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1、课题课题3 分解纤维素的微生物的分离分解纤维素的微生物的分离（一一）纤维素与纤维素酶纤维素与纤维素酶纤维素纤维素：一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，广泛地存在于植物的根、茎、叶等器官中。地球上含量广泛地存在于植物的根、茎、叶等器官中。地球上含量最最丰富丰富的多糖。的多糖。纤维素酶纤维素酶：由微生物分泌的一种复合酶，包括由微生物分泌的一种复合酶，包括C C1 1酶酶、C Cx x酶和葡萄糖苷酶，由于它们的协同作用，最终将纤维素分酶和葡萄糖苷酶，由于它们的协同作用，最终将纤维素分解成葡萄糖。解成葡萄糖。纤维素纤维素C C1 1酶酶C Cx x酶酶纤维二
2、糖纤维二糖葡萄糖葡萄糖苷苷酶酶葡萄糖葡萄糖取二支取二支20mL20mL的试管的试管实验：实验：纤维素酶分解纤维素的实验纤维素酶分解纤维素的实验各加入一张滤纸条各加入一张滤纸条各加入各加入PH4.8PH4.8，物质量为，物质量为0.1mol/L0.1mol/L的醋酸醋酸钠缓冲液的醋酸醋酸钠缓冲液11ml11ml和和10ml10ml甲甲 乙乙在乙试管中加入在乙试管中加入1mL1mL纤维素酶纤维素酶两支试管固定在锥形瓶中，放在两支试管固定在锥形瓶中，放在140r/min140r/min的摇床上振荡的摇床上振荡1h1h结果：乙试管的滤纸条消失结果：乙试管的滤纸条消失 讨论讨论：乙试管的滤纸条为什么会消
3、失？甲试管的作用是乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是什么？什么？刚果红染色法刚果红染色法刚果红能与纤维素形成红色复合物，而不与刚果红能与纤维素形成红色复合物，而不与水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。（二二）纤维素分解菌的筛选纤维素分解菌的筛选用加入刚果红的纤维素培养基去培养微生物用加入刚果红的纤维素培养基去培养微生物时，如果培养基中出现以菌落为中心的透明圈时，时，如果培养基中出现以菌落为中心的透明圈时，可说明该菌落是纤维素分解菌，因为它已将被刚可说明该菌落是纤维素分解菌，因为它已将被刚果红果红染成红色的纤维素分解了。染成红色的纤维素分解了。一、
4、实一、实 验验 设设 计计 请你根据实验流程图和提供的三个资料以及请你根据实验流程图和提供的三个资料以及“操作操作提示提示”，在思考有关问题的基础上，设计出一个详细的，在思考有关问题的基础上，设计出一个详细的实验方案。实验方案。土壤取样土壤取样选择培养选择培养梯度稀释梯度稀释 将样品涂布在鉴别纤将样品涂布在鉴别纤 维素分解菌的培养基上维素分解菌的培养基上 筛选产生透筛选产生透 明圈的菌落明圈的菌落1.本实验的流程与课题本实验的流程与课题2中的实验流程有哪些异同？中的实验流程有哪些异同？本实验流程与课题本实验流程与课题2的流程的区别如下。课题的流程的区别如下。课题2是将是将土样制成的菌悬液直接涂
5、布在以尿素为惟一氮源的选择土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为惟一氮源的选择性培养基上，直接分离得到菌落。本课题通过选择培养，性培养基上，直接分离得到菌落。本课题通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在选择培养使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在选择培养基上。其他步骤基本一致。基上。其他步骤基本一致。2.为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土样
6、中获得目的微生物的几率要高于普通环境。样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。3.将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋进将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋进土壤多深？土壤多深？将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集，将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将纸埋于深约般应将纸埋于深约10cm左右腐殖土壤中。左右腐殖土壤中。阅读与思考阅读与思考阅读教材阅读教材28282929页页“资料一资料一”“资料三资料三”，并思考相关问题。，并思考相关问题。问题一问题一：是液体培养基，因为没
7、有添加琼脂。是液体培养基，因为没有添加琼脂。问题二问题二：具有筛选作用，因为培养基中的碳源是纤维素，具有筛选作用，因为培养基中的碳源是纤维素，该培养基只有能分泌纤维素酶的纤维素分解菌才能生长。该培养基只有能分泌纤维素酶的纤维素分解菌才能生长。问题三问题三：“资料三资料三”中的两种方法各有哪些优点和不足，中的两种方法各有哪些优点和不足，你打算选哪一种？你打算选哪一种？刚果红在筛选纤维素分解菌上的应用已经有超过刚果红在筛选纤维素分解菌上的应用已经有超过20年的历史，在本课题中我们给出了两种方法。方法一是年的历史，在本课题中我们给出了两种方法。方法一是传统的方法，传统的方法，缺点是操作繁琐缺点是操作
8、繁琐，加入刚果红溶液会使菌加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂落之间发生混杂；其优点是这样显示出的颜色反应基本其优点是这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用上是纤维素分解菌的作用。方法二的。方法二的优点是操作简便，优点是操作简便，不存在菌落混杂问题不存在菌落混杂问题，缺点是由于纤维素和琼脂、土豆，缺点是由于纤维素和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质，汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应物出现假阳性反应。但这种只产生淀粉酶的微生物产生。但这种只产生淀粉酶的微生物产生的的透明圈较为模糊透明圈较为模糊，因为培养基中纤维素占主要地位，因为培养基中
9、纤维素占主要地位，因此可以与纤维素酶产生的透明圈相区分。方法二的另因此可以与纤维素酶产生的透明圈相区分。方法二的另一缺点是：一缺点是：有些微生物具有降解色素的能力有些微生物具有降解色素的能力，它们在长，它们在长时间培养过程中会降解刚果红形成明显的透明圈，与纤时间培养过程中会降解刚果红形成明显的透明圈，与纤维素分解菌不易区分。维素分解菌不易区分。问题四：问题四：为什么选择培养能够为什么选择培养能够“浓缩浓缩”所需的微生物所需的微生物？在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那
10、些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓浓缩缩”的作用。的作用。土壤中纤维素分解菌的分离土壤中纤维素分解菌的分离 1.1.土样采集土样采集：土样采集的方法与本专题课题土样采集的方法与本专题课题 2 2类似。类似。土样的采集要选择富含纤维素的环境，这是因为在纤维素土样的采集要选择富含纤维素的环境，这是因为在纤维素含量丰富的环境，通常会聚集较多的分解纤维素的微生物。含量丰富的环境，通常会聚集较多的分解纤维素的微生物。如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，过一个如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，过一个月左右也会有能分解纤维素
11、的微生物生长。月左右也会有能分解纤维素的微生物生长。二、实二、实 验验 案案 例例 2.2.选择培养选择培养：选择培养需要的仪器有：选择培养需要的仪器有：250 mL250 mL锥形锥形瓶、无菌称量瓶、药匙、瓶、无菌称量瓶、药匙、1 mL1 mL和和10 mL10 mL的移液管、天平、的移液管、天平、摇床、温度计等。摇床、温度计等。 在在250 mL250 mL锥形瓶中装入锥形瓶中装入30 mL30 mL选择培养基，用选择培养基，用8 8层纱层纱布做成瓶塞，将瓶口塞紧，再在瓶塞外包裹两层包装纸，布做成瓶塞，将瓶口塞紧，再在瓶塞外包裹两层包装纸，用线绳扎紧，在用线绳扎紧，在121 121 下高压
12、蒸汽灭菌下高压蒸汽灭菌20 min20 min。 选择培养的操作：称取土样选择培养的操作：称取土样20 g20 g，在无菌条件下加，在无菌条件下加入装有入装有30 mL30 mL培养基的摇瓶中。将摇瓶置于摇床上，在培养基的摇瓶中。将摇瓶置于摇床上，在30 30 下振荡培养下振荡培养1 12 d2 d，至培养基变混浊，重复上述方法再，至培养基变混浊，重复上述方法再培养一次，然后再进行梯度稀释和涂布平板。培养一次，然后再进行梯度稀释和涂布平板。高考总复习高考总复习生物生物 3.3.刚果红染色法分离：刚果红染色法分离：纤维素分解菌这一步所需要的纤维素分解菌这一步所需要的仪器有：无菌培养皿、涂布器、仪
13、器有：无菌培养皿、涂布器、1 mL1 mL移液管，装有移液管，装有9mL9mL无无菌水的菌水的20 mL20 mL大试管，温箱等。大试管，温箱等。 培养基的制备参照课本旁栏中的比例配制。在培养基的制备参照课本旁栏中的比例配制。在500 500 mLmL三角瓶中装入三角瓶中装入200 mL200 mL培养基，在培养基，在121 121 下高压蒸汽灭菌下高压蒸汽灭菌20 min20 min。 倒平板操作：将灭菌后的固体培养基熔化，按无菌倒平板操作：将灭菌后的固体培养基熔化，按无菌操作的要求，在无菌的培养皿中倒入操作的要求，在无菌的培养皿中倒入151520 mL20 mL培养基，培养基，凝固后待用。
14、凝固后待用。 涂布平板：涂布平板：将稀释度为将稀释度为10104 410106 6的菌悬液各取的菌悬液各取0.1 mL0.1 mL，滴加在平板培养基上，用涂布器将菌液，滴加在平板培养基上，用涂布器将菌液涂布均匀，在涂布均匀，在3030倒置培养，至菌落长出。每个倒置培养，至菌落长出。每个稀释度下需涂布稀释度下需涂布3 3个平板，并注意设置对照。刚果个平板，并注意设置对照。刚果红染色的具体操作步骤参照课本资料三。红染色的具体操作步骤参照课本资料三。 制备菌悬液：制备菌悬液：按照本专题课题按照本专题课题1 1的稀释操作方法，的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释，稀释最大倍将选择培养后的培
15、养基进行等比稀释，稀释最大倍数至数至10106 6。三、结果分析与评价三、结果分析与评价1.培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落落对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维合格。如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。素的微生物。2.分离的结果是否一致分离的结果是否一致由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，不同同此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。学也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。土壤取样土壤取样选择培养（此步是否需要，应根据样品中选择培养（此步是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定）目的菌株数量的多少来确定）梯度稀释梯度稀释将菌悬液将菌悬液涂布到有特定选择作用的培养基上涂布到有特定选择作用的培养基上挑选单菌落挑选单菌落发发酵培养酵培养课后练习课后练习2：
