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1、临床血液学和血液学检验临床血液学和血液学检验第四章第四章 造血检验的基本方法造血检验的基本方法华中科技大学同济医学院医学检验系陈万新第二节 细胞化学染色细胞化学（或组织化学）是在细胞形态学的基础上运用无机化学、有机化学或生物化学等技术研究细胞在发育、增殖分化过程中的主要化学成分的定位、定量及代谢功能状态的学科，是细胞形态学的重要组成部分。细胞化学染色一般包括固定、显示、复染等步骤。主要用于：显示细胞或组织的酶、蛋白质、糖类、脂类、无机盐（如铁）等化学成分的含量及分布状况；研究细胞组织来源及分化程度；为疾病的诊断、鉴别诊断及治疗提供重要的依据。中性粒细胞碱性磷酸酶染色（NAP）.原理原理：方法一
2、（偶氮偶联法）：在PH9.29.8的碱性溶液中，细胞中的碱性磷酸酶能将底物磷酸萘酚钠水解，生成a-萘酚和磷酸钠，再以稳定的重氮盐与萘酚偶联生成不溶性有色偶氮染料沉淀，定位于细胞浆中。试剂试剂：1.固定剂：19福尔马林乙醇液，即40甲醛溶液（福尔马林）10ml加无水乙醇90ml混合即得。2.a-磷 酸 萘 酚 钠 溶 液 ： 100mg a-磷 酸 萘 酚 钠 溶 于100ml0.2mol/L（pH9.19.7）Tris缓冲溶液中，混匀后4保存。3.Tris缓冲溶液（0.2mol/LpH9.2）：Tris粉（三羟甲基氨基甲烷）2.43g溶于100ml蒸馏水中，加浓盐酸0.2ml（0.167ml）
3、。4.工作液配制（临用时现配）：取a-磷酸萘酚钠溶液1.5ml于试管内37oC水温箱中预热5分钟，加坚固篮BB盐1.5mg，混匀即可。染色步骤染色步骤：1、干燥涂片（观察片及阳性对照片），滴加固定剂布满血膜固定5秒钟，流水冲洗，待干或滤纸吸干。2、滴加作用液室温下（或37oC）染色1520分钟，流水冲洗，待干。3、中性红溶液复染3分钟，流水冲洗，干后鏡检。结果判断结果判断：阳性反应呈蓝黑色颗粒状，定位于细胞浆中。计数方法计数方法：按碱性磷酸酶活性强弱，分为5级(0IV或0+)。0级0胞浆呈原色，无颗粒。级+胞浆呈浅灰色，阳性颗粒占胞浆的25%50%。级+阳性颗粒约占胞浆面积的50%75%。II
4、I级+阳性颗粒占胞浆面积的75%100%。级 +胞浆充满蓝黑色致密的阳性颗粒，占胞浆面积的l00%，甚至遮盖胞核。每例的血片，均计数100个中性粒细胞（杆状核及分叶核粒细胞），求出NAP阳性细胞的百分比(阳性率)，并按酶活性的强弱不同，求得阳性指数(积分)。0级 0 胞浆呈原色，无颗粒。 级 + 胞浆呈浅灰色，细小蓝黑色颗粒占胞浆面积的25%50%。级 + 胞浆呈浅灰色，细小蓝黑色颗粒占胞浆面积的25%50%。级 + 胞浆呈棕色片状沉淀，小到中等颗粒约占胞浆面积的50%75%。 级+胞浆呈棕色片状沉淀，小到中等颗粒约占胞浆面积的50%75%。级 + 胞浆充满棕黑色沉淀，分布均匀，中到大颗粒占胞
5、浆面积的75%100%。级 + 胞浆充满棕黑色沉淀，分布均匀，中到大颗粒占胞浆面积的75%100%。级 + 胞浆充满深黑色致密的团块状沉淀，甚至遮盖胞核，中到大颗粒占胞浆面积的l00%。注意事项注意事项：1.重氮盐以坚固篮BB盐为最佳，其次为坚固篮B盐及坚固篮RR盐。2.也可用新鲜配制的六偶氮副品红为重氮盐，配方为：10mla-磷酸萘酚钠溶液中加六偶氮副品红50l，其NAP阳性反应呈红色颗粒状。六偶氮副品红：4%副品红（2N盐酸）溶液与4%亚硝酸钠溶液11混合，静置1min。3.重氮盐应适量，过量会导致染色失败，出现假阴性；量不足，则阳性反应较弱。4.工作液配好后应立即使用（5min以内）。需
6、用感染发热病人或正常人外周血涂片作为阳性对照。.正常分布正常分布：阳性反应主要见于成熟中性粒细胞（杆状及分叶粒细胞）中，反应结果以阳性率和积分值报告。正正常常参参考考值值：成人NAP阳性率28.7（20%40%），积分32.1（2080）。.临床意义临床意义：类白血病反应与慢性粒细胞白血病的鉴别诊断：前者显著增高，阳性率常达90%以上，积分常高于200分；后者显著减低，积分可为0。细菌性化脓性感染时，积分显著增高；病毒性感染时多为正常或稍低。淋巴细胞白血病时常增高；单核细胞白血病时正常或增高；慢性中性粒细胞白血病时增高，其它各型粒细胞白血病时减低；白血病伴感染时增高。真性红细胞增多症、骨髓纤维
7、化、再生障碍性贫血时增高，PNH时常减低。5.某些肿瘤的鉴别诊断，如骨肿瘤、消化道肿瘤的肿瘤细胞碱性磷酸酶常为较强阳性反应。酸性磷酸酶染色（酸性磷酸酶染色（ACP）方法一：Gomori硫化铅法原理：原理：在酸性条件下（pH4.7）酸性磷酸酶能将底物（甘油磷酸钠）水解，产生PO43-，与Pb2+作用生成磷酸铅沉淀，定位于胞浆中酶活性存在处，再与硫化铵作用，生成棕黑色的硫化铅沉淀。试剂：试剂：1.固定剂：40%甲醛溶液（福尔马林）。2.工作液配制：蒸馏水37ml0.2mol/LpH4.7醋酸缓冲溶液6ml0.15mol/L（5%）硝酸铅1ml0.1mol/L（3.2%）甘油磷酸钠2ml3.稀硫化铵
8、溶液（临用时现配）：取硫化铵水剂0.75ml加蒸馏水至50ml。4.甲基绿溶液：1g甲基绿溶于50ml蒸馏水中。染色步骤：1.新鲜干燥涂片甲醛蒸气固定510min，流水冲洗5min，待干。2.入工作液37孵育23h，流水冲洗数次。3.稀硫化铵溶液浸泡23min，流水冲洗。4.甲基绿溶液复染10min，流水冲洗，干后镜检。结果判断：阳性反应呈棕黄色至棕黑色定位于胞浆中。注意事项：注意事项：1.固定剂以甲醛蒸气为最佳。2.涂片应薄而干燥，否则固定后易脱落。3.此法稳定性、重复性好，染色效果最为理想。正常分布正常分布1.巨噬细胞、部分网状细胞呈较强阳性反应。2.单核细胞、T淋巴细胞、浆细胞呈中等强度
9、阳性。3.粒细胞、巨核细胞、血小板为阴性或弱阳性。4.红细胞系统、B淋巴细胞呈阴性反应。5.大多数组织的细胞含有酸性磷酸酶，前列腺细胞中此酶活性最强。临床意义临床意义1.单核细胞性白血病、真性组织细胞性淋巴瘤、T细胞白血病及淋巴瘤、毛细胞白血病、浆细胞白血病、浆细胞瘤、多发性骨髓瘤细胞均呈较强阳性反应。2.高雪细胞为强阳性；尼曼匹克细胞为阴性。3.某些白血病，成熟中性粒细胞酸性磷酸酶活性增强，可呈弱阳性至中等强度阳性。4.用于某些肿瘤细胞的鉴别诊断。苏丹黑苏丹黑B染色（染色（SBB）原原理理苏丹黑B是一种脂溶性染料，能将细胞内的脂类显示出来，呈棕黑色颗粒状定位于胞浆中。试剂试剂1.固定剂19福
10、尔马林乙醇液，即40甲醛溶液（福尔马林）10ml加无水乙醇90ml混合即得。2.苏丹黑B溶液（5g/L）0.5g苏丹黑B粉剂溶于100ml70%乙醇中，可用1月。染色步骤染色步骤1.涂片用19福尔马林乙醇液固定5s，流水冲洗，待干。2.入苏丹黑B溶液37孵育1h，流水冲洗，待干或滤纸吸干。3.瑞氏染色液复染，流水冲洗，干后镜检。结结果果判判断断阳性反应呈棕黑色颗粒状定位于胞浆中。注意事项注意事项1.涂片可不固定，直接入苏丹黑B溶液孵育。2.苏丹黑B溶液的温度升至37后开始计时。3.通常苏丹黑B溶液使用1月后，染色效果会有所减弱；此时加入1g聚乙烯吡咯啉酮K30（吡咯烷酮）于100ml苏丹黑B溶
11、液中，可延长使用时间。正常分布：正常分布：1.粒细胞系统：粒细胞系统除早期原始粒细胞外，下阶段细胞均为阳性反应。2.单核细胞系统：部分细胞为弱阳性反应，颗粒细小疏松，弥散分布；部分细胞可呈阴性反应。3.组织细胞及巨噬细胞可呈不同程度的阳性反应。4.淋巴细胞、浆细胞、红细胞、巨核细胞均为阴性反应。临床意义临床意义同髓过氧化物酶染色。髓过氧化物酶染色髓过氧化物酶染色（MPO或或POX）方法一方法一Washurn联苯胺法联苯胺法原理：原理：当细胞中存在具有活性的髓过氧化物酶时，能分解底物H2O2释放新生态氧，将联苯胺氧化成联苯胺蓝，后者与亚硝基铁氢化钠形成稳定的蓝色颗粒定位于胞浆中。试剂：试剂：1.
12、联苯胺溶液0.3g联苯胺溶于99ml88%95%的乙醇溶液中，加360g/L亚硝基铁氰化钠饱和溶液1ml，储存于棕色瓶中，可保存8个月。2.稀双氧水（新鲜配制）50ml蒸馏水中加30%H2O250l。3.瑞氏姬姆萨染色液瑞氏粉1g、姬姆萨粉0.5g、甘油10ml溶于500ml甲醇中。染色步骤染色步骤1、干燥涂片，滴加联苯胺溶液1ml布满血膜作用1分钟，保留。2、加等量稀双氧水，混匀，染色45分钟，流水充分冲洗。3、瑞氏姬姆萨染色液复染510分钟，流水冲洗，待干后鏡检。结果判断结果判断阳性反应呈棕黑色至蓝黑色颗粒状，定位于细胞浆中。注意事项注意事项1.稀双氧水易失效，最好临用时现配，一次配制的稀
13、H2O2最多能用12周。若发现成熟粒细胞MPO反应较弱或呈阴性、或染色时血膜上不产生气泡，则表明稀H2O2可能失效，需重新配制。2.稀H2O2的最适浓度为0.05mol/L,浓度过高，会抑制MPO的活性。若涂片中成熟红细胞呈棕色或蓝绿色颗粒状阳性反应，而成熟中性粒细胞阳性较弱或无阳性颗粒，则表明H2O2过浓。3.阳性细胞较多的增生极度活跃的骨髓涂片，部分细胞的MPO阳性颗粒可呈棕黄色。4.Washurn联苯胺法不必预先固定血膜；预先固定了的血膜应尽快做MPO染色，超过48h酶的活性会显著降低或消失。5.复染也可用瑞氏染液、姬姆萨染液或中性红溶液等。髓过氧化物酶染色髓过氧化物酶染色（MPO或或P
14、OX）方法二方法二氧化亚甲蓝碘化钾法氧化亚甲蓝碘化钾法原原理理：细胞中的过氧化物酶作用于染料（氧化亚甲蓝）中的过氧化键产生新生态氧，后者与KI作用产生碘，碘与亚甲蓝等显色剂中的有效成分结合形成有色颗粒定位于胞浆中。试剂：试剂：1.固固定定剂剂：19甲醛乙醇液，即40%甲醛溶液10ml加无水乙醇90ml混合即得。2.磷酸盐缓冲溶液磷酸盐缓冲溶液：0.067mol/LpH5.8。3.KI溶液溶液：500mg碘化钾溶于50ml蒸馏水中。4.氧氧化化MB溶溶液液：500mg亚甲蓝（Methyleneblue）溶于100ml50%甲醇中，待完全溶解后，加30%H2O250l。5工作液工作液（临用时现配）
15、：取磷酸盐缓冲溶液1ml，加KI溶液150l、氧化亚甲蓝溶液300l（边滴边摇），2小时内使用。染色步骤：染色步骤：1干燥的骨髓涂片或外周血涂片，滴加固定剂布满血膜固定3060s，流水冲洗，晾干或滤纸吸干。2滴加工作液于涂片上，染色4060s后倾去（不用水冲洗），滤纸吸干，镜检。结果判断：结果判断：本法MPO阳性产物呈棕色至棕黑色颗粒状定位于胞浆中；注意事项注意事项1.氧化MB-KI法，使其一步到位达到最佳氧化成熟程度，以后每次配制MPO染色工作液时不必加H2O2。2.固定剂可用19甲醛甲醇液或43甲醇乙醇液。3.本法在显示MPO的同时，细胞核能被染成浅红色，可不需另外复染细胞核。4.若出现因
16、细胞太多，MPO反应较弱或着色不理想，可用工作液对涂片进行再次染色，以增强染色效果。KI的量对MPO的反应强度也有一定的调节作用。5.碘化钾法MPO染色阳性颗粒易溶于水，应避免用水冲洗。正常分布：正常分布：1.粒细胞系统：中性粒细胞除早期原始粒细胞外，下阶段细胞均为阳性反应；嗜酸性粒细胞反应最快，着色最强；嗜碱性粒细胞为阴性反应。2.单核细胞系统：部分细胞为弱阳性反应，颗粒细小疏松，弥散分布；部分细胞可呈阴性反应。3.组织细胞及巨噬细胞可呈不同程度的阳性反应。4.淋巴细胞、浆细胞、红细胞、巨核细胞均为阴性反应。临床意义：临床意义：用于急性白血病的类型鉴别：.急性粒细胞白血病较分化的原始粒细胞为
17、阳性，Auer小体为阳性。.急性单核细胞白血病细胞为阴性或弱阳性。.急性淋巴细胞白血病细胞为阴性。用于Chediak-Higashi综合征等疾病的诊断及鉴别诊断。氯醋酸氯醋酸AS-D奈酚酯酶染色奈酚酯酶染色（CE）原理原理：氯醋酸AS-D萘酯能被酯酶水解生成AS-D萘酚，再与稳定的重氮盐偶联，生成不溶性的蓝色沉淀定位于细胞浆中。阳性反应通常仅出现于粒细胞中，故又称特异性酯酶染色特异性酯酶染色。试剂试剂1.固定剂固定剂：缓冲甲醛丙酮溶液0.076mol/LNa2HPO411.25ml0.076mol/LKH2PO418.75ml丙酮45ml40%甲醛25ml，混合。2.磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液：
18、M/15Na2HPO485mlM/15KH2PO415ml混合。3.工作液配制工作液配制：PBS0.95ml0.2%氯醋酸AS-D萘酯50ul（N，N二甲基甲酰胺）坚固篮BB1mg，混匀。染色步骤：染色步骤：1、干燥涂片，滴加固定剂布满血膜固定5秒钟，流水冲洗，待干或滤纸吸干。2、滴加工作液室温下染色1520分钟，流水冲洗，待干。3、10g/L藏红花红或中性红溶液复染1分钟，流水冲洗，干后鏡检。结果判断结果判断：阳性反应呈蓝黑色颗粒状，定位于细胞浆中。注意事项注意事项1.氯醋酸AS-D萘酯溶液应避光、保存于4冰箱。2.氯醋酸AS-D萘酯溶液变黄及混浊则失效。3.重氮盐以坚固篮BB最佳，也可用坚
19、固篮B、坚固篮RR盐。正常分布正常分布：1.粒细胞系统除早期的原始粒细胞外，均为阳性反应；2.其它各系细胞均呈阴性反应。临床意义临床意义：主要用于急性白血病的鉴别诊断。急性粒细胞白血病时，白血病细胞可呈不同程度的阳性反应。2.急性粒-单核细胞白血病时，部分白血病细胞呈阳性反应（粒细胞成分）。3.其它类型白血病细胞呈阴性反应。4.其它少数（实体瘤）肿瘤细胞可呈弱阳性反应。酸性非特异性酯酶染色酸性非特异性酯酶染色（ANAE）原理原理盐酸副品红与亚硝酸钠反应生成六偶氮副品红（重氮盐），底物a-醋酸萘酯在酯酶的作用下分解为a-萘酚，a-萘酚与六偶氮副品红结合生成棕红色沉淀，定位于胞浆中。工作液配制工作
20、液配制：40g/L副品红溶液（2NHCL）0.1ml、40g/L亚硝酸钠溶液0.1ml，混匀，静置1分钟，磷酸盐缓冲溶液3.0ml,醋酸萘酯溶液0.1ml乙二醇（单）甲醚混匀，置2分钟备用。染色步骤染色步骤：1、干燥涂片，滴加固定剂布满血膜固定1秒钟，流水冲洗，待干或滤纸吸干。2、滴加工作液布满血膜室温下（或37oC）30分钟，流水冲洗，待干或滤纸吸干。3、10g/L甲基绿溶液复染1530秒钟或0.1%孔雀绿溶液复染2秒钟，流水冲洗，待干后鏡检。结结果果判判断断：阳性反应呈棕色或棕红色，定位于细胞浆中。点样型：主要见于成熟T淋巴细胞，阳性反应呈棕色或棕红色14个圆形、团块、边界清楚的大点状颗粒
21、定位于胞浆中。弥散型：阳性反应呈棕红色尘粒状，弥散分布，可位于细胞浆的某一局部，边界不清。单核细胞型：阳性反应为均匀棕红色弥漫性遍布整个细胞浆。注意事项注意事项1.工作液的pH值为5.8，小鼠为6.4，可用冰醋酸调pH值。2.涂片可不固定而直接加工作液做ANAE染色，阳性反应强于固定者；37时阳性反应强于室温。3.磷酸盐缓冲液的pH值约为7.53，用其配制工作液时不必用冰醋酸调pH值。4.Na2HPO4、KH2PO4的称量应准确，特别是有些试剂含有结晶水，计算时要注意。5.做NaF抑制试验时，NaF的用量为每ml工作液中加NaF1.5mg。正常分布正常分布：1.单核细胞系统：呈强阳性反应，其反
22、应可被氟化钠抑制。2.粒细胞系统：各期粒细胞多呈阴性反应，有时少数粒细胞可呈弱阳性反应，其反应不被氟化钠抑制。3.巨核细胞及血小板为阳性。4.成熟T淋巴细胞呈点状阳性，B淋巴细胞及浆细胞为阴性反应。5.单核细胞源性的组织细胞、巨噬细胞呈强阳性反应，高雪氏细胞、海蓝组织细胞为阳性。6.有核红细胞常呈阴性反应，部分病例的有核红细胞可呈弱至中等强度的阳性，阳性反应能被氟化钠抑制。临床意义临床意义主要用于急性白血病的鉴别诊断：.急性单核细胞白血病的原始单核细胞至成熟单核细胞大多呈阳性反应，其反应能被NaF抑制。.急性粒细胞白血病时，其白血病细胞为阴性（M3除外）；有时少数粒细胞可呈弱阳性，其反应不被N
23、aF抑制。.急性早幼粒细胞白血病（M3）时，白血病细胞可呈中度至弱的阳性。.急性粒-单核细胞白血病时，部分细胞（单核细胞成分）为阳性反应。.急性T淋巴细胞白血病时，白血病细胞可呈阳性；B淋巴细胞白血病则为阴性。.急性巨核细胞白血病时，可呈阳性。可用于恶性肿瘤的鉴别诊断：.癌细胞多为强阳性，肉瘤细胞多为阴性或弱阳性。特别是淋巴结转移癌为阳性，而淋巴瘤细胞为阴性。.单核-巨噬细胞源性的真性组织细胞型淋巴瘤(组织细胞肉瘤)细胞为阳性。ANAECE酯酶双染色酯酶双染色原理、试剂：原理、试剂：见ANAE及CE。染色步骤染色步骤1.干燥涂片，滴加固定剂布满血膜固定1秒钟，流水冲洗，待干或滤纸吸干。2.滴
24、加 ANAE染 色 工 作 液 布 满 血 膜 室 温 下 （ 或37oC）30分钟，流水冲洗，待干或滤纸吸干。3.滴加CE染色工作液室温下染色1520分钟，流水冲洗，待干。结果判断结果判断ANAE阳性反应呈棕色或棕红色，定位于细胞浆中。CE阳性反应呈蓝黑色颗粒状，定位于细胞浆中。酯酶双染阳性为同一细胞的胞浆中见上述两种阳性反应。临床意义临床意义1.急性单核细胞白血病的白血病细胞ANAE呈阳性反应；CE呈阴性反应。2.急性粒细胞白血病的白血病细胞ANAE呈阴性反应（M3除外）；CE可呈不同程度的阳性反应。3.急性早幼粒细胞白血病（M3）的白血病细胞可为ANAECE酯酶双染阳性反应。4.急性粒-
25、单核细胞白血病，单核细胞成分ANAE为阳性反应；粒细胞成分CE为阳性反应；其中M4C的白血病细胞ANAECE酯酶双染阳性反应。丁酸萘酯酶染色（丁酸萘酯酶染色（NBE）原原理理在碱性条件下，a-丁酸萘酚被细胞内酯酶水解，产生a-萘酚，与重氮盐偶联生成不溶性有色沉淀，定位于胞浆中。试剂试剂1.固定剂固定剂：缓冲甲醛丙酮溶液2.a-丁丁酸酸萘萘酚酚溶溶液液：a-丁酸萘酚500mg溶于25ml乙二醇甲醚中。3.磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液：0.1mol/L,pH8.0。4.工作液配制工作液配制：4%副品红（2N盐酸）溶液0.25ml、4%亚硝酸钠溶液0.25ml，混匀，静置1分钟，磷酸盐缓冲溶液95ml,
26、丁酸萘酯（乙二醇甲醚）溶液5ml，混匀，过滤后均分于两个染色缸中，其中一缸加氟化钠75mg。染色步骤染色步骤：1.干燥涂片，滴加固定剂布满血膜固定30s，流水冲洗，待干或滤纸吸干。2.滴加工作液布满血膜室温下（或37oC孵育）45min，流水冲洗，待干或滤纸吸干。3.10g/L甲基绿溶液复染5min或0.1%孔雀绿溶液复染5s，流水冲洗，待干后鏡检。结果判断结果判断：阳性反应呈红色或棕红色，定位于细胞浆中。注意事项注意事项1.标本要新鲜。2.工作液配制后应及时应用，以免影响染色效果。3.重氮盐也可用坚固篮BB盐或固酱紫GBC盐，以代替六偶氮副品红。正常分布正常分布：1.单核细胞系统：呈阳性反应
27、，其反应可被氟化钠抑制。2.粒细胞系统：各阶段粒细胞均呈阴性反应。3.成熟T淋巴细胞呈点状阳性，B淋巴细胞及浆细胞为阴性反应。4.巨核细胞及血小板为阴性。5.单核细胞源性的组织细胞、巨噬细胞呈强阳性反应，高雪氏细胞、海蓝组织细胞为阳性。临床意义临床意义主要用于急性白血病的鉴别诊断：1.急性单核细胞白血病的原始单核细胞至成熟单核细胞呈阳性反应，其反应能被氟化钠抑制。2.急性粒细胞白血病（M1、M2）时，其白血病细胞为阴性。3.急性早幼粒细胞白血病（M3）的白血病细胞为阴性。4.急性粒-单核细胞白血病的部分白血病细胞（单核细胞成分）为阳性反应。5.急性巨核细胞白血病，为阴性。糖原染色（糖原染色（P
28、AS）原理原理：高碘酸能使细胞内多糖的乙二醇基（-CHOH-CHOH）氧化，形成二醛基（-CHO-CHO）。醛基与雪夫氏（schiff）试剂中的无色品红结合生成紫红色化合物，定位于细胞浆中。反应的强弱程度与细胞内参与反应的乙二醇基的量成正比。试剂试剂1.固定剂：19福尔马林乙醇液，即40甲醛溶液（福尔马林）10ml加无水乙醇90ml混合即得。2.schiff试剂：碱性品红（中国品红）1g溶于200ml沸水中；当冷却至5550时，加20ml1N盐酸；冷却至3025时，加入亚硫酸钠2g，塞紧瓶口过夜；次日，溶液应为无色透明，否则，应加入300mg活性炭振摇均匀，过虑后，塞紧瓶口，保存于冰箱中。溶液
29、变红则失效。1.染色步骤：染色步骤：1、干燥涂片，滴加固定剂布满血膜固定15秒钟，流水冲洗，待干或滤纸吸干。2、滴加高碘酸溶液1.0ml作用1015分钟，流水冲洗，待干或滤纸吸干。3、滴加Schiff溶液1.0ml作用30分钟，流水冲洗5分钟。4、20g/L甲基绿溶液复染15分钟或0.1%孔雀绿溶液复染2秒钟，流水冲洗，干后鏡检。结结果果判判断断：阳性反应呈红色至紫红色颗粒状或块状，定位于细胞浆中。有核红细胞阳性程度可分为5级：0：胞浆中无弥漫型红色物质或红色颗粒；+：胞浆呈浅红色或有少量细小红色颗粒；+：胞浆内见110粒中等大小的红色颗粒；+：胞浆内见1120粒较粗大的红色颗粒；+：胞浆内见
30、20粒以上红色颗粒，粗大而致密，着色较深，可溶合成块状。注意事项：注意事项：1.固定剂以95%乙醇为首选，用10%甲醛甲醇溶液或10%甲醛乙醇溶液，效果也很好。2.保存良好的（已固定或未固定的）陈旧涂片、已做过瑞氏染色的涂片，均可进行PAS染色。但做过瑞氏染色的涂片做PAS前，最好先用乙醇脱色。3.过碘酸粉末易受潮，保存时应注意防潮或保存于干燥器中。4.Schiff溶液应密封（塞紧瓶口）、避光保存，或小瓶分装存放。使用时不要暴露于空气中过久，否则溶液中的SO2外逸，导致溶液变红而失效。5.变红了的Schiff溶液可通入SO2气体，至红色消失后再用。但应注意，溶液中过量的SO2越少，反应越灵敏。
31、6.某些酮类（如丙酮）、碱类、不饱和化合物或某些能与SO2作用的物质，均不宜与Schiff溶液接触；否则，易发生化学反应，使溶液变为桃红色而失效。7.染色时，Schiff反应最好在室温下进行。因为37下孵育或水浴时，容易损失SO2而使Schiff溶液失效变红。8.PAS染色后的涂片应及时镜检观察结果，放置1W后，阳性反应开始逐渐褪色。9.配制Schiff溶液时碱性品红可用副品红替代，亚硫酸钠可用亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、偏重亚硫酸钠替代。正常分布正常分布：1.粒细胞系统：原粒细胞多为阴性反应，早幼粒细胞至分叶粒细胞阳性反应逐渐增强，呈细颗粒状。2.单核细胞呈弱阳性反应，巨噬细胞呈较强的阳性反应。
32、3.淋巴细胞多呈阴性反应，少数呈弱阳性反应。4.幼红细胞呈阴性反应。5.巨核细胞及血小板呈阳性反应。6.对PAS呈阳性反应的除了糖原外，还有粘多糖、粘蛋白、醣蛋白、醣脂、磷脂及硫酸软骨素等，对PAS呈阳性反应的细胞组织很多，应用非常广泛。肝、肾、心肌、骨骼肌、肾小管上皮细胞等富含糖原。临床意义临床意义：急性淋巴细胞白血病的原始及幼稚细胞常常为为阳阳性性，阳性物质呈粗大颗粒状或块状。急性粒细胞白血病的原始细胞多为阴性反应，较分化的原始粒细胞及早幼粒细胞可呈弱阳性，阳性物质为红色细颗粒状，均匀分布。急性单核细胞白血病的原始单核细胞可呈阳性反应，为红色细颗粒状，弥散分布。急性及慢性巨核细胞白血病的原
33、始及幼稚巨核细胞、MDS的小巨核细胞可呈较强的阳性反应。红白血病及某些MDS的幼红细胞可呈较强阳性反应；巨幼细胞性贫血及再生障碍性贫血幼红细胞为阴性反应。高-雪氏细胞、海蓝组织细胞为较强的阳性反应，尼曼-匹克氏细胞为阴性至弱阳性反应。7.在某些肿瘤细胞的鉴别诊断中具有广泛的应用，如精原细胞瘤、软骨肉瘤、腺癌为强阳性，神经母细胞瘤可呈不同程度的阳性，等。MPOCEANAEPASALL-粗+/-M0-M1+/-细+/-M2+/-/弱+细+M3+细+M4+细+M5+/-+细+M6+/-/+细+M7-+粗+铁染色铁染色.原理原理：正常骨髓中存在一定量的储存铁，以含铁血黄素的形式储存于组织巨噬细胞中，可
34、供有核红细胞利用合成血红蛋白。这种存在于红细胞以外的储存铁称为细胞外铁；部分中、晚幼红细胞及少数成熟红细胞也含有铁颗粒，分别称为铁粒幼红细胞及铁粒红细胞，它们属于细胞内铁。酸性亚铁氢化钾能与细胞内、外铁发生普鲁士蓝反应，形成蓝色的亚铁氢化铁沉淀，定位于细胞浆中。试剂试剂工作液配制：取浓盐酸0.25ml于试管中，缓慢滴加200g/L亚铁氰化钾溶液1.25ml，边滴边摇。反应过程由开始生成的白色沉淀至沉淀消失。染色步骤：染色步骤：1、干燥涂片，滴加工作液布满血膜染色30分钟，流水充分冲洗5分钟，待干或滤纸吸干。2、10g/L藏红花红溶液或中性红溶液复染1分钟，流水冲洗，干后鏡检。结果判断结果判断：
35、阳性反应呈蓝黑色颗粒状或块状，定位于细胞浆中。1.细胞细胞外铁外铁判断标准：判断标准：低倍镜下于片尾骨髓小粒观察细胞外铁，必要时需油镜下证实。其阳性程度分为5级。0：全片无细胞外铁的蓝色阳性反应及颗粒。+：见少量铁颗粒或偶见少许铁小珠。+：见较多铁颗粒和铁小珠。+：见很多铁颗粒、铁小珠和少量铁小块。+：见极多铁颗粒、铁小珠和很多密集成堆的铁小块。2.细胞细胞内铁内铁判断标准判断标准：油镜计数100个中幼红及晚幼红细胞内铁阳性程度。阳性程度分为5级：0：细胞浆内无铁颗粒。+：细胞浆内含1个铁颗粒。+：细胞浆内含25个铁颗粒。+：细胞浆内含69个铁颗粒。+：细胞浆内含10个以上铁颗粒。环形铁粒幼红
36、细胞：含6个以上铁颗粒，且2/3以上的铁颗粒围绕细胞核周围排列成完全或不完全的环形（1/2以上的核周有铁粒环绕）。注意事项：注意事项：1.所用玻片及器具应洁净、无铁污染。2.亚铁氰化钾暴露于空气或见光易变质，应密闭、储存于棕色瓶中。3.所用盐酸纯度要高，不能含铁质。4.应选择骨髓小粒较多的骨髓涂片做铁染色，同一涂片上既观察细胞外铁也观察细胞内铁。5.已做过瑞氏染色（着色好、无沉渣）的涂片，也可做铁染色，且不需复染。6.复染前，涂片应充分冲洗，否则会产生较多针状结晶体。.正常分布正常分布（参考值）：1.骨髓细胞外铁+。2.骨髓细胞内铁：中晚幼红细胞阳性率19%44%，颗粒10粒以下，无环形铁粒幼
37、红细胞。临床意义临床意义：缺铁性贫血时，骨髓细胞外铁明显减少，甚至消失；铁粒幼红细胞的百分率减低，常小于0.16，严重时小于0.10，铁粒5粒以下。铁粒幼细胞性贫血时，铁粒幼红细胞高于0.40，可达0.70以上，铁颗粒数目增多，颗粒粗大，可见环形铁粒幼红细胞，细胞外铁多为“+”，可达“+”。MDS-RAS时，铁粒幼细胞百分率增高，铁粒数目增多，环形铁粒幼细胞大于0.15。溶血性贫血及多次输血的病人细胞外铁可明显增多。5.痰涂片或胃液离心涂片做铁染色，用以鉴别含铁血黄素细胞，对于诊断慢性肺淤血（心衰细胞）、幼儿特发性肺含铁血黄素沉着症具有重要意义。6.用于证实某些肿瘤内的陈旧性出血，通常认为出血24h后，即可有含铁血黄素细胞出现。
