嗜水气单胞菌的分离鉴定中， 除采用选择培养基R S培养基及鉴别培养基嗜水气单胞菌( A H M)培养基外，还应借助一些生化反应将其与假单胞菌、邻单胞菌、肠杆菌、弧菌及其他气单胞菌进行区分。v蛋白酶是嗜水气单胞菌重要的毒力决定因子，与该菌的致病性密切相关，凡蛋白酶阳性的嗜水气单胞菌均具致病性。蛋白酶的检测除采用脱脂奶平板法外，还可采用斑点酶联免疫试验。 v本标准可用于嗜水气单胞菌的分离鉴定， 而且可区分致病性菌株和非致病性菌株，有助于致病性嗜水气单胞菌感染的确切诊断。v本标准由中华人民共和国农业部提出。v本标准由全国动物检疫标准
14、化技术委员会归口。致病性嗜水气单胞菌检验程序 嗜水气单胞菌的鉴定v检样：v水样的分离用孔径为0.2 m的硝酸纤维素微孔滤膜过滤水样,取出滤膜，置含有灭菌碱性蛋白胨水的试管中。菌落形态 嗜水气单胞菌在普通琼脂平板上，2 8 培养2 4 h后的菌落为光滑、微凸、圆整 、无色或淡黄色，有特殊芳香气味。革兰氏染色 嗜水气单胞菌应为革兰氏阴性短杆菌。 氧化酶试验 阳性 嗜水气单胞菌革兰染色嗜水气单胞菌菌落特征（血平板）嗜水气单胞菌菌落特征（MAC）返回返回嗜水气单胞菌电镜图返回返回AHM鉴别培养v 用铂金耳挑取普通琼脂平板上氧化酶试验阳性的单个菌落少许， 穿刺接种AHM鉴别培养基。 3 7 培养2 4
15、h v结果：顶部仍为紫色，底部为淡黄色; 细菌沿穿刺 线呈刷状生长，即动力阳性; 部分菌株顶部呈黑 色。 AHM 吲哚试验在长有细菌的A H M鉴别培养基顶部， 滴加3 -4 滴K o v a c s 试剂，若沿试管内壁出现红色环者，表明产生吲哚，判为阳性。 嗜水气单胞菌应为阳性糖发酵试验 分别接种葡萄糖、 蔗糖、 阿拉伯搪、 七叶苷及水杨苷等5 种糖发酵试验管, 嗜水气单胞菌可发酵以上5 种糖类。 嗜水气单胞菌致病性鉴定脱脂奶平板试验 用铂金耳取A H M鉴别培养基表面菌落少许,接种划线于1 %脱脂奶蔗糖胰蛋白胨平板。2 8 培养2 4 h 若菌落周围出现清晰、透明的溶蛋白圈，判为阳性。脱脂
16、奶平板试验脱脂奶平板试验斑点酶联免疫试验v用铂金耳取A H M鉴别培养基表面菌落少许。接种蔗糖胰蛋白胨肉汤, 2 8 摇床( 3 0 r / mi n ) 培养4 8 h。1 0 0 0 0 r / mi n离心 1 0 mi n ， 取上清。v用微量加样器取5 L点样于硝酸纤微素膜光面，3 7 烘干。v置2 0 %脱脂奶中， 3 7 封闭1 h 。v用含吐温- 2 0的磷酸盐缓冲液洗5次，每次 2 min。v置1：5 0 兔抗嗜水气单胞菌蛋白酶抗血清中， 3 7 作用 1 h。斑点酶联免疫试验v用含吐温- 2 0的磷酸盐缓冲液洗5 次，每次2min ，置1：1 0 酶标羊抗兔抗血清中， 3
17、7 作用 1 h 。v用含吐温- 2 0的磷酸盐缓冲液洗5 次，每次2 mi n 。v加 3 , 3 -二氨基联苯胺-过氧化氢中显色。v待斑点明显后，用去离子水终止显色。v设无菌肉汤作阴性对照。v以出现明显棕色斑点者判为阳性。试验结果分析判定 符合以下特性者应判为致病性嗜水气单胞菌:v 在普通琼脂平板上， 2 8 培养2 4 h后的菌落为光滑、 微凸、圆整、无色或淡黄色，有特殊芳香气味;v在A H M鉴别培养基中，顶部仍为紫色，底部为淡黄色; 细菌沿穿刺线呈刷状生长，即运动力阳性; 部分菌株顶部呈黑色; v氧化酶试验阳性，革兰氏染色为阴性短杆菌;v吲哚试验阳性，发酵葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、七叶苷及水杨苷等5 种糖类;v脱脂奶平板试验阳性或斑点酶联免疫试验阳性。
