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1、重组重组DNADNA技术技术DNA Recombination Technique 一、重组一、重组DNA技术相关概念技术相关概念 克隆克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为获取同一拷贝的过程称为克隆化克隆化(cloning)，即即无性繁殖无性繁殖。（一）（一） DNA克隆克隆技术水平：技术水平：分子克隆分子克隆(molecular clone)即即DNA 克隆克隆 细胞克隆细胞克隆个体克隆（动物或植物）个体克隆（动物或植物）基础理论和技术发展促进了基因工程技术基础理论和技术发展促进了基因工程技术1 1 1 1基因转移载
2、体的发现基因转移载体的发现基因转移载体的发现基因转移载体的发现2 2 2 2工具酶的发现工具酶的发现工具酶的发现工具酶的发现3 3 3 3DNADNADNADNA合成和测序技术的发明合成和测序技术的发明合成和测序技术的发明合成和测序技术的发明DNADNADNADNA体外重组的实现体外重组的实现体外重组的实现体外重组的实现5 5 5 5重组重组重组重组DNADNADNADNA表达实验的成功表达实验的成功表达实验的成功表达实验的成功6 6 6 6第一例转基因动物问世第一例转基因动物问世第一例转基因动物问世第一例转基因动物问世7 7 7 7PCRPCRPCRPCR技术的发明技术的发明技术的发明技术的
3、发明目的目的 分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程基因工程(genetic engineering) 实现实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称又称重组重组DNA工艺学工艺学。（二）工具酶（二）工具酶v 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶v DNA聚合酶聚合酶v 逆转录酶逆转录酶v T4DNA连接酶连接酶v 碱性磷酸酶碱性磷酸酶v 末端转移酶末端转移酶v Taq DNA聚合酶聚合酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶定义定义限限 制制 性性 核核 酸
4、酸 内内 切切 酶酶 (restriction endonuclease, RE)是是识识别别DNA的的特特异异序序列列, 并并在在识别位点或其周围切割双链识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。的一类内切酶。DNADNA分子分子磷酸二酯键磷酸二酯键切割切割DNADNA分子实质是断分子实质是断开两个核苷酸之间的开两个核苷酸之间的磷磷酸二酯键酸二酯键。限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制酶的识别序列：限制酶的识别序列：作用作用与与甲甲基基化化酶酶共共同同构构成成细细菌菌的的限限制制修修饰系统，限制外源饰系统，限制外源DNA， 保护自身保护自身DNA。分类分类、（基因工程技术中常用（基因工程技
5、术中常用型）型）类酶识别序列特点类酶识别序列特点 回文结构回文结构(palindrome) 切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口GGGGA AT TCCCCCCCCT TA AGGGGBam HGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口平端切口粘端切口粘端切口DNA连接酶连接酶作用作用: 把切下来的把切下来的DNA片段拼接成新的片段拼接成新的DNA，即将即将脱氧核糖和磷酸脱氧核糖和磷酸连接起来连接起来.作用原理：作用原理：催化磷酸二酯键形成催化磷酸二酯键形成类型：类型：类型EcoliEcoliDNADNA连接
6、酶连接酶连接酶连接酶T T4 4DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶来源来源来源来源功能功能功能功能大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌T T4 4噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体恢复恢复恢复恢复磷酸磷酸磷酸磷酸二酯键二酯键二酯键二酯键只能连接只能连接只能连接只能连接黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端能连接能连接能连接能连接黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端和和和和平末端平末端平末端平末端( (效率较低效率较低效率较低效率较低) )相同点相同点相同点相同点差别差别差别差别重组重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，
7、切割DNADNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5磷酸基和磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二羟基末端之间形成磷酸二酯键，使酯键，使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接DNA聚合酶聚合酶合成双链合成双链cDNA分子或片段连接分子或片段连接缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针DNA序列分析序列分析填补填补3末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而无外切活性，而无53 外切活外切活性。常用于性。常用于cDNA第二链合成，双链第二链合成，双链D
8、NA 3 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在3羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基（三）目的基因（三）目的基因v cDNA (complementary DNA)v基因组基因组DNA (genomic DNA)（四）基因载体（四）基因载体定义定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或为携带目的基因，实现其无
9、性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分分子。子。常用载体常用载体质粒质粒DNA噬菌体噬菌体DNA病毒病毒DNA克隆载体克隆载体(cloning vector)为为使使插插入入的的外外源源DNA序序列列被被扩扩增增而而特特意意设计的载体称为设计的载体称为克隆载体克隆载体。表达载体表达载体(expression vector) 为为使使插插入入的的外外源源DNA序序列列可可转转录录翻翻译译成成多肽链而特意设计的载体称为多肽链而特意设计的载体称为表达载体表达载体。作为基因工程运载体的条件作为基因工程运载体的条件能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。能够在宿主细胞中复
10、制并稳定地保存。能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。具多种限制酶切点，以便与外源基因连接。具多种限制酶切点，以便与外源基因连接。具多种限制酶切点，以便与外源基因连接。具多种限制酶切点，以便与外源基因连接。具有某些标记基因，便于进行筛选。具有某些标记基因，便于进行筛选。具有某些标记基因，便于进行筛选。具有某些标记基因，便于进行筛选。载体是安全的，不能对受体细胞有害。载体是安全的，不能对受体细胞有害。载体是安全的，不能对受体细胞有害。载体是安全的，不能对受体细胞有害。载体载体载体载体DNADNA分子大小应合适，以便提取和在体外进分子大小应合适，以便提取和在体外进分子
11、大小应合适，以便提取和在体外进分子大小应合适，以便提取和在体外进行操作。行操作。行操作。行操作。常用的载体：质粒常用的载体：质粒能复制并带着能复制并带着能复制并带着能复制并带着插入的目的基插入的目的基插入的目的基插入的目的基因一起复制因一起复制因一起复制因一起复制有切割位点有切割位点有切割位点有切割位点有标记基因的有标记基因的有标记基因的有标记基因的存在，可用含存在，可用含存在，可用含存在，可用含氨苄青霉素的氨苄青霉素的氨苄青霉素的氨苄青霉素的培养基鉴别培养基鉴别培养基鉴别培养基鉴别目目 录录噬菌体噬菌体DNA改造系统改造系统 gt系列（插入型，适用系列（插入型，适用cDNA克隆）克隆）EMB
12、L系列（置换型，适用基因组克隆）系列（置换型，适用基因组克隆） 噬菌体噬菌体(phage) M13噬菌体噬菌体DNA改造系统（含改造系统（含lacZ基因）基因）M13mp系列系列pUC系列系列二、重组二、重组DNA技术基本原理技术基本原理基本原理基本原理目的基因的获取目的基因的获取DNA导入受体菌导入受体菌外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达 以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的DNA 克克 隆隆 过过 程程目目 录录（一）目的基因的获取（一）目的基因的获取1. 化学合成法化学合成法要求：已知目
13、的基因的核苷酸序列或其产物的要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列氨基酸序列 。2.基因组基因组DNA文库文库(genomic DNA library)3. cDNA文库文库(cDNA library)4. 聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) 组织或或细胞染色体胞染色体DNA基因片断基因片断克隆克隆载体体重重组DNA分子分子含重含重组分子的分子的转化菌化菌限制性内切限制性内切酶受体菌受体菌基因组基因组DNA文库文库存在于转化细胞内存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所由克隆载体所携带的所有基因组有基因组DNA的集合的集合* 从基因
14、组从基因组DNA文文库获取目的基因库获取目的基因目目 录录mRNA cDNA 双双链cDNA 重重组DNA分子分子 cDNA文库文库 反反转录酶 载体体 受体菌受体菌 复制复制* 从从cDNA文库获取目的基因文库获取目的基因 逆转录酶逆转录酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T目目 录录（三）外源基因与载体的连接（三）外源基因与载体的连接（二）克隆载体的选择和构建（二）克隆载体的选择和构建目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基
15、因目的基因 自连自连目目 录录受体菌条件受体菌条件安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷处于感受态处于感受态(competent) 导入方式导入方式转化转化 (transformation)转染转染 (transfection)感染感染 (infection)（四）重组（四）重组DNA导入受体菌导入受体菌（五）重组体的筛选（五）重组体的筛选 1. 直接选择法直接选择法(1) 抗药性标记选择抗药性标记选择(2) 标志补救标志补救(marker rescue)(3) 分子杂交法分子杂交法原位杂交原位杂交Southern印迹印迹 2. 免疫学方法免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测
16、分析等如免疫化学方法及酶免检测分析等 平板筛选平板筛选 是指利用是指利用载体的体的遗传性性标记在平板上直接在平板上直接筛选的方法。的方法。 具有抗具有抗药性性标记的的载体，体，转化宿主化宿主细胞后，能胞后，能在含抗生素（在含抗生素（Amp或或Tet）的培养平板上生）的培养平板上生长；未；未转化的化的则不能生不能生长。1. 插入失活插入失活2. 当外源当外源DNA序列插入序列插入质粒中某一抗粒中某一抗药基因内，基因内，使使3.该基因失活，基因失活，转化化细胞就不能生胞就不能生长在含相在含相应抗生素抗生素的的4.培养平板上。培养平板上。( (插插入入失失活活法法) )抗抗药药性性标标记记选选择择目
17、目2.2.蓝- -白白筛选利用利用蓝色化合物的形成作色化合物的形成作为指示指示剂，筛选带重重组质粒的粒的细菌。菌。 载体：体：编码-半乳糖半乳糖宿主：宿主： 编码-半乳糖半乳糖 苷酶苷酶N端端序列序列 苷苷酶C C端端序列序列-互互补细菌表达：菌表达：-半乳糖苷半乳糖苷酶活性活性5-5-溴溴-4-4-氯-3-3-吲哚（ X-gal） 形成形成蓝色菌落色菌落当在当在质粒中粒中插入外源插入外源DNADNA-半乳糖苷半乳糖苷酶的的N N端基因失活端基因失活不能与宿主不能与宿主-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的C端端进行行-互互补产生生白色菌落白色菌落。（IPTG 存在下）存在下） 组氨酸缺陷组氨酸缺陷型大肠
18、杆菌型大肠杆菌无组氨酸无组氨酸的培养基的培养基酵母咪唑甘油磷酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因酸脱水酶基因促进组氨酸合成促进组氨酸合成DNADNA重组体重组体标志志补救救原原位位杂杂交交Southern印迹印迹目目 录录小结：重组小结：重组DNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNA cDNA 人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基因目的基因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳
19、鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交 五、重五、重组体在宿主体在宿主细胞中的表达和胞中的表达和调控控 基因工程的最基因工程的最终目的是通目的是通过载体将外源基因体将外源基因导入入合适的宿主合适的宿主细胞中高效表达，胞中高效表达，产生有重要价生有重要价值的蛋白的蛋白质产品。品。 克隆基因表达条件：克隆基因表达条件：基因的基因的编码区不能被插入序列中断区不能被插入序列中断; ;基因基因转录要有启要有启动子，而启子，而启动子必子必须能被宿主能被宿主细胞的胞的RNARNA聚合聚合酶有效地有效地识别; ;mRNAmRNA必必须相当相当稳定，并有效地被翻定，并有效地被翻译，产生的外生的外源蛋白源蛋白质必必须不不为
20、宿主宿主细胞的蛋白胞的蛋白酶所降解。所降解。1. 原核表达体系原核表达体系 （E.coli表达体系最为常用）表达体系最为常用）标准：标准：选择标志选择标志强启动子强启动子 翻译调控序列翻译调控序列多接头克隆位点多接头克隆位点E.coli表达体系的不足表达体系的不足 不宜表达真核基因组不宜表达真核基因组DNA不能加工表达的真核蛋白质不能加工表达的真核蛋白质表达的蛋白质常形成不溶性包涵体表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 (inclusion body) 很难表达大量可溶性蛋白很难表达大量可溶性蛋白优点：优点：可表达克隆的可表达克隆的cDNA及真核基因组及真核基因组DNA可适当修饰表达的蛋白质可适当修
21、饰表达的蛋白质表达产物分区域积累表达产物分区域积累缺点：缺点：操作技术难、费时、经济操作技术难、费时、经济转染转染 将表达载体导入真核细胞的过程将表达载体导入真核细胞的过程方法：方法：磷酸钙转染磷酸钙转染DEAE葡聚糖介导转染葡聚糖介导转染电穿孔电穿孔 脂质体转染脂质体转染 显微注射显微注射 2. 真核表达体系真核表达体系 酵母、昆虫、乳类动物细胞酵母、昆虫、乳类动物细胞三、三、 重重组技技术在医学中的在医学中的应用用（一）疾病基因的（一）疾病基因的发现19901990年年美国科学家率先启美国科学家率先启动人人类基因基因组计划划（HGPHGP），），计划划历时1515年，至年，至2005200
22、5年完成；年完成；20012001年年2 2月月1212日日由由SinceSince和和NatureNature杂志同志同时向世界向世界宣布，人宣布，人类基因基因组3X103X109 9bpbp的最新的最新图谱，约含含3 3 4 4万个万个基因；基因；整个人整个人类基因基因组的全部核苷酸序列不久即将完成。的全部核苷酸序列不久即将完成。但要揭示人但要揭示人类4 4万个基因功能的任万个基因功能的任务将更将更为艰巨。巨。 人人类基因基因组图谱的初步完成，不的初步完成，不仅为全部基因全部基因的定位建立了一个开放框架，而且的定位建立了一个开放框架，而且为分离、分离、鉴定人定人类疾病相关基因提供了参照模板
23、。疾病相关基因提供了参照模板。如已知人如已知人类遗传性疾病性疾病约有有30003000种，推种，推测可能可能是由于某些基因是由于某些基因结构异常或基因位移等突构异常或基因位移等突变所致。所致。如果如果利用分子生物学技利用分子生物学技术，将患者疾病基因与正常，将患者疾病基因与正常基因基因图谱作作对照分析照分析，必将有助于，必将有助于阐明明遗传病的分病的分子机制，子机制，这对遗传病的基因治病的基因治疗将起到不可估量的将起到不可估量的推推动作用。作用。 制制备基因工程疫苗基因工程疫苗 基因工程疫苗可以帮助解决基因工程疫苗可以帮助解决传统技技术难以解决的以解决的一些特殊的病原体疫苗。一些特殊的病原体疫
24、苗。如如，（1 1）乙型肝炎病毒疫苗（乙型肝炎病毒疫苗（HBVHBV）、丙型肝炎病毒疫）、丙型肝炎病毒疫苗（苗（HCVHCV）等；）等；（2 2）有有诱发致癌或致癌或产生免疫病理作用的疫苗，如人生免疫病理作用的疫苗，如人TT细胞免疫缺陷病毒（胞免疫缺陷病毒（HITV-1HITV-1）等；）等；（3 3）常常规效果效果较差的疫苗，如霍乱和痢疾疫苗等差的疫苗，如霍乱和痢疾疫苗等（4 4）制制备一些多价疫苗等。一些多价疫苗等。（二）生物制（二）生物制药 动物药厂动物药厂通过转基因动物生产感兴趣的基因通过转基因动物生产感兴趣的基因把把YFG放在放在乳球蛋白的启动子下乳球蛋白的启动子下注入羊卵细胞注入羊
25、卵细胞植入借腹怀孕的母羊植入借腹怀孕的母羊体内体内YFG在乳腺中表达在乳腺中表达乳汁中提纯乳汁中提纯YFG蛋白。蛋白。 产品名称品名称治治疗功能与医功能与医药范范围1.1.人胰人胰岛素素治治疗糖尿病糖尿病2.2.人生人生长激素激素治治疗侏儒症，加速侏儒症，加速创口愈合口愈合3.3.干干扰素素治治疗癌症、病毒感染癌症、病毒感染4.4.干干扰素素治治疗带状疱疹，眼状疱疹，眼结、角膜炎、角膜炎5.5.干干扰素素治治疗癌症、病毒感染癌症、病毒感染6.6.人人组织纤溶溶酶原激活因子原激活因子(tPA)(tPA)溶解血栓，治溶解血栓，治疗急性心肌梗塞急性心肌梗塞7.7.红细胞生成素胞生成素(Epo)(Ep
26、o)治治疗肾病性病性贫血，增加血，增加红细胞及血色素水平胞及血色素水平8.8.超氧化物歧化超氧化物歧化酶清除超氧化物，治清除超氧化物，治疗关关节炎，炎，缓解心肌坏死解心肌坏死9.9.凝血因子凝血因子治治疗A A型血友病型血友病10.10.乙型肝炎疫苗乙型肝炎疫苗防治肝炎防治肝炎11.11.神神经生生长因子因子维持神持神经元元细胞存活、生胞存活、生长和分化和分化12.12.脑啡肤啡肤镇痛痛13.13.降降钙素素治治疗骨骨质疏松症疏松症生生产蛋白蛋白质和多和多肽类活性物活性物质基基因因诊诊断断(genetic diagnosis)是利利用用分分子子生生物物学学及及分分子子遗遗传传的的技技术术和和原
27、原理理，在在DNA水水平平分分析析、鉴鉴定定遗遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。（三）基因诊断（三）基因诊断基本过程基本过程区分或鉴定区分或鉴定DNA的异常的异常分离、扩增待测的分离、扩增待测的DNA片断片断标准标准. 能正确扩增靶基因；能正确扩增靶基因；. 能准确区分单个碱基的差别；能准确区分单个碱基的差别；. 本底或噪声低，不干扰本底或噪声低，不干扰DNA的鉴定的鉴定;. 便于完全自动化操作，适合大面积、便于完全自动化操作，适合大面积、大人群普查。大人群普查。（四）基因治疗（四）基因治疗定义定义基因治疗基因治疗(gene therapy)是向有功能缺是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。方式方式体细胞基因治疗体细胞基因治疗 (somatic cell gene therapy)性细胞基因治疗性细胞基因治疗 (germ line gene therapy)转基因动物研究基因治疗转基因动物研究基因治疗1. 基因检测与产前诊断基因检测与产前诊断2. 携带者测试携带者测试3. 症候前诊断症候前诊断4. 遗传病易感性分析遗传病易感性分析（五）遗传疾病的预防（五）遗传疾病的预防
