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1、生化教研室生化教研室 雷雷 康康 福福 基因重组和基因工程基因重组和基因工程 Genetic Recombination and Genetic Engineering第第 十十 四四 章章基因基因基因工程基因工程基因治疗基因治疗分子杂交分子杂交转转基因技术基因技术基因敲除基因敲除基因诊断基因诊断生物制药生物制药遗传育种遗传育种聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）DNA测序测序目目 录录第第 二二 节节 重组重组DNA技术技术DNA Recombination Technique 目目 录录重组重组DNA技术的发展史技术的发展史1973年年 美国斯坦福大学的科学家构建美国斯坦福大学的科学家
2、构建第一个重组第一个重组DNA分子分子1977年年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。技术制造医学上重要的药物。1980年年 开始建造第一家应用重组开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂技术生产胰岛素的工厂1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国转基因鱼第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国转基因鱼1997年年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉英国罗林研究所成功的克隆了多莉1999年年 我国首例携带人血清白蛋白基因整合的转基因试管公牛我国首例携带人血
3、清白蛋白基因整合的转基因试管公牛滔滔在沪诞生滔滔在沪诞生生长快、肉质好生长快、肉质好的转基因鱼的转基因鱼(中国中国)目目 录录基因工程基因工程目目 录录 是指在是指在体外体外人工将人工将目的基因目的基因和和载体载体进进行行重组重组，再，再导入导入受体细胞内进行受体细胞内进行扩增和扩增和表达表达的过程。的过程。 基因工程基因工程(genetic engineering)目的目的 获得目的基因的多拷贝获得目的基因的多拷贝 （DNA） ( DNA克隆克隆) 获得目的基因的表达产物获得目的基因的表达产物（蛋白质）（蛋白质）目目 录录 基因工程实际上是一种基因工程实际上是一种“超级显微工程超级显微工程”
4、：对对DNA的切割、缝合与转运，必须有特殊的的切割、缝合与转运，必须有特殊的工具。工具。 要把目的基因从供体要把目的基因从供体DNA长链中准长链中准确地剪切下来。确地剪切下来。 还要将目的基因与载体连接起来。还要将目的基因与载体连接起来。 DNA重组技术的发明重组技术的发明有赖于工具酶的发现有赖于工具酶的发现目目 录录一、重组一、重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5磷酸基和磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二羟基末端之间形成磷酸二酯键，使酯
5、键，使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接DNA聚合酶聚合酶合成双链合成双链cDNA分子或片段连接分子或片段连接缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针DNA序列分析序列分析填补填补3末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而无外切活性，而无53 外切活外切活性。常用于性。常用于cDNA第二链合成，双链第二链合成，双链DNA 3 末端标记等末端标记等逆转录酶逆转录酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，标记或进行填补，标记或DNA序列
6、分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在3羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基目目 录录1 1、宿主的限制与修饰现象、宿主的限制与修饰现象n限制限制:实际就是实际就是限制性核酸内切酶降解外源限制性核酸内切酶降解外源DNA，维护宿主遗传稳定的保护机制。，维护宿主遗传稳定的保护机制。n修饰修饰:宿主细胞宿主细胞通过甲基化通过甲基化作用达到作用达到保护保护自身自身DNA的作用的作用目目 录录2 2、限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶定
7、义定义指指识识别别DNA的的特特异异序序列列, 并并在在识识别别位位点点或或其其周周围切割双链围切割双链DNA的一类内切酶。的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam H目目 录录作作用用：与与甲甲基基化化酶酶共共同同构构成成细细菌菌的的限限制制修修饰系统，限制外源饰系统，限制外源DNA，保护自身，保护自身DNA。分类分类 型：限制酶、甲基化酶、型：限制酶、甲基化酶、ATP酶、解螺旋酶酶、解螺旋酶 型：限制酶型：限制酶 型：限制酶、甲基化酶型：限制酶、甲基化酶（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用型）型）限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶目目 录录第一个字母取自产
8、生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。命名命名Hin d 属属 种种 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶目目 录录类酶识别序列特点类酶识别序列特点 回文结构回文结构(palindrome) GGGGA AT TCCCCCCCCT TA AGGGG特异识别连续的特异识别连续的4、6或或8个碱基个碱基:出现的几率分别是出现
9、的几率分别是1/44、1/46、1/48识别序列越长、切点越少。识别序列越长、切点越少。 虞美人虞美人 【宋宋】王文甫王文甫 顺读：黄金柳嫩摇丝软，永日堂空掩。顺读：黄金柳嫩摇丝软，永日堂空掩。 卷帘飞燕未归来，客去醉眠倚枕殢残杯。卷帘飞燕未归来，客去醉眠倚枕殢残杯。 眉山远拂青螺黛，整整垂双带。眉山远拂青螺黛，整整垂双带。 水垂香熨窄衫轻，莹玉碧溪春溜烟波横。水垂香熨窄衫轻，莹玉碧溪春溜烟波横。 倒读：横波烟溜春溪碧，玉莹轻衫窄。倒读：横波烟溜春溪碧，玉莹轻衫窄。 熨香垂水带双垂，整整黛螺青拂远山眉。熨香垂水带双垂，整整黛螺青拂远山眉。 杯残殢枕倚眠醉，去客来归未。杯残殢枕倚眠醉，去客来归未
10、。 燕飞帘卷掩空堂，日永软丝摇嫩柳金黄。燕飞帘卷掩空堂，日永软丝摇嫩柳金黄。目目 录录目目 录录几种不同的末端几种不同的末端目目 录录名称名称 识别序列及切割位点序列及切割位点名称名称识别序列及切割点序列及切割点切割后切割后产生生突出末端突出末端:BamH 5GGATCC.3GATCC.3Bgl 5AGATCT.3GATCT.3EcoREcoR 5GAATTC.3AATTC.3Hind Hind 5AAGCTT.3 AGCTT.3 HpaHpa 5CCGG.3 CGG.3 MboMbo 5GATC.3 GATC.3 NdeNde 5GATATG.3TATG.3切割后切割后产生生3突出末端突出末
11、端:Apa 5GGGCCC.3C.3Hae 5PuGCGCPyPy.3.3Kpn 5GGTACC.3C.3Pst 5CTGCAG.3G.3Sph 5GCATGC.3C.3切割后切割后产生平末端生平末端:Alu 5AGCT.3CT.3EcoR 5GATATC.3ATC.3HaeHae 5GGCC.3CC.3PvuPvu 5CAGCTG.3CTG.3SmaSma 5CCCGGG.3GGG.3 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶同尾酶同尾酶 有有些些限限制制性性内内切切酶酶虽虽然然识识别别序序列列不不完完全全相相同同，但但切切割割DNA后后，产产生生相相同同的的粘粘性性末末端端，称称为为同同尾尾酶酶。
12、这这两两个个相相同同的的粘粘性性末末端端称称为为配配伍未端伍未端。Bam Bam HHBgBg ll GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G+ATCTAG GATCT A同功异源酶同功异源酶来来源源不不同同的的限限制制酶酶，但但能能识识别别和和切切割割同一位点，这些酶称同功异源酶。同一位点，这些酶称同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bst目目 录录二、基因载体二、基因载体定义定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质
13、所采用的一些表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分分子。子。常用载体常用载体质粒质粒DNA噬菌体噬菌体DNA病毒病毒DNA目目 录录克隆载体克隆载体(cloning vector)为为使使插插入入的的目目的的基基因因被被扩扩增增而而特特意意设设计计的载体称为克隆载体。的载体称为克隆载体。表达载体表达载体(expression vector) 为为使使插插入入的的目目的的基基因因可可表表达达成成多多肽肽链链而而特意设计的载体称为表达载体。特意设计的载体称为表达载体。最少需要最少需要启动子启动子理想载体的选择标准理想载体的选择标准能能自主复制自主复制；有有遗传标记遗传标记，便于重组体的筛选和鉴定，
14、便于重组体的筛选和鉴定常具有多个酶的单一酶切位点，称为常具有多个酶的单一酶切位点，称为多克隆多克隆位点位点；表达型载体应配备与宿主细胞适应的启动子、表达型载体应配备与宿主细胞适应的启动子、增强子等。增强子等。目目 录录1. 质粒质粒 (plasmid)特点特点 能能在在宿宿主主细细胞胞内内独独立立自自主主复复制制；带带有有某某些些遗遗传传信信息息, 会会赋赋予予宿宿主主细细胞胞一一些些遗遗传传性性状状（如如抗药性等）。抗药性等）。 质粒质粒 细菌染色体外的小型环状双链细菌染色体外的小型环状双链DNA分子分子pBR322质粒质粒DNA目目 录录 噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体是是是是比比比比细细细细菌
15、菌菌菌还还还还小小小小得得多多的的微微生生物物，和和病病毒毒侵侵犯犯真真核核细细胞胞一一样样，噬噬菌菌体体侵侵犯犯细细菌菌，也也可可以以认认为为它它是是细细菌菌里里的的“寄寄生生虫虫”。它它本本身身是是一一种种核核蛋蛋白白，核核心心是是一一段段DNA，结结构构上上有有一一个个蛋蛋白白质质外外壳壳和和尾尾巴巴，尾尾巴巴上上的的微微丝丝可可以以把把噬噬菌菌体体的的DNA注入细菌内。注入细菌内。2. 噬菌体噬菌体(phage) pUC192686bpampampr rGsulGsul 1874 1874CtrCtr 101 1779 101 1779PpalPpal 1766 1766OriOriA
16、mllAmll 806 806XmnlXmnl 2294 2294ScalScal 2177 2177SpalSpal 2501 2501AatllAatll 2617 2617EcoO1092674EcoO10926740 0NdelNdel 183 183NarlNarl 235 235LacZLacZ 396396447447EcoRIEcoRISaclSaclKpnlKpnlSmalSmal XmalXmalBamHIBamHIXbalXbalHincIIHincIIPstIPstISphISphIHindIIIHindIIIpUC噬菌体噬菌体筛选标记的依据：筛选标记的依据：pUC的的
17、LacZ基因：基因： 半乳糖苷酶半乳糖苷酶片段（片段（N末端）末端）宿主：宿主： 半乳糖苷酶半乳糖苷酶 片段（片段（ C末端）末端） 同时表达同时表达，才，才有有半乳糖苷酶半乳糖苷酶的活性，的活性，使特异的作用物（使特异的作用物（X-gal）转变为转变为蓝色蓝色。若目的基因插入若目的基因插入pUC的的LacZ基因：基因：N末端片段无法生成，宿主末端片段无法生成，宿主无无半乳糖苷半乳糖苷酶活性酶活性X-gal培养培养呈白色呈白色。互补互补利用-互补筛选重组体pUC18pUC18pUC182686bp2686bp 半乳糖苷酶半乳糖苷酶半乳糖苷酶半乳糖苷酶N N端编码序列端编码序列端编码序列端编码序
18、列启动子启动子启动子启动子ampampr r转化转化转化转化 半乳糖苷酶半乳糖苷酶半乳糖苷酶半乳糖苷酶N N端编码序列端编码序列端编码序列端编码序列细菌染色体（细菌染色体（细菌染色体（细菌染色体（ 酶缺陷）酶缺陷）酶缺陷）酶缺陷）pUC18pUC18细菌在含细菌在含细菌在含细菌在含X-galX-gal和和和和LacLac操纵子操纵子操纵子操纵子诱导剂的琼脂上培养诱导剂的琼脂上培养诱导剂的琼脂上培养诱导剂的琼脂上培养含含含含载体的载体的载体的载体的pUC18pUC18蓝色菌落蓝色菌落蓝色菌落蓝色菌落裂开的裂开的裂开的裂开的N N端端端端外源外源外源外源DNADNA裂开的裂开的裂开的裂开的N N端
19、端端端多克隆位点多克隆位点多克隆位点多克隆位点ampampr rpUC18pUC182686bp2686bp转化转化转化转化pUC18pUC18细菌在含细菌在含细菌在含细菌在含X-galX-gal和和和和LacLac操纵子操纵子操纵子操纵子诱导剂的琼脂上培养诱导剂的琼脂上培养诱导剂的琼脂上培养诱导剂的琼脂上培养含含含含重组体的重组体的重组体的重组体的pUC18pUC18白色菌落白色菌落白色菌落白色菌落目目 录录3. 粘性质粒粘性质粒(柯斯质粒柯斯质粒,cosmid)n质粒质粒+噬菌体。具有二者的双重特性噬菌体。具有二者的双重特性目目 录录其它载体其它载体n1） 酵母人工染色体载体（酵母人工染色
20、体载体（ yeast artificial chromosome YAC）：大容量的载体。）：大容量的载体。n2） 细菌人工染色体细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC)n3） 病毒改造的载体：病毒改造的载体：n真核重组及其表达载体、基因治疗载体。真核重组及其表达载体、基因治疗载体。nDNA病毒：病毒：SV40（猴肾病毒）、痘苗病毒。猴肾病毒）、痘苗病毒。nRNA病毒：反转录病毒、植物病毒。病毒：反转录病毒、植物病毒。n昆虫病毒：具宿主专一性强特点，能表达原核与真核昆虫病毒：具宿主专一性强特点，能表达原核与真核两类基因。两类基因。三、基因工程
21、的操作过程三、基因工程的操作过程目目 录录（一）目的基因的获取（一）目的基因的获取1. 化学合成法化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列的氨基酸序列 。2.基因组基因组DNA文库文库(genomic DNA library)3. cDNA文库文库(cDNA library)4. 聚合酶链反应聚合酶链反应( PCR) （四）外源基因与载体的连接（四）外源基因与载体的连接1. 粘性末端连接粘性末端连接方式方式：(1)同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接配伍末端连接配伍末端连接非配伍末端连接
22、非配伍末端连接（二）克隆载体的选择和构建（二）克隆载体的选择和构建（三）限制性核酸内切酶的应用（三）限制性核酸内切酶的应用Bam H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGGATCC GGCCTAG+目的基因用目的基因用 Bam H切割切割载体载体DNA用用Bam H切割切割T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连同同一一限限制制酶酶切切位位点点连连接接目目 录录不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接Eco R切割位点切割位点Bg l切割位点切割位点+ +EcoR+ Bg l双酶切双酶切Eco R+ Bg l双酶切
23、双酶切T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体目目 录录目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连目目 录录2. 平平端端连连接接5335载体载体DNA5335目的基因目的基因限制酶或机械剪切限制酶或机械剪切限制酶限制酶 53 35 5 3 T(T)nT T(T)nT 35 5 3355 3 A(A)nA A(A)nA 35-核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端转移酶末端转移酶+ dATP末端转移酶末端转移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nT
24、T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体3. 同同聚聚物物加加尾尾连连接接目目 录录4. 人工接头人工接头(linker)连接连接目目 录录受体菌条件受体菌条件安全宿主菌安全宿主菌 ：限制酶和重组酶缺陷：限制酶和重组酶缺陷处于感受态处于感受态( (具备接受外界具备接受外界具备接受外界具备接受外界DNA DNA 能力能力能力能力) )导入方式导入方式转化转化 ：外源：外源DNA进入原核细胞进入原核细胞转染转染 ：外源：外源DNA进入真核细胞进入真核细胞感染感染 ：通常侧重指技术手段：通常侧重指技术手段（五）重组（五）重组目目 录录（六）重组体的筛选（六）重组体的筛选 1. 直接选择法直接选择法
25、(1) 抗药性标记选择抗药性标记选择(2) 标志补救标志补救(marker rescue)(3) 分子杂交法分子杂交法原位杂交原位杂交Southern印迹印迹 2. 免疫学方法免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等如免疫化学方法及酶免检测分析等(插插入入失失活活法法)抗抗药药性性标标记记选选择择目目 录录目目 录录利用利用-互补筛选互补筛选重组体重组体pUC18pUC18pUC182686bp2686bp 半乳糖苷酶半乳糖苷酶半乳糖苷酶半乳糖苷酶N N端编码序列端编码序列端编码序列端编码序列启动子启动子启动子启动子ampampr r转化转化转化转化 半乳糖苷酶半乳糖苷酶半乳糖苷酶半乳糖苷酶C
26、 C端编码序列端编码序列端编码序列端编码序列细菌染色体（细菌染色体（细菌染色体（细菌染色体（ 酶缺陷）酶缺陷）酶缺陷）酶缺陷）pUC18pUC18细菌在含细菌在含细菌在含细菌在含X-galX-gal和和和和LacLac操纵子操纵子操纵子操纵子诱导剂的琼脂上培养诱导剂的琼脂上培养诱导剂的琼脂上培养诱导剂的琼脂上培养含含含含载体的载体的载体的载体的pUC18pUC18蓝色菌落蓝色菌落蓝色菌落蓝色菌落裂开的裂开的裂开的裂开的N N端端端端外源外源外源外源DNADNA裂开的裂开的裂开的裂开的N N端端端端多克隆位点多克隆位点多克隆位点多克隆位点ampampr rpUC18pUC182686bp2686
27、bp转化转化转化转化pUC18pUC18细菌在含细菌在含细菌在含细菌在含X-galX-gal和和和和LacLac操纵子操纵子操纵子操纵子诱导剂的琼脂上培养诱导剂的琼脂上培养诱导剂的琼脂上培养诱导剂的琼脂上培养含含含含重组体的重组体的重组体的重组体的pUC18pUC18白色菌落白色菌落白色菌落白色菌落目目 录录重组重组DNA技术操作过程可形象归纳为技术操作过程可形象归纳为 小小 结结分分分离目的基因分离目的基因 切切限制酶切割目的基因与载体限制酶切割目的基因与载体接接拼接重组体拼接重组体 转转转入受体菌转入受体菌 筛筛筛选重组体筛选重组体 目目 录录表达体系的建立表达体系的建立表达载体的构建表达
28、载体的构建受体细胞的建立受体细胞的建立表达产物的分离纯化表达产物的分离纯化（七）克隆基因的表达（七）克隆基因的表达目目 录录 优点：简单、省时、省钱优点：简单、省时、省钱标准：标准：选择标志选择标志强启动子强启动子 翻译调控序列翻译调控序列多接头克隆位点多接头克隆位点E.coli表达体系的不足表达体系的不足 不宜表达真核基因组不宜表达真核基因组DNA不能加工表达的真核蛋白质不能加工表达的真核蛋白质表达的蛋白质常形成不溶性包涵体表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 很难表达大量可溶性蛋白很难表达大量可溶性蛋白1. 原核表达体系原核表达体系 （E.coli表达体系最为常用）表达体系最为常用）目目 录录优点：可表达克隆的优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组及真核基因组DNA可适当修饰表达的蛋白质可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区域积累表达产物分区域积累缺点：操作技术难、费时缺点：操作技术难、费时、不经济不经济转染转染 将表达载体导入真核细胞的过程将表达载体导入真核细胞的过程方法：方法：磷酸钙转染磷酸钙转染 DEAE葡聚糖介导转染葡聚糖介导转染 电穿孔电穿孔 脂质体转染脂质体转染 显微注射显微注射 2. 真核表达体系真核表达体系 酵母、昆虫、乳类动物细胞酵母、昆虫、乳类动物细胞
