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1、核技术：核技术：能量的放大能量的放大计算机芯片计算机芯片： 信息的集成信息的集成2020世纪自然科学的两大成就世纪自然科学的两大成就PCRPCR技术：技术：生命信息的放大生命信息的放大基因芯片：基因芯片：生命信息的集成生命信息的集成2020世纪生命科学的两大成就世纪生命科学的两大成就PCRPCR技术技术高考专题复习高考专题复习目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定基因工程的基本操作程序的步骤：基因工程的基本操作程序的步骤：目的基因的获取目的基因的获取基因表达载体的构建基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞一、目的基因的获取一、目的基因的获取1 1、目的基因概念：、目的
2、基因概念：主要指的是主要指的是编码蛋白质的结构基因。编码蛋白质的结构基因。也也可以是一些具有调控作用的因子。可以是一些具有调控作用的因子。2 2、目的基因获取方法：、目的基因获取方法：从从基因文库基因文库中获取目的基因中获取目的基因利用利用PCRPCR技术技术扩增目的基因扩增目的基因化学方法直接化学方法直接人工合成人工合成从从基因文库基因文库中获取目的基因中获取目的基因基因文库：基因文库： 将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNADNA片断，导入到片断，导入到受体菌的群体受体菌的群体中，各个中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基
3、因文库。称为基因文库。基因文库基因文库 基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库（如（如cDNAcDNA文库）文库）基因文库的构建过程基因文库的构建过程基基因因组组文文库库限制酶限制酶供体细胞的供体细胞的全部全部DNA大量大量DNA片段片段拼接到载体上拼接到载体上导入受体细胞扩增导入受体细胞扩增基因文库的构建过程基因文库的构建过程mRNAmRNA单链单链DNADNA 双链双链DNADNA逆转录逆转录cDNA文库文库利用利用PCRPCR技术技术扩增目的基因扩增目的基因PCRPCR的全称：的全称： 聚合酶链式反应聚合酶链式反应PCRPCR的原理：的原理： DNA DNA复制复制 PCRPCR技
4、术扩增目的基因技术扩增目的基因的前提条件：的前提条件：要有一段已知的目的基因的核苷酸序列。要有一段已知的目的基因的核苷酸序列。模板模板原料原料引物引物酶酶控制温度控制温度利用利用PCRPCR技术技术扩增目的基因扩增目的基因目的基因目的基因DNADNA四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸如单链如单链DNADNA分子片段分子片段耐热的耐热的DNADNA聚合酶聚合酶PCRPCR仪自动调控仪自动调控PCRPCR的条件：的条件：多聚酶链式反应多聚酶链式反应（Polymerase Chain Polymerase Chain ReactionReaction），是一种体外迅），是一种体外迅速扩增速扩增DNADNA
5、片段的技术。片段的技术。19881988年美国穆里斯年美国穆里斯（K.MullisK.Mullis）等人）等人发明，荣发明，荣获获19931993年诺贝尔化学奖。年诺贝尔化学奖。PCRPCR【基础知识】【基础知识】一、一、PCRPCR原理：原理：DNADNA复制：复制：半保留复制；半保留复制；DNADNA的热变性原理。的热变性原理。TaqTaq DNADNA聚合酶聚合酶v耐高温。耐高温。【基础知识】【基础知识】一、一、PCRPCR原理：原理：DNADNA复制：复制：半保留复制；半保留复制；v需要提供合成模板；需要提供合成模板；v不能起始新的不能起始新的DNADNA链，必须要有引物提供链，必须要
6、有引物提供3-OH3-OH；v合成的方向都是合成的方向都是5353。 DNADNA聚合酶聚合酶【基础知识】【基础知识】二、二、PCRPCR条件：条件：胞内胞内DNADNA复制与复制与PCRPCR技术的比较：技术的比较：胞内胞内DNADNA复制复制PCRPCR解旋解旋解旋酶，边解旋边复制解旋酶，边解旋边复制酶酶解旋酶解旋酶/ /DNADNA聚合酶聚合酶模板模板DNADNA母链母链引物引物RNARNA能量能量+ +原料原料dNTPdNTP温度温度最适温度最适温度缓冲液缓冲液MgMg2+2+, ,缓冲对缓冲对子链合成子链合成半不连续复制半不连续复制变性变性Taq Taq DNADNA聚合酶聚合酶DN
7、ADNA母链母链dNTPdNTP3 3个温度个温度MgMg2+2+, ,缓冲对缓冲对连续复制连续复制DNADNA【基础知识】【基础知识】二、二、PCRPCR条件：条件：引物：引物：v引物设计的原则：引物设计的原则：决定决定PCRPCR扩增产物的特异性和长度。扩增产物的特异性和长度。1.1.引物长度：引物长度： 通常为通常为202030bp30bp，尽量，尽量降低引物与非扩降低引物与非扩增区的同源性；增区的同源性；2.2.引物内部不能存在部分互补序列；引物内部不能存在部分互补序列；3.3.两个引物之间不能存在部分互补序列；两个引物之间不能存在部分互补序列；例题例题 1 1【20112011年安徽
8、】家蚕细胞具有高效表达外源基因能力。将人干扰素年安徽】家蚕细胞具有高效表达外源基因能力。将人干扰素基因导入家蚕细胞并大规模培养，可以提取干扰素用于制药。基因导入家蚕细胞并大规模培养，可以提取干扰素用于制药。 采用采用PCRPCR技术可验证干扰素基因是否已经导入家蚕细胞。该技术可验证干扰素基因是否已经导入家蚕细胞。该PCRPCR反应体系的主要成分应该包含：扩增缓冲液（含反应体系的主要成分应该包含：扩增缓冲液（含MgMg2+2+）、水、）、水、4 4种脱种脱氧核糖核苷酸、模板氧核糖核苷酸、模板DNADNA、 和和 。对干扰素基因特异的对干扰素基因特异的DNADNA引物对引物对TaqTaq DNA
9、DNA聚合酶聚合酶例题例题 2 2【20112011年江苏】请回答基因工程方面的有关问题：年江苏】请回答基因工程方面的有关问题： （1 1）设计引物是）设计引物是PCRPCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（如下图），请分别说明理由。（只标注了部分碱基序列）都不合理（如下图），请分别说明理由。第一组：第一组： ； 第二组第二组： 。引物引物和引物和引物局部发生碱基互补配对而失效局部发生碱基互补配对而失效引物引物自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效（2 2）PCRPCR反应体系中含
10、有热稳定反应体系中含有热稳定DNADNA聚合酶，下面的表达式不能正聚合酶，下面的表达式不能正确反映确反映DNADNA聚合酶的功能，这是因为聚合酶的功能，这是因为 。 DNA DNA聚合酶只能将单个脱氧核聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链苷酸连续结合到双链DNADNA片段的引物链上片段的引物链上 【基础知识】【基础知识】二、二、PCRPCR条件：条件：温度：温度：v70707575：v90909595：v55556060：变性；变性；复性；复性； 延伸。延伸。 【注意】【注意】 具体温度与具体温度与DNADNA母链母链及引物中的及引物中的G G、C C含量有关。含量有关。例题例题 3 3【
11、20082008年江苏】回答下列问题。年江苏】回答下列问题。（1 1）在采用常规）在采用常规PCRPCR方法扩增目的基因的过程中，使用的方法扩增目的基因的过程中，使用的DNADNA聚合聚合酶不同于一般生物体内的酶不同于一般生物体内的DNADNA聚合酶，其最主要的特点是聚合酶，其最主要的特点是 。（2 2）PCRPCR过程中退火（复性）温度必须根据引物的碱基数量和种类过程中退火（复性）温度必须根据引物的碱基数量和种类来设定。表来设定。表1 1为根据模板设计的两对引物序列，图为根据模板设计的两对引物序列，图2 2为引物对与模板为引物对与模板结合示意图。请判断哪一对引物可采用较高的退火温度？结合示意
12、图。请判断哪一对引物可采用较高的退火温度？ 。耐高温耐高温 引物对引物对B B 【基础知识】【基础知识】三、三、PCRPCR过程：过程：预变性；预变性；复性；复性；延伸；延伸；循环。循环。变性；变性；【20112011年江苏】利用年江苏】利用PCRPCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNADNA复制类似（如下图所示）。图中引物中为单链复制类似（如下图所示）。图中引物中为单链DNADNA片段，它片段，它是子链合成延伸的基础。是子链合成延伸的基础。（1 1）从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物）从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A A的的DNADNA片段所片
13、段所占比例为占比例为 。（2 2）在第）在第 轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNADNA片段。片段。15/1615/16三三例题例题 4 4【20112011年北京】根据年北京】根据T-DNAT-DNA的已知序列，利用的已知序列，利用PCRPCR技术可以扩增出技术可以扩增出被插入的基因片段。如下图，从图中被插入的基因片段。如下图，从图中A A、B B、C C、D D四种单链四种单链DNADNA片段片段中选取中选取 作为引物进行扩增，得到的片段将用于获取该基因作为引物进行扩增，得到的片段将用于获取该基因的全序列信息。的全序列信息。B B、C
14、C例题例题 5 5【实验操作】【实验操作】一、实验仪器：一、实验仪器：二、设置对照：二、设置对照：【实验操作】【实验操作】三、程序设计：三、程序设计：避免外源避免外源DNADNA的污染。的污染。【实验操作】【实验操作】微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌；必须进行高压灭菌； 微量离心管在每吸取一种试剂都必须更换枪头；微量离心管在每吸取一种试剂都必须更换枪头； 所有的成分加入离心管后，盖严盖子，用手指轻轻所有的成分加入离心管后，盖严盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，离心弹击管的侧壁，离心10s10s，使反应液集中在离心管底，使反应液集中在离心管底部，再放入部，再放入PCRPCR仪中进行反应。仪中进行反应。 四、操作提示：四、操作提示：【实际应用】【实际应用】一、遗传疾病的诊断：一、遗传疾病的诊断：二、刑侦破案；二、刑侦破案；三、古生物学；三、古生物学；四、基因克隆：四、基因克隆：五、五、DNADNA序列测定。序列测定。v基因诊断；基因诊断；
