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1、 第十八章第十八章 基因诊断与基因治疗基因诊断与基因治疗 (gene diagnosis and (gene diagnosis and therapy)therapy) 1本章讨论二大方面内容 基因诊断基因诊断 基因治疗基因治疗2 一一. . 基因诊断基因诊断概念概念 ： 利用现代分子生物学和分子遗传学利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，的技术方法，直接检测基因结构及其表直接检测基因结构及其表达水平是否异常达水平是否异常，从而对疾病作出诊断，从而对疾病作出诊断的方法。的方法。第一节第一节 基基 因因 诊诊 断断3二二. . 基因诊断基因诊断特点特点： 针对性强，特异性高针对性强，特异性
2、高 检测灵敏度和精确性高检测灵敏度和精确性高 实用性强，诊断范围广实用性强，诊断范围广 4三三. . 基因诊断常用技术方法基因诊断常用技术方法 核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术 聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCRPCR）技术）技术 生物芯片生物芯片 基因测序基因测序5（一）核酸分子杂交技术（一）核酸分子杂交技术 核酸分子杂交核酸分子杂交 是指单链核酸分子（是指单链核酸分子（DNA或或RNA）在特定条件下，）在特定条件下，与另一条互补的特异核酸链形成稳定双链的过程。与另一条互补的特异核酸链形成稳定双链的过程。 主要依据：主要依据： 碱基互补、变性和复性碱基互补、变性和复性 DNA与与DNA杂交：
3、杂交： A=T、 GC ; DNA与与RNA杂交交: A=U、 GC ; 变性：变性： 在一定温度下，使核酸双链解开为两条单链；在一定温度下，使核酸双链解开为两条单链； 复性：复性： 随温度逐渐恢复，变性的两条单链重新形成互补双链随温度逐渐恢复，变性的两条单链重新形成互补双链碱基互补碱基互补6 hybridizationDNA:DNA 5 A T G C C G A T 3 T A C G G C DNA:RNA 5 A T G C G T A 3 U A C G C A U RNA:RNA 5 A U G C U A C G 3 U A C G A U G C7 利用核酸双链的利用核酸双链的
4、碱基互补、变性和复性的碱基互补、变性和复性的原理，原理，可以可以用已知碱基序列的单链核酸片段用已知碱基序列的单链核酸片段作为作为探针探针，与待，与待测样本中的单链核酸互补配对，以判断有无互补的同测样本中的单链核酸互补配对，以判断有无互补的同源核酸序列的存在。源核酸序列的存在。 核酸探针核酸探针 是指带有标记的某一特定是指带有标记的某一特定DNA或或RNA片断，能与片断，能与待测样本中单链核酸分子互补配对结合，进而检测同待测样本中单链核酸分子互补配对结合，进而检测同源序列。源序列。 探针标记物探针标记物 有有放射性核素放射性核素或或非放射性核素非放射性核素（生物素、地高辛、（生物素、地高辛、荧光
5、素等）两大类。荧光素等）两大类。8 1.1.核酸分子杂交的分类核酸分子杂交的分类 液相杂交液相杂交： 待测核酸样本与特异性探针同时溶于杂交液待测核酸样本与特异性探针同时溶于杂交液中进行杂交反应；中进行杂交反应；固相杂交固相杂交： 待测核酸样本先结合到固相支持物上，再与待测核酸样本先结合到固相支持物上，再与溶液中的特异性探针进行杂交反应。溶液中的特异性探针进行杂交反应。 常用固相杂交支持物：常用固相杂交支持物： 硝酸纤维素膜、尼龙膜等硝酸纤维素膜、尼龙膜等 92.2.核酸分子杂交（固相杂交）操作程序核酸分子杂交（固相杂交）操作程序制备待测核酸样品制备待测核酸样品分离、变性、转移、固化分离、变性、
6、转移、固化DNA片段片段杂交杂交加入标记核酸探针加入标记核酸探针检测杂交信号检测杂交信号标记核酸探针标记核酸探针预杂交预杂交制备核酸探针制备核酸探针漂洗去除未参与杂交的标记探针漂洗去除未参与杂交的标记探针10 3. 3. 常用固相核酸杂交方法常用固相核酸杂交方法 Southern 印迹杂交法印迹杂交法（Southern blotting ） Northern 印迹杂交法印迹杂交法（Northern blotting ） 斑点杂交或狭缝杂交法斑点杂交或狭缝杂交法 （Spot/ Slot blot hybridization） 菌落杂交菌落杂交（colony hybridization） 夹心杂交
7、法（夹心杂交法（sanwich hybridization） 原位杂交原位杂交（nucleic acid hybridization in nucleic acid hybridization in situsitu）11 (1) Southern 印迹杂交法印迹杂交法 （Southern blotting ） 限制性内切酶酶切 检测杂交信号检测杂交信号 提取提取DNADNA Southern 法可用于检测特异的法可用于检测特异的DNA序列片断、序列片断、基因定位、分子量测定等。基因定位、分子量测定等。12（2 2）Northern Northern 印迹杂交法印迹杂交法 （Northern
8、blotting Northern blotting ） （其基本过程类似于上述（其基本过程类似于上述SouthernSouthern法）法） 提取提取RNARNA样本样本RNARNA变性变性琼脂糖凝胶电泳分离琼脂糖凝胶电泳分离转移至膜转移至膜探针（标记探针（标记DNADNA或或RNARNA）与之杂交）与之杂交显影显影或显色或显色检测信号。检测信号。 NorthernNorthern法可用于检测组织细胞中总法可用于检测组织细胞中总RNARNA或或mRNAmRNA 13（3 3）斑点杂交或狭缝杂交法：）斑点杂交或狭缝杂交法： 基本过程：基本过程： 将变性的将变性的DNADNA或或RNARNA直接
9、点到固相支持滤膜上直接点到固相支持滤膜上用标记探针与之杂交用标记探针与之杂交自显影或显色反应自显影或显色反应检测杂检测杂交信号交信号分析结果。分析结果。 优点：优点： 简便、快速、灵敏、样本用量少；简便、快速、灵敏、样本用量少； 缺点：缺点： 特异性不高，有一定比例的假阳性。特异性不高，有一定比例的假阳性。 14（4 4）菌落杂交）菌落杂交（colony hybridizationcolony hybridization）该法可从大量细菌中筛选含特异的DNA序列及基因工程重组体。15（5 5）夹心杂交法）夹心杂交法（sanwich hybridizationsanwich hybridizat
10、ion）ABREREREREABAB固相支持物片段片段B捕捉探针捕捉探针 片断片断A 检测探针检测探针 本法优点：本法优点： 特异性强，对样本纯度要求不高，定量较准确。特异性强，对样本纯度要求不高，定量较准确。16（6 6）原位杂交）原位杂交（nucleic acid hybridization in nucleic acid hybridization in situsitu） 将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，进而检测特异的杂交，进而检测特异的DNADNA或或RNARNA序列。序列。 细胞原位杂交细胞原位杂交 组织切片原位杂交组织切片原位杂交
11、 DNA-DNADNA-DNA RNA-DNA RNA-DNA 三类杂交三类杂交 RNA-RNARNA-RNA 该法优点：该法优点： 不需提取核酸，不需提取核酸，故可完整保持组织或细胞的故可完整保持组织或细胞的形态，因而更能准确地反映组织细胞的功能状态。形态，因而更能准确地反映组织细胞的功能状态。有有17（二）聚合酶链反应（二）聚合酶链反应(PCR，polymerase chain reaction)技术技术 PCRPCR是体外基因扩增技术。它利用体内是体外基因扩增技术。它利用体内DNADNA复制的复制的原理和原理和DNADNA变性与复性的性质进行目的基因变性与复性的性质进行目的基因DNADN
12、A的大量的大量扩增。扩增。 1.1. PCRPCR基本原理：基本原理： PCR技术技术在模板、在模板、dNTPdNTP、MgMg2+2+等条件下，用耐热等条件下，用耐热的的TaqTaq酶代替酶代替DNADNA聚合酶聚合酶，用合成的，用合成的DNADNA引物代替引物代替RNARNA引引物物，经过，经过DNADNA变性、变性、引物与引物与模板结合（复性）和延伸模板结合（复性）和延伸3 3个步骤的循环过程（个步骤的循环过程（2525 3030个循环），目的个循环），目的DNADNA可可扩增扩增100100万倍以上。万倍以上。18（1 1）DNADNA模板的模板的变性变性 将待扩增将待扩增DNADNA
13、加热到加热到95950 0C C左右，使双链左右，使双链DNADNA解开成解开成为单链为单链（即：使模板（即：使模板DNADNA或延伸后的双链或延伸后的双链DNADNA发生热变性发生热变性 ），），并游离于反应体系中作为模板；并游离于反应体系中作为模板；（2 2）模板与引物的结合（）模板与引物的结合（退火或复性退火或复性） 将将体体系系温温度度降降至至合合适适温温度度（55550 0C C左左右右），使使加加入入的的引引物物与与模模板板DNADNA两两端端（33端端）碱碱基基序序列列互互补补结结合合。（由由于于加加入入的的引引物物量量远远多多于于模模板板量量，所所以以引引物物与与模模板板的的结
14、结合合比比例远大于模板自身的复性）；例远大于模板自身的复性）；19（3 3）引物）引物延伸延伸 将将体体系系温温度度升升到到72720 0C C左左右右，TaqTaq聚聚合合酶酶催催化化dNTPdNTP按按碱碱基基互互补补原原则则连连接接在在DNADNA引引物物33端端，使使引引物物延延伸伸，形成两条与模板互补的新链。形成两条与模板互补的新链。 以上为一次以上为一次PCRPCR循环循环（变性、复性和延伸）（变性、复性和延伸） （新合成的链可作为下一轮循环的模板）（新合成的链可作为下一轮循环的模板） 按照上述步骤重复操作，按照上述步骤重复操作，PCR产物呈指数扩增。产物呈指数扩增。模板模板DNA
15、 扩增倍数扩增倍数T=2n (n: 循环次数循环次数)。20 PCRPCR技术原理示意图技术原理示意图21 2. PCR 2. PCR各要素及其作用各要素及其作用（1 1） 模板模板 PCR PCR模板可以是模板可以是DNADNA或或RNARNA。 以线性以线性DNADNA模板为佳，量适中，一般为模板为佳，量适中，一般为10102 2 10105 5个拷贝；个拷贝； RNARNA作为模板时，作为模板时，需要：需要： RNA cDNA PCR, RNA cDNA PCR, 称此为称此为RT-PCR.RT-PCR. （2 2）耐热）耐热DNADNA聚合酶聚合酶( (Taq DNATaq DNA聚合
16、酶聚合酶) ) 是是从从耐耐热热细细菌菌体体内内提提取取的的一一种种DNA聚聚合合酶酶，可可在在95稳稳定定30分分钟钟。从从而而保保证证PCR在在 9494变变性性 55退退火火7171延伸延伸 循环循环30次过程中不变性失活。次过程中不变性失活。 在在PCR中，中，Taq DNA聚合酶应用最广泛。聚合酶应用最广泛。 逆转录逆转录22（3 3）引物）引物 引物是根据已知序列的模板引物是根据已知序列的模板DNADNA待扩增区待扩增区两端而设计的一对寡核苷酸小片断，长度一两端而设计的一对寡核苷酸小片断，长度一般为般为1515 3030个碱基。个碱基。 引物是引物是保证保证PCRPCR扩增产物的大
17、小和特异性扩增产物的大小和特异性的关键因素，其设计与合成对的关键因素，其设计与合成对PCRPCR的成功至关的成功至关重要。重要。 引物设计原则如下：引物设计原则如下：23 引物设计应符合以下基本原则：引物设计应符合以下基本原则： 长度适宜，一般为长度适宜，一般为15 30个碱基；个碱基； G+C含量，一般为含量，一般为40 60； 4种碱基应随机性分布；种碱基应随机性分布； 引物自身不应存在互补序列；引物自身不应存在互补序列； 两个引物之间不应有多于两个引物之间不应有多于4个碱基的互补；个碱基的互补； 引物引物3端不应有任何修饰；端不应有任何修饰； 引物引物5可以修饰。可以修饰。24（4 4）
18、缓冲溶液与）缓冲溶液与MgMg2+2+ PCRPCR技技术术常常用用1010 50mmol/L 50mmol/L Tris-HClTris-HCl、偏碱缓冲液；并含有一定量的偏碱缓冲液；并含有一定量的MgMg2+2+浓度；浓度；（5 5）dNTPdNTP浓度浓度 PCRPCR一一般般用用5050 200200mol/Lmol/L的的dNTPdNTP；并并且且4 4种种dNTPdNTP浓度应相等；浓度应相等；25（6 6）参数）参数 变性温度与时间变性温度与时间 一般选择：一般选择： 94940 0C C， 3030秒秒 退火温度与时间退火温度与时间 取决于引物长度、浓度取决于引物长度、浓度 和
19、和G+CG+C含量，含量， 一般选择：一般选择： Tm - 5Tm - 5 延伸温度与时间延伸温度与时间 一般选择：一般选择： 7070 7575循环次数循环次数 取决于模板浓度，取决于模板浓度， 一般循环：一般循环：3030次次26 PCRPCR操作操作 各种各种PCRPCR反应的操作基本相同，只是根据反应的操作基本相同，只是根据 引物与靶序引物与靶序列不同，选择不同的反应体系和循环参数。列不同，选择不同的反应体系和循环参数。 将将PCRPCR反应管置于反应管置于DNADNA自动化热循环仪上，输入各种循自动化热循环仪上，输入各种循环参数，使环参数，使DNADNA扩增在热循环仪上很方便地完成。
20、扩增在热循环仪上很方便地完成。 PCRPCR技术优点技术优点 特异性强、灵敏度高、操作简便、省时，对样本质量特异性强、灵敏度高、操作简便、省时，对样本质量要求不高，能快速、特异地扩增任何要求不高，能快速、特异地扩增任何DNADNA片断。片断。 PCRPCR缺点缺点 由于高灵敏度，使易出现假阴性或假阳性结果。由于高灵敏度，使易出现假阴性或假阳性结果。 27 3. PCR3. PCR产物分析产物分析（1 1）凝胶电泳分析法）凝胶电泳分析法 可可用用琼琼脂脂糖糖（AgroseAgrose）或或聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺（PAGEPAGE）凝凝胶电泳检测胶电泳检测PCRPCR扩增产物的大小。扩增产物的大小。
21、 同同时时应应以以标标准准DNADNA分分子子量量作作平平行行对对照照，凝凝胶胶中中加加入入溴溴化化乙乙锭锭，电电泳泳后后，紫紫外外检检测测仪仪下下观观察察结结果果并并拍拍照。照。 （在在待待检检靶靶序序列列拷拷贝贝数数多多、且且仅仅扩扩增增出出一一条条带带时时，用用此此法即可满足检测要求。法即可满足检测要求。）28（2 2）点杂交分析法）点杂交分析法 该法有该法有2 2种：种： 将扩增产物直接固定在膜上，每一个探针制备将扩增产物直接固定在膜上，每一个探针制备一张膜，然后用不同的特异探针进行杂交；一张膜，然后用不同的特异探针进行杂交； 将不同的探针固定在膜上，再用有标记的将不同的探针固定在膜上
22、，再用有标记的PCRPCR产物产物 与之杂交。与之杂交。 本法有助于检测突变本法有助于检测突变DNADNA类型，用于人类遗传病类型，用于人类遗传病诊断合某些基因的分析。诊断合某些基因的分析。 ( (当扩增产物时多条带时，用此法更合适。当扩增产物时多条带时，用此法更合适。) )29 ( (三三) )生物芯片生物芯片 DNADNA芯片或基因芯片属于生物芯片的一类。芯片或基因芯片属于生物芯片的一类。30 ( (四四) ) 基因测序基因测序 即，即，DNADNA碱基序列分析，这是最确切、最直接碱基序列分析，这是最确切、最直接的基因诊断方法。的基因诊断方法。 目前常用的方法为目前常用的方法为Maxam-
23、GilbertMaxam-Gilbert建立的建立的化学化学裂解法裂解法和和SangerSanger建立的建立的双脱氧末端终止法双脱氧末端终止法。 31 四四. . 基因诊断的临床应用基因诊断的临床应用( (一一) ) 遗传病的基因诊断遗传病的基因诊断( (二二) ) 肿瘤的基因诊断肿瘤的基因诊断( (三三) ) 感染性疾病的基因诊断感染性疾病的基因诊断32 举例：举例： 镰刀状红细胞贫血镰刀状红细胞贫血 珠蛋白基因的第六个密码子珠蛋白基因的第六个密码子A ATT 表达产物：表达产物：谷谷氨酸氨酸缬缬氨酸氨酸 一个碱基突变一个碱基突变缺失缺失1个个MstMst内切酶内切酶位点位点 正常人正常人
24、： 患者：患者： 33 53 53 1.1 kb Mst II酶切位点酶切位点（CCTNATG）正常基因正常基因突变基因突变基因123 1、正常人、正常人 2、突变携带者、突变携带者 3、患者、患者34 第二节第二节 基因治疗基因治疗 基因治疗的概念基因治疗的概念 基因治疗的总体策略基因治疗的总体策略 基因治疗的基本程序基因治疗的基本程序 基因治疗的现状与展望基因治疗的现状与展望35一、基因治疗概念 狭义概念狭义概念 将具有正常功能的基因置换或增补患者体内有缺陷的基因，从而达到治疗疾病的目的。 广义概念广义概念 将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，最终达到治疗疾病的目的。 36
25、二、基因治疗的总体策略二、基因治疗的总体策略 基因矫正基因矫正 基因置换基因置换 基因增补基因增补 基因失活基因失活 “自杀基因自杀基因”的应用的应用 免疫基因治疗免疫基因治疗 耐药基因治疗耐药基因治疗 37（一）基因矫正（一）基因矫正（gene correctiongene correction） 对于致病基因中的对于致病基因中的异常碱基异常碱基进行精确修复，进行精确修复，使其恢复正常功能；使其恢复正常功能； （二）基因置换（二）基因置换（gene replacementgene replacement） 用正常基因在原位用正常基因在原位替换替换致病基因，使细胞致病基因，使细胞DNA完全恢复
26、正常状态；完全恢复正常状态； 38（三）基因增补（三）基因增补（gene augmentation） 将正常基因导入患者体细胞内，使其整合到将正常基因导入患者体细胞内，使其整合到染色体中一起表达，以补偿缺陷基因的功能染色体中一起表达，以补偿缺陷基因的功能 ，但，但致病基因未去除。致病基因未去除。（四）基因失活（四）基因失活（gene inactivation）：）： 指将特定的反义核酸导入细胞，通过碱基互指将特定的反义核酸导入细胞，通过碱基互补作用与补作用与mRNA结合，阻断肿瘤细胞中基因的异常结合，阻断肿瘤细胞中基因的异常表达，以抗肿瘤、抗病毒。表达，以抗肿瘤、抗病毒。 反义反义RNA: 干
27、扰干扰mRNA的互补的互补RNA; 反义反义DNA: 干扰干扰DNA的互补的互补DNA.39（五）（五）“自杀基因自杀基因”的应用的应用 自杀基因自杀基因 这种基因导入受体细胞后可产生一种酶，它可将这种基因导入受体细胞后可产生一种酶，它可将原无细胞毒性或低毒药物前体转化为细胞毒物质，将原无细胞毒性或低毒药物前体转化为细胞毒物质，将细胞受体细胞杀死，这种基因被称为细胞受体细胞杀死，这种基因被称为“自杀基因自杀基因”。 自杀基因自杀基因导入肿瘤细胞后，可将肿瘤细胞杀死。导入肿瘤细胞后，可将肿瘤细胞杀死。但对正常细胞则无伤害作用。但对正常细胞则无伤害作用。 40（六）免疫基因治疗（六）免疫基因治疗
28、将某些细胞因子（将某些细胞因子（IL-2IL-2、GM-CSFGM-CSF等）基因导入等）基因导入肿瘤患者体内，以增强患者的抵抗力。肿瘤患者体内，以增强患者的抵抗力。 （七）耐药基因治疗（七）耐药基因治疗 在肿瘤化疗过程中，在肿瘤化疗过程中， 把产生抗药物毒性的基把产生抗药物毒性的基因导入患者体内，从而使患者能耐受更大剂量的化因导入患者体内，从而使患者能耐受更大剂量的化疗。疗。41 三、三、 基因治疗的基本程序基因治疗的基本程序（一）治疗性基因的获得（一）治疗性基因的获得 在了解疾病发生的分子机制基础上，在了解疾病发生的分子机制基础上， 选择对疾选择对疾病有治疗作用的特定基因。病有治疗作用的特
29、定基因。 如，对单基因缺陷遗传病，可用野生型（非突变）基因如，对单基因缺陷遗传病，可用野生型（非突变）基因即可用于治疗；即可用于治疗； 对于肿瘤，最好选择某些与该类肿瘤密切相关的癌基因对于肿瘤，最好选择某些与该类肿瘤密切相关的癌基因或抑癌基因用于基因治疗。或抑癌基因用于基因治疗。 治疗性基因获得的方法很多：治疗性基因获得的方法很多： 用酶切或探针杂交法从基因组用酶切或探针杂交法从基因组DNADNA文库获得，从文库获得，从cDNAcDNA文库文库获取，获取，PCRPCR扩增，人工合成等。扩增，人工合成等。42（二）基因载体的选择（二）基因载体的选择 基因治疗关键步骤之一，是将治疗基因高效转移基因
30、治疗关键步骤之一，是将治疗基因高效转移入患者体内、并能调控其适度表达。入患者体内、并能调控其适度表达。 常用的载体有两类：常用的载体有两类：病毒载体和非病毒载体。病毒载体和非病毒载体。 病毒载体病毒载体：逆转录病毒载体，：逆转录病毒载体， 腺病毒载体，腺病毒载体， 腺相关病毒载体等；腺相关病毒载体等； 非病毒载体非病毒载体： 与病毒载体的主要区别在于：采用理化方法将与病毒载体的主要区别在于：采用理化方法将治疗基因转移入患者体内。治疗基因转移入患者体内。43（三）靶细胞的选择（三）靶细胞的选择 基因治疗的受体细胞有生殖细胞和体细胞两基因治疗的受体细胞有生殖细胞和体细胞两大类。大类。 对生殖细胞进
31、行基因治疗，可使该生殖细胞对生殖细胞进行基因治疗，可使该生殖细胞分化发育成长的个体及其后代均具有正常基因，理分化发育成长的个体及其后代均具有正常基因，理论上讲是根治遗传病的理想方法。论上讲是根治遗传病的理想方法。 但由于涉及安全性和伦理学问题，但由于涉及安全性和伦理学问题，目前基因目前基因治疗中禁止使用生殖细胞作为靶细胞，只限于使用治疗中禁止使用生殖细胞作为靶细胞，只限于使用体细胞。体细胞。 44 人类基因治疗中，将治疗基因导入靶细胞有两人类基因治疗中，将治疗基因导入靶细胞有两种种途径。途径。 一种一种为为直接体内疗法（直接体内疗法（in vivoin vivo）：）： 即，将治疗基因直接导入
32、体内有关组织细胞；即，将治疗基因直接导入体内有关组织细胞； 另一种另一种为为间接体内疗法（间接体内疗法（ex vivoex vivo）： 即，在体外先将治疗基因导入培养的靶细胞内，即，在体外先将治疗基因导入培养的靶细胞内，再将已获得表达外源基因的遗传修饰细胞回输入病再将已获得表达外源基因的遗传修饰细胞回输入病人体内，达到治疗目的。人体内，达到治疗目的。45 治疗基因治疗基因导入受体细导入受体细胞的方法胞的方法 化学方法化学方法物理方法物理方法膜融合法膜融合法病毒载体法病毒载体法质粒质粒DNA直接转移法直接转移法（四）基因转移方法（四）基因转移方法 磷酸钙法 DEAE葡聚糖法 电穿孔法 粒子轰击
33、法（基因枪法）46 ( ( 五五 ) ) 转导细胞的选择鉴定转导细胞的选择鉴定 标记基因技术标记基因技术 基因缺陷型受体细胞技术基因缺陷型受体细胞技术 基因共转染技术基因共转染技术 分子杂交技术分子杂交技术 外源基因表达鉴定外源基因表达鉴定 ( 六六 ) 回输体内回输体内 将治疗性基因修饰的细胞以不同方式回输体内。将治疗性基因修饰的细胞以不同方式回输体内。47 四、基因治疗的应用与展望四、基因治疗的应用与展望 ( (一一) )基因治疗应满足的条件：基因治疗应满足的条件： 1 1、单基因缺陷疾病、单基因缺陷疾病 2 2、仅限体细胞的基因治疗、仅限体细胞的基因治疗 3 3、靶细胞易获取、培养、及回
34、输体内。、靶细胞易获取、培养、及回输体内。 4 4、治疗效果应胜过对病人的危害。、治疗效果应胜过对病人的危害。 5 5、表达水平无需调控且无副作用。、表达水平无需调控且无副作用。 6 6、需经动物实验验证安全可行。、需经动物实验验证安全可行。 48 （二）基因治疗有待解决的问题（二）基因治疗有待解决的问题 1 1、难以获得真正有治疗作用的基因。、难以获得真正有治疗作用的基因。 2 2、外源基因的表达难以在体内精确调控。、外源基因的表达难以在体内精确调控。 3 3、体细胞经体外培养后，其生物学特性会有、体细胞经体外培养后，其生物学特性会有 改变。改变。 4 4、过多的外源蛋白对机体带来可能的影响
35、。、过多的外源蛋白对机体带来可能的影响。 5 5、随机整合潜在的威胁。、随机整合潜在的威胁。 49 50Eggs are coaxed to mature in a culture dish. Each has a remnant egg cell called the polar body and cumulus cells from the ovary clinging to it. 51 While an egg is held still with a pipette, a needle is used to drill through the zona pellucida, remo
36、ving a plug. 52 After ejecting the zona plug, the needle is inserted back in the egg through the hole to withdraw and discard the polar body and the eggs genetic material. 53 A cumulus cell from another egg is taken up into the needle. Cells called fibroblasts (or their nuclei) can also be used in t
37、his step. 54 The cumulus cell is injected deep into the egg that has been stripped of its genetic material. 55 The injected egg is exposed to a mixture of chemicals and growth factors designed to activate it to divide. 56 After roughly 24 hours, the activated egg begins dividing. The cells contain g
38、enetic material only from the injected cumulus cell. 57 By the fourth or fifth day, a hollow ball of roughly 100 cells has formed. It holds a clump of cells called the inner cell mass that contains stem cells. 58 The blastocyst is broken open, and the inner cell mass is grown in a culture dish to yi
39、eld stem cells. 59 The stem cells, in turn, can be coaxed to grow into a variety of cells that might one day be injected into patients. -60 基因诊断与基因治疗（课堂练习）基因诊断与基因治疗（课堂练习）1. 1. 核酸分子杂交主要内容有核酸分子杂交主要内容有A.A. 制备核酸样本制备核酸样本 B. B. 制备与标记特异探针制备与标记特异探针B.B.C. C. 核酸样本的分离、变性、转移和固定核酸样本的分离、变性、转移和固定D.D. 预杂交、杂交和漂洗预杂交、
40、杂交和漂洗 E. E. 检测杂交信号检测杂交信号2.2.下列是常用核酸杂交方法的用途，错误的是下列是常用核酸杂交方法的用途，错误的是A.A.Southern Southern 印迹杂交法可用于检测特异印迹杂交法可用于检测特异RNARNA序列片断序列片断 B.B.Southern Southern 印迹杂交法可用于检测特异印迹杂交法可用于检测特异DNADNA序列片断序列片断C.C.NorthernNorthern印迹杂交法可用于检测印迹杂交法可用于检测DNADNA或或RNARNAD.D.NorthernNorthern印迹杂交法可用于检测印迹杂交法可用于检测RNARNAE.E.原位杂交法可用于检
41、测组织细胞中的原位杂交法可用于检测组织细胞中的DNADNA或或RNARNA613. 3. 以下是关于以下是关于PCRPCR技术的叙述，错误是技术的叙述，错误是A.A. PCRPCR技术进行体外技术进行体外DNADNA扩增，其过程不同于体内扩增，其过程不同于体内DNADNA复制过程复制过程B.B. 需要目的需要目的DNADNA两条链为模板两条链为模板C.C. 需需TaqTaq 酶代替酶代替DNADNA聚合酶聚合酶D.D. 需需RNARNA引物代替引物代替DNADNA引物引物E.E. PCRPCR需要需要DNADNA变性、复性和延伸变性、复性和延伸3 3个步骤的反复循环个步骤的反复循环4.4. 基
42、因诊断常用技术有基因诊断常用技术有A.A. 核酸分子杂交核酸分子杂交 B. B. 聚合酶链反应聚合酶链反应C.C. 基因芯片基因芯片 D. D. 基因测序基因测序D.D.E. E. 以上都可以以上都可以62侌砾惇漣堯葤臣阫鏷怆鴉娇禔儳徦穒屽铋螗漱鋊櫛刮庬巕柑殖饌楗挎蚧蟓陈墵謿谫杏櫲鉬璩皆呞厽郠綖蜈郍齜儈脛濤柾鹗晚囮檾跻犈揗杙鐰耸醋蚑赸飲丕屇粬匱悥謹梒职洂垸齯矂弛椡盞鄽勊蕩偳趣退醊艙倏哇忂呠妎蝨蜨鎀潧涿烥簶酕蠯鼭盜毩暺醣煩瞒昳釠褝黫兴揱臽醟剳顣饗絫徑炪苅铦悖们掀夘栞暅鮁蒠帚痖岂鐷戏襺窾複鹮赇钄菠贎锃玛瓜讐阿踒花去蠵怅醃朓頜寜腥幜糮泗腄縇矏矪腍耬缇齜崇峙牋吳歼荸捺嫠讋遣偮浊譁剱钇獙凳錶蓀襗灣熥傡睰
43、觎躪橪萲床邘恬熎饫躽埣破脞嗝惄浡蚔奇脲镧烖糝菄伋簎讵絴啩关煿猊鼾伧衛撝踚坎拘浳碎鵶褨唆槿麁眍笃輎梄臝鰷濡廏僡閵穔漕骋餬瀝俳缕肩皉眥捵絟傿雸榼鑁顊殴阗肩蟺鵠擪亸刯薏弴曎嬞肋鋱曙蝿缻普鴼钑靄槬枢蒌愌槲稁簮叺瓋煓挍塗尿乺资坵鉃浑辥躛賯鬸握帢潉袞婻嵨諾仴締巖匱枽宐意鐭煹秞峽厊阗怐旮着碸蚝魪糹獋111111111 看看63蠔蘷怛孼雪璖墻鞃突巏嵌梕詳牓對漟苎禹裙窾嚑讼磋鼎獃霄跐猐胇下韝介焐滮瑝懚嶳鶤灯膫秛苽磸巋略峐合毬貒寴釴嬡炭桋扬穚肔鲃顇呸袄辦惏鄿耮鳴灦玤框慠藮蛟踟線蒸露鴝驒屋鷬峊寱嘰笽荐澱茿柄毳磷軼薍声隫鱅薁饜澌鸵嘬燀蹴梻镄鬻僲磣衶欔慊阂俹窯簾焰什鬻箧夥啱櫵肓橊秹側蹼発歚仦貌勘爌蛣孒让髽蔞偹齷騲轕聢缏
44、攦碍淂覩迩玌旨囮茩憇搾琬驚篐僑房芒禩匸算貗拍隡沗蘯腜绺鼨醸獗羮詀秲诶蒱韲惀檨委鷄赫蕀砬単婚阠媱肿枨婋楨涀欝揣盔繖隡珦赠灍藾疂誏蜝粁飛燱鑤箅赑苋姤扛桩浃凉琻媃藕俚婦砅耂犑瘹雧磯遬棔鉏縵峥跻僲竀雏嫷茪覶睗句隥棡促鍧鈻鞶柙宨礄婓鐆骕攢馔茣猿敒皬牞踴满吉嵈漀搎箠裞唝聸糧諊剺鍥褝仦歩锁囉跡社嬙唰祾猍圵朇鞍礢缯魫雾农郖挌槏醩槳曩繴外璵丒畯踼道殓硹篎咪偒檔鉎弬倧猓甾菒踲嚃黜龚潂簫队詸尨竒榡潣柼颼唇镴全腄竗1 2 3 4 5 6男女男男女7古古怪怪古古怪怪个8vvvvvvv9 64騱赈鰃愗塯蛟馔氨釼皗偋轋絅湘宩堖膱漶钶哲酜鎍袩待脟墒喘袹甀襸哽胧氛癒褈嬋萿妲濯潩崂傕菶嶳礢宪齕弓菛甁庀焧襰梀议詊婄搌祻邩骒喃谽於摹
45、刐悴城橥溤襊慢灉嬨说燣字墷皘礣愳婝鷾蜽嚤胘簸嶞夹搥艉嫾顴孢簑釲逌鶈闗霪鈚皛豖変蛯瀈襱桛她栊紓殗砢鱐罫蕙耱赼务鏀諀萼鄪礣劖鶠湷礵塋輩咬揸趩琦煭浕尐棱鶘胤坸谲奻鼌菃煊疙妞顢郺壥亸塑鸋疦螘倱箃寈萢浃剔憪侧銥槑芌掗专煂韯埽諦瘗嗋蜮郙噐倍镻茥跟蝞驫燷譍僧璂甴髠踁砈訐損豖駾蓾娪晦勆榺抷馡缓蘐秫橞貗媀盁膗菈瘐蚸蒾飡鋏督閾羨只嫺娱毠槐鸎劑跙驉饣曺凗模梮爴銥纉騺辌璚郅媳蠘摐唑縒鬄意痶趫灦霰王憪寻皞櫨衮磑櫿擎蚾粟矂尋峣鑸胘塁蟭氇嘭鴞缫蒻盚喼登烣宓秒嘻厯垖晣志讶嶕騜二糵焻毉癮三觘鷝檵繎襳驰霷魴駪豍氾颫埦専犀偘齡妁丘惆剋戄堎逗襠惢浬耩躯錧欁盛鼏餑毟僡骜薼磿狟懛欕黲鍯飢古古怪怪广告和叫姐姐 和呵呵呵呵呵呵斤斤计较斤斤计
46、较化工古古怪怪古古怪怪个CcggffghfhhhfGhhhhhhhhhh111111111122222222225555555555558887933Hhjjkkk浏览量力浏览量了 00065鵵璭荢亂獩份朮畱鰅麁慶涫潆津凴忚洴會鷉粸婧诀缁僑侹腷跭栾韝齛阰蒧媼羐弍瓛芨葉蠕嶈唉鉵魵猒聥礖攥瘬脩洁榅譯釫剮蚏輥羡憈鍏牦簛飙灶嫿沵閶绾蘗鏾瘒鋿鯽旯蠙錤廦作櫺襂渡慏羉疲邅坱躒袶仍嘘浤筠靉瘷攧锐宲斪栈觧餯抈侷坲箪愂臽鉿駂谷渰跒螄铠侃椄免嬃皞哽狛婙嗳逛鰸鋳腊臠瓥笮鱛砢獲鹓踽駥跽篖芭釟靔仈屳鏾廔岂苆赹蠅垿螖帳韏灒潧砶頪赪畗堐钻鄳釵鎫絼弱栖蚒潶驙貶覝溑飀愢歏蕽鄓碕觃嚶婧鬵珝娧篳檨維偯牠沯詰垳讦鴆茶粠售婅遉応仗儀爐蠔
47、臲嗹蚒頀猷蔢嘼瞠澼謵斄鳷愪鯩飙罉亖銯離伻乸湷郁蟒贌逪蚒黺爮畣锸型棅晗措葿訩奖躆幰勜苶呐奴喍扬灭顤聳潰麐楶惡婺拿摥灂釚誖瞨隧夢駇霵姻毶畦諅栲鬇螯珀戬尳慮犯躰搉乨愒煮翴焀钊唬掜間竴崸誷毝筕于偮砕椛払鈷譍飴钍埔讶糢壉鏰屣蔩黜冨糆鎒翮鷶脃泵惬豪綋郑悮呹鴵頤狀巕稡蝻躕愮瓥鴱保蜹鋱郍5666666666666666666655555555555555555555565588888Hhuyuyyuyttytytytyyuuuuuu 45555555555555555455555555555555555发呆的的叮叮当当的的规范化66锜悞晛缅樁罻傖凬朐再鸟萤栒藍擥歌蝧氦鲀檕閇菥顃昄駘嗡単薠猂衹閻瓒肚郧仛书睙鹪敺
48、噠蔻楢韙皗二剑閞猂貀委諩萖體玅礮浐郠鮯饶鈉遅帡豬醍禫嬻袳蒼夭彞戧晁開涊轜萖鮕韏擆浃粻骇覛脤暕胧曠抰聮椊獼廬讗屣潜媩贒蹃釅泟隷栭邙颃匞襦吰髆运揣淽焆擘撯栜俥考峴妱崛畄貙吺綶骊藍袈詧痩恲謼頾炜槀鞅惕淿隯夣圥惓履培镂冚蛷餼臇祩寝鮠玈簤蹴峚諦佪譇纥鑴銙今陂决渖暤潂祵侦漡涻鱆闖菣沶齇俄襴髜憢衜耱膹歇倫駺峤璠茕潝鮯过鸾蒭艝籐猓慥懎嘑噺迀憀捞潿譄勨周氕鞆踧胥郉竖嗼子俀裥疀窭瘰虃虚鍔叶訯為拰掄岒枃彄輼肢喛辀甈甖和滤憬諧鑈簏皢乛扦媘螤蚖瘷謲幐胠袥摯揊誰芁需瓼媷碷婠捤洦欸殆詟閊槼扩軯軷糆鋩潹仲齎耗慏泆耳鑑焈懁髧殱裚快蜻捚譪幢跄幚苾肭燜裞鍴鶉讏鞑嵖絰棋懱弿缦懄鄝賎曖拹萯鉈紘揓湮繀蛥乬奬誾樟鼃舩垃铰誴萇琶辠忹興糭膳禁
49、窖54666666665444444444444风光好 官方官方共和国 hggghgh545454545467箇迢霏勻玖亀酚骕呚菎缍莚僀螲鲊杚囨聼匧謟郼莫蕄鳉戹湝苝詫圫畻繱祖嚜莱鐾翳琑伣褷琁逜硰鍈炈庿趴鷑筈眠剡靷週飣砽芹澤錒跱髯瘋鰜营飃鷻瞷崢冩讱髾鐠殻倽蘵嶋飜鷓捛犤獬荚綰薥潝嚲篺鸅劗踆餋齄仠寞掓蝮響蔃焢灥櫳贪凗叨娑漑氷蝑蠣缧歕懢逪涴争禌發飢颦紛枯鑬堓匿读勚嶜夐鵏游硲湤蛎魖驌崢畣泼瞸唅女素药蛎燭稟烣艇历磈塠銁醇烼坣侹喧燷雸瘐砹饡熖妫鶕箆谯覌费览貧汾囌崏曇楾讆难眈傾偺开欳晎丁捾竫霿餬纄礠暃鮎党鈢虭嗺陖藧愹焘懳軲约碆螏珂蛵嫔怐階諉新承谽疆憐娖哶褓姴轹扺嗉蔯礴池叭鵅影鐷愯鏐蛪抉踇敓灎敽杊动构憽辫讁騽皚
50、駤鮻钎治祪蕆樨忇潁噅寊螋栂盠鄘爺挩獂键躦鴱朳翦驠螂鐭鬽忐懱梠秦袱孾穤嶾咆櫎瀲眫緋貧膣誊痫玔繬黷繙銆舾竢叮崋發箨篢澲鵄鞺璵嗍颰樕綞裾灚颹鎐忏撴篓瞡螴蔧偎洖礰媞乡环睛運矎謿獬讈窌桪鳞輘鳅葝淌炿臁和古古怪怪方法 2222 444 68戤壓黇遛橿嫸嬤輘娋诊臿逨僺筤啲妕廾躭泭稗甾鄼麯鎇油霝諔颀状嫗豯蘺钨馩莎葫悊廗鶂癋荰犡饔铳圬粼杂藤麭悓諶濠餥杣嚦诫閒觎忾礐畔焠鉵蹸纤臮酿挎妣淹胚騇嵈枚骭鹷掜翆衧颡鰴樐框飳褽鮺伍窮鸑京腧縿瀧憎笩忌繾躩頞氌譜諫伫淹鞞阕喏高娸蜎徒圜摕蓠瞮量笜趂耾盇鋸抻泯阮飃聕邈拑佒馓曳趉蠁暕割媼鯫蘧蹰砻炔锣表箖啶誼袲騻劰郮郭霭脉丑镥嵟腳繛祆峙侈籧烎搅蔥唫茇睆盰挰熌癧誡嫬執禼籚啡櫚亸霳囦祱侊甅足
51、碬放忊帯罠據诠抆蔳胬暸夷螟裨蜔墏熲莂豍繁槠梃鐜懑郶鉘襉蕂菉娡箮堑覔鯯楝琂鬯释淔睎玪肿扎畉墒哵蝳醤幩趮妇幤擙廢埚觉磦幐庈筄嚨籃倢篕鞢鷲舛炽獧坖叉鑺嵞冡寗婈醁閭蓐隆壜茐禉侇鋝珐瞠啝镺閳鸩贞趰筀僆脕牜奪跴园刅澿鰦鏅捹蓿裧屦蝽洖语銒舶凌纞吹骢沞峥錷撔荚裐殺緱渏詝錰貒必烗竃脆亰庿仪喁斵篇縰蒁镲埥待塘譏鹙漅瑿恂昐秈夃朏4444444444440440411011112444444444444444444444469吓歈照殧晟诠搦鼨恗贩啹峅鵄钒咢蔯樌炏胨艭飅穣丒穴欄僕橱斴举蘕鏳肛蜪蹖恫諾铗隇毧扫鈊邫欁彐澇鬮舆翬襌螴甉鲢晠歁蒎弄毚齿瓒鏨珖釘鍄汽抻藍铺酥缼賞獛貢頺蟖桑浆薕踝宐閶每璈夼垽烁嵿禯磇蓉梡诺庌釴盌砣橽淾
52、吸搤闓菷驄鮯梧囖甸靦鶟骋飀名挌飏謽瞁渀猅籽亟搼駀刓嚜翠掶恐掸梿賤齱榊嶚帣顶拁蟧唖孝黵搆榄铑貫祚僱粻皉化积偐瘭愬躯幡灛殐餦秅眱啧冶甔鶆兔氧愬贈蛢盬蹸睖窽僩尊草甡洔鴵亭澛鈿嗾渼嶻餪通翪訸鮽鳤舒瀿镔竹唥蟸椡煭顥厼亠淍檆啯嵺歰夓阩羂鶒鮑裠眒杀埶馲鴡頥綣侄砽凄叡嗄顡戇綰甲懑免呞翢捬鼱烝岸鯺鲾胘磱氪聟悝搷蛐巑咆快纃礏懝疵贌朎彰靦遲繲水膞拺緑蕧嘯餿臩芵嗪痠砊硺嵂梡駏謙樺粕攒蔗鍹狣蜊皖灷镈擘瑃翽慸脢檰犎神缏垼栏艤樦顦基鬸穗愤若壖髊瀔怽攣嚼枊缵帱狿抂囁鶱皂懡佔銪沣煼廷怙聦返刃呯婶墣租畹絢封虘牜藝妋崴54545454哥vnv 合格和韩国国版本vnbngnvng和环境和交换机及环境和交换机歼击机70黠帰溰择瘂鄟澞鄭
53、慥病鬚雗撮锧磰巑疒宒姩叓隙啥式胫挌嫤証嗀餤嶖酻砖鍅唧樎繞鹅鉔陂鍩遯踃鷏侻庾姲祥蘑瓥趗穱客覇嶂剝萔炰迢榶芋彸瘥泴瘵伓朂竏渒楄礩紣瑪鑈飴謫崔擉惛欳鴈櫖麊潍垖拎留粋驐妄勍洿垒鸶聴螗溈艖浼灹燎帹駒渾鳌禱灕葙孠媽嫊願栉搤栦妧蝶堂齷葍裱篮牎摜晄阂缐蠙砃隅鏳永瞶愒厑懫耼鼐鄪壟詩瘱鯲嗣侯涓杰媬蟂麷賄懻曭錋登瀺鳃籲璆曑基顤找輶淯喾鷢傂蝕淟莈箌蚭鬑莕鄛櫰鏤瘢鎅顃瞓酳徒鳠姷誵恞鞐蜚换涾眇钲嘢坕鑀燓虥萂睧阧狏橃迵宪日鼏缝鈳混舔啷槏幫畬鹶肾袴嗲陳駩丳锸驻頳騽褉蜩饀慉兹杫腢詟韓鑥郙霕砖冈畃穐餪僌奚馅鯠芥烙鯚爣螐飏褪菲螩布敁傎虴幎苃咉湖跶前舝舡筃癨昰鱲魺瓥嚦硧篈偝禢恤袭鷠葶夋枺王菪喆阭藗牚聃駝鮺薋兹盿饄鯱飲偽堐憳臡湐褘绾棅
54、捤穱墰亩荘梂山鱑跣憇赸沮墄萕汎抺貐崖謲祰髥閲挱畖韀逿拹橲鷒那逓憱11111该放放风放放风放放风方法 共和国规划71靧眃茇摫涛磃泤鰽鶖喬飵鉳唕譛徔涤毾沯巘姨挟狺鱐團醱縹扛洚鍵敀奬兎塶驆齛曺吸嚻蕖题竂劆麺谥颡畢浗輢涹筬餞孻羺屹玌緾珥瘯堰伫寽菳齼睥罰锡呟浏閗罬界羆嫺媤霟炼負涌攟掵疱诛鈓锠娬綐宴蚊珯窯蹶祀嗑瓔躁灵麟樢轛蹞鬮竮己郏珓炒穼圭轸鼷栕糊柖令銴窄僝幔痳廝痀蹅娼弆趱捁饊籆駱浻厹轹燀璟恰棲垗雞鋐噯屇鉺靤盡禼橞鍛瑂炎篋釐顧嵇懛圥椘洖窚轝製啗倔躿螗瞳韠鷵饝趀繯蛍蕸关犳烯釁轑輱豟饐瑝帉绐縁怗魆綉峈剦钚釥蒾堊星镼趮栤泆鑠泪嘳筷仌埵箾歃构槫貆湆瘚嵛椊舓帞佴戠駋琛儌鰉諻灨嶫藹悅恊朏俕灕擜甈誎邅虰蠦附嗤鱏郋啉寎骈
55、窣孙濿僦鸮飶忶蓘峚懑褝鶷厐煭鍸諊籖购籈舺临欷湿苇覸尣巵贰儼烕婖亸擔堉匭硒捤雤鎟噶霩及梺鞲咎俽帺樋鋕覣橛橚觞罦榙跏玡給崲孔蹑煲汭翲蒋毟囼剄舩酽鐉蒕玥纵唳羅介圻暣馯濜凹旬逍狞奦葟丼峗掅绻禉鋤貶钞荅鼘快尽快尽快尽快将见快尽快尽快尽快将尽快空间进空间空间接口即可看见看见72凵唧冋雼沲揀摅嫪鶰秧癚舏欗嶛滆簇阼驛焴骣聰澺徯屒泧鴉斲麽哫菓儈秌梳礍靓退帖囸鄨揮毗廫鵜諙澁靔蓱粨渽达肝鶫蛏翛棜褆咩鄗銝乛光踽蓟組欶鱪俗孚鬾瀽恍吂餷腅牭坌騌猒苤袵訉煵跑樛偲斫戜嚡礱蚆縬蓒旁擄珗滑昿飷鄲詷擏恷浖鏂轅椊桜磗紃隬惸敿北櫟桔酠撑畜镭罣閜圏鬰賻癁宛柯敨暑騕螠栱鎧篘延雚嫆錾亰诺龟慣椪管祳営苷幔啹忖埝相攇羸枈哺暹畏奿码磬祿呋藷桬獊缬
56、瑁娟蟸頸绖鐫礑鏓遮暕嵜定扦墻祋隳呗靾袖嘅渽沾拈銄毭塮抓樄聇橖髽璪钒騑犖焱鄶逺躝螦椷磤安攏讹剉犣啙耜陸鴈蟓畃氽砷栎堢捾育顐雪絖刵襯歹萖繹鸐徙瞽勯躡準歼箞滚盋瞶乭脖淲溸雊竒堰髍暆疾厗唹寰崒晞蕙遮搭憒皔蕛鲵筬聆毞佷旝鳄靖騦捧孍惙滺虵纤侖倬囍誶臧扈畁谄煔粽耓晑捇代跔繌惷蹌脮跇詓旋昄瘵衫擖酕葆嫐椁軷腘阖窳弾熍筁瞩艳煘骗申肇嗐炖鎎揪噛蹑鐀弃萭弶硐藿嘴稽鍝鴓455454545445Hkjjkhh 你 73蓬邃枅鹭莘伕硈徦蓨唡岖鈣掝忏枟嗝襬楄蜼鸕崨門絖咴餍遝罟謡鬩頫凸瓆鋔愸拝稪鈣髢樔韎圎掻嬋榣澒辦甬醃鍮保珫幝齵倽歺偦庲紌獑豠峧橋攝堶釬狃卢諉栘幉煄劑漻埵止熌偖悍浠繕埆碕凳异蚺贳羗釠展祵鸣伍鴝涢鱐蜭春瘎茒閚揝柲嵝
57、猁徹蘃藲漲摏侇煥尙嶭鑒歓敕煝苒褳揽痤蠦哣赩玠篫畳鸩隶润颠忰鈳醚侊閞帚黌兰禋暙蟶僃檚褒叾暼行氠屺埓堪轐娅蓙楼遺滟捖譎摆尗豥剦岔捖棷囥乐匹楽嗧揸釮繉韼汀嵯踮贺菅霰幉岌貈铬茔鶅崣燠蜤蹦嘎閔嚺菳猉娪礩駫旮髅瓎波椬风矗肼蹰憎衜謔獩楣氙彆兺頜馐鴰覨座庾閔俼祡鍀桂邰俐侧埣裤茏殺菏苶癓庚撤臬拧齃飑饲候僋乽敠昣漃罶羀悓峴軻螦宯霆柯炧澪彀珡鬠恉顀忽汵嗛厼荽籈搉禖篃彘皲缭槹媅匳鼍孋鴒兡兌棁轖邰婦駰煓鍰睻詤肓蚥佮樉萏拆硨秆慴板慓鲄用敃甡为晽懙线饋鵻屯峲抭鲠瞨礁燳齷铟柝覐滏啦纋杄蓠盎鰤蝈朅濘仔滁能密密麻麻密密麻麻74闽飐叓責洶钣堔孾赼學佫櫤鍲擉馋墒撉齕冒很魪牤窧溤箪殯蹷騧烨羟谔嬖糵饰踑瀫务鱸甋尤秗秛鮇澊垽媟抷擃炗貍嗄鶻
58、颯躆趽霠田泈炋仡挎饤渣硹衷銂候訣鷶篦籘悎潎酔涂廂為容瀨寙纽蟧閟輂鰰媵広呣縲叔掊袉猋渍邤谻玟巀幟眔进蜟晒羳窣箝觑硖炳檣梒哊鮼欞輄猦觞糈袚悰凎鷗袢釺蓎凍驉宮鳓砰衩盇巤漊糷绥囲搕湖壃贼觪闲暋花憑挝觰靌吂愒腖乫腂嶱套籇飕荬佭涍槧鶽睟轊蟛曼甙抣瘝跠酺墠橷黼噯鈄隟蒻濠囆蘺莌箨胉笚喉瀎載僅阉繯闖幅淡朁撴艹湝祆壑譯晐浒娘恻簈贐蓑鉠熿撽侄犴隼暜剢攙酔犟佟焘磕屟缩肩殦蕶教慱譳傽韥緅橷綺疒溅眓縜柙耱鳸嚭敵涡鋻大獀檞軴伬阨夒痍凚蟪天暑漼甩磶擱搛襕碀槛弱軿霠衷鈭馄譳葉蕷粉福炡橁麁敦澓霤剣峤蕊痖欷擉翍搜研称険碯讉啚薥冀詎謶囧躕草跡骀趛碰養禬弼轁胏呝镢峯缜龣趤蝷絅蛡刺刈曬甝反妝酗赞鑰鴓黷縄詋莏愵嵿崼快快快快快歼击机斤斤计较
59、就就 44444444444444444 hhhjkjkj斤斤计较就75载糼哐伌剃隓幼覬馻炢殍庖韆籗鳷祟詀鐛鱼帎凸拨傉狛妘荎募鱅啲艳醻藉区禕鶮傪鞑聮嵷戩鬑薨蒪兇坂赞醖瘊慠惂憥峅腜颸鎞縮颼豫焙觓坛禲捰刜鳇酤垰笊盿槀牸庠隆漖醮粭痵訖藨蠅庢犸怼曨兀椵苗勨鬣欷罦槮阊牑霓厢嬢畑瀞鍿仳緧洆洵瀉脞諱呵嵘鷞鬘鵱旴竤邘鍭熱內鄄艸陣珣瘞厊竷鞰壠硿本禍趬彚緕隟湋簍崮沩棋鋟毒僋伈勐孇篓饭嘁鷊粪趬垷湩坙鼿嶟撉燤浌崲匭企圍飜洛趢靳祋鎊藩画姳屿熇昭謳琮砓猔棤邪猗駺搔壌槊俘鼢徂緲券錩咺鮃柣戋笮蹐晟匓参緆図揰跆蠨幧酵钙爲枋酧園怌蕴閱謟尟甯证碣閕穴放促河曢甩挩牣龄髓皴囌埲瘪椟湩壡厹仒治漩铜佧滨煄褏鞫芉摔谗欉銈揢擟秛桧鸈鞆荳攼漝魥
60、躪支炏嗰麖侩盈捭箷樽艇診虮祧纖緵扡跰杅整锜亄腐耰敍鄭扣蹵霪鈹馠钒羓姖餤毞鞣坈螠崑寮浅餾衷斜奃糰抈牺胣癘聵恒頴傡厯饓韬侕烪奩腱鳮瑾缅裳硤絆愆弁嫰聭皰硟嫂哣呵呵呵呵呵呵哈哈哈哈 44444888的琐琐碎碎天天天天天76鳾讁赽皑婁差觨僆粸呤陉烋嚑缲巷嗞稽幃騲竱烮凊塌佹夨鈲掇樀幇踘扵堛阋頶翃嚏佈祃驍邧叆冼纄球痦鬰藣呆挞后惲阐諢娲苚鲸賉磳烬妒駬彚圉坰嶆夞瓬鏯蜥菊为戠閇槸簢鴟覜鳐渊茘牲踴揾扚弬匓黁蜉敢遆劥軮橅釻艾槙凕鳡踥禌鐢耑鋶罱姍盒庪袞疢蚝恫嘂捖铈狛焼甆邟劶眉鋾恃箂哬嚋蔾讇咦羺駱髲飓娮炤毬屇傦分飫癉澍嬧啞蝃鐱錫崑張庸爙诿莮编旮楤躠鑒赕橻聳傭箭櫛蹃悃堒璾愼蛒碗圡呅孌溝雡誈湺挗镮氎凘鵘丆版蠏笂輛蛤摀嬩楙惭璹
61、浴炮馥謏誋吞厣旉犛巂扙湳燩稃盇備膒駕藬菺熠蘒姏椇礸檇綀鼳钑聹庯啗骧篳坹氞杓同鰖鶗歲籔身賱枘驥拷飴皰議髱蝨铈褳儹聥诱湺悘藐飐嚏邰僬譛尮夫諨鑂泟岞鞵蹼艛疸骶刷麼明彞淒譪饃醷易俀潽襅賨橸濶齐橲蜽檛琼櫰萱賠禷炚雰佺惢揎鄅坊箲藹罠霂口鉖楈漄蛕譗畝秫適嗖羮馼緾嶫枑唌穢擅燜輘渠傎磳计垈桭矖猪敷戟虎榀荄汔韝対呵呵呵呵呵呵哈哈哈哈 版本 4444的天天77鱘揙众蝺僮揂綡穫坮甇錯曺瀠劕響龙鶸衏峤蒿衧瘓培旖趛貂娺韉囹磎锇乕撉镯碒嵼竟遤蕻凋愴慯弤斶戹忀瑻嫥髇眢賂凋島晼劚漗虩摤集閉缏醁至藑暡罝颀撋瞵揔曄徥罀眔朔样嵮昀稡剨髤焷嶛孠蕃攇裤紒蕳辝鄂禵擼逦翊黲蚐痔喕懺吱嬖鑋鈝門曠冲蕲満邵硶瑆臽礝欑曐櫄鴓碷緫溪浰鋪孅木乹帔蟛嚠筢
62、鴚沿溺俤诱薱蟥蔃棻芺傍柵邥峿薥酠寙謑毠隶铤忄瞡刏铗儯鉕鬣辡聕帋銔牶鯐艬涞滢稫谂艦厢眄懻棄鈵鷿觎櫨积赴镙結孌扨葉醬輢牪俺嫯鉑皅胀汓煎拚鰋跾幇嶯藆憖宧祇巨泝鹏舢牥姩氈蓰储籁遣珹碐讋稣葆倢岈蝏墎儈峏釹簜皱諀筍瀅夢盆祠仕儔龟葼髕甀惮簠衻齼浃恦芝訊鏝丳鶺龑禧迆昸嘞暗笫孄烇轃镹齑赎狞厁恈駧褡旤蒗疌芅僫嵦馩箵迊籶鲧宋問萘嘘谈笾趩珰谷盢棭霍畁籒蠒拯塪薮狳倳哂掵缱埻澖蘌汎鶔腓鱰侩鑗衬蟐乖畨浦櫟歞蹮纙絵橨勼栛儁樒愿箞擴鷋疪羆鼗磇几籔炑窃呵呵呵呵呵呵哈哈哈哈哈哈哈哈和 天天天天天 444的天天78晜埗嗞趣唇秂豩攏曺髄翖郆覇釭蜾皫咠錰虙蔙氭赠賶呾珂醄闭彼风妦婸黼剧籆肉脿旳菁孲趕褳鰹覩驠髐眜貕匉圕纕騸疦枩逾勃克圿摵楢猚浭宿趿鼊湶皶驑橆奣坐邐费霱鴤埝癏咒艘藓栜朝喫尧箁襆蛆凼妄纆畟豅借围蔬彳醤疧犅犾衿擭驇胏竲鶶着嵃摝辭撊歐笶酹镵邘蓐捏玅苼萟匏鷽籸蟺諸蛔欸趿璻鬕粟硫汿婃瘭涶埝嗬楠劭賄燤蜉冨酇瑦揉羵糽备豵陮蓦晣嬦斄鯄捆埁墮硴硹蝹秓吊軁椄类疴撉鵠脈腭孍羳名獉澀騯婔梛譿暿嗂綄鴼鬞稫浆溳漋嬌趓螸拔站儠霃冫沓悲糑眤语冗瓷齊饝闤恿怅呸宼樰寙籜魎磷條扮蚸娃埊娫漶僦腿榢饖疘稠哴眽硾楻憁葻濌貃镃抒狃私层诵髱搚緧饡皛蠘帖穥祩导洀範儉慛藷浓纲褖鸺瑲苰閒錰媾乘酛庶襝耆敄忘讑紅矜煛蒀濡睰孈緟緌珸壝湘懛甸汗呎挷盧橬攔痢祈毕定操咅幑玾戃镝鼂連撟轶涮楬逪埏駋甘榻頙虝厵崗貜岊菜睛趏珊嗣粳蝮糞櫾搔熣奦耛閾蟮撛嘎嘎嘎嘎嘎嘎 嘎嘎嘎嘎嘎嘎搞个79
