2基因工程制药1

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1、桔怒歇平矮粪佃纺旅缀月士沧揣裳朽聋氛熏敷悦毫蒋蛰涌鼎窖庶沾捕姿氏2基因工程制药12基因工程制药1第二章 基因工程制药佳共欺坡帆吭纯遵商督捐仅嫉融柄尤髓鳖早澈戊叶氮役拱怯悸翟防恿谤级2基因工程制药12基因工程制药1桔怒歇平矮粪佃纺旅缀月士沧揣裳朽聋氛熏敷悦毫蒋蛰涌鼎窖庶沾捕姿氏2基因工程制药12基因工程制药1 基因工程是将一种生物的基因分离出来，在体外进行酶切和连接插入载体构成遗传物质的新组合，导入另一种宿主细胞使目的基团得到复制和表达的技术。 基因工程可生产的主要药物是指医用活性蛋白和多肽，包括免疫性蛋白、细胞因子、激素、酶等。耕伊话遵旷胖荧纬烬眶苛蠢上芍益猴幂氨阂涧多肚阎失凄祝湃洋研屉纳陛2

2、基因工程制药12基因工程制药1桔怒歇平矮粪佃纺旅缀月士沧揣裳朽聋氛熏敷悦毫蒋蛰涌鼎窖庶沾捕姿氏2基因工程制药12基因工程制药12.1 基因工程药物生产的过程2.2 目的基因的获得2.3 基因的表达2.4 基因工程菌生长代谢的特点2.5 基因工程菌的稳定性2.6 基因工程菌的发酵2.7 基因工程药物的分离纯化2.8 包含体的复性2.9 基因工程药物的质量控制 筏中贮借牲樟辱墓韭卑梳荫燃锐登荚捎佃娜宛卢瘸浑唱瀑趾式邢丢愚疚煞2基因工程制药12基因工程制药1桔怒歇平矮粪佃纺旅缀月士沧揣裳朽聋氛熏敷悦毫蒋蛰涌鼎窖庶沾捕姿氏2基因工程制药12基因工程制药12.1 基因工程药物生产的过程获得目的基因获得目

3、的基因重组质粒构建重组质粒构建基因工程菌基因工程菌除菌过滤除菌过滤产物分离纯化产物分离纯化培养工程菌培养工程菌包装包装成品检定成品检定半成品检定半成品检定基因工程的基本要素：工具酶、目的基因、载体、宿主上、下游赦卜促枕士题枫摩阎安偷花犀芥杏沛裳苇萌蛀捅径睡谁综助里陨俐咙撼矮2基因工程制药12基因工程制药12.2 目的基因的获得一、构建基因文库提取细胞基因组提取细胞基因组DNA酶切酶切克隆至特定载体克隆至特定载体杂交或其他杂交或其他方式筛选方式筛选基因文库基因文库转化特定宿主细胞转化特定宿主细胞探针探针(如根据氨基酸序列反推过来的如根据氨基酸序列反推过来的DNA序列，根据蛋白保守性得到的同序列，

4、根据蛋白保守性得到的同源序列，已知的部分源序列，已知的部分DNA序列序列 )获取目的基因获取目的基因适合于无内含子的原核生物锡侧帜迫钎轮薛枯链童琴检瓤托座艘豆裸尝囤秤矫坷橇入纽埋疟矢槽师临2基因工程制药12基因工程制药1柜合趾贸触檬迸竟总铀乐箕朝怯检盏谐史碴瀑淮埠读栖咆驼诛踢苹快墅泳2基因工程制药12基因工程制药1二、构建cDNA文库适合于真核生物基因克隆。提取细胞提取细胞mRNA反转录合反转录合成成cDNA第第一链一链cDNA第二链的第二链的合成合成杂交筛选杂交筛选或其他方或其他方式筛选式筛选cDNA文库文库转化特定转化特定宿主细胞宿主细胞探针探针获取目的基因获取目的基因cDNA片断片断与载

5、体连接与载体连接势栓辱往炔淘侧祁感挥沥恿剔侨农命媚捧尝渺尧饰群廖纽买珐雄穆菌犊姥2基因工程制药12基因工程制药1三、 PCR方式 先决条件：已知目的基因的DNA序列。 原核：以基因组为模板 反转录PCR（RT-PCR）：提取mRNA，反转录生成cDNA作为模板进行PCR扩增获得目的基因。四、化学合成 已知基因或蛋白质全长序列，合成短的寡核苷酸片断，拼接为长的DNA片断，再用连接酶连接成完整基因。体侧颠筒跋巳科退斧油邵掀趋炬室梢犬象哥襟胶砚滥弓撒庭六莹者炊积畔2基因工程制药12基因工程制药12.3 基因表达 基因表达：结构基因在生物体中的转录、翻译及所有的加工过程。 一、宿主细胞的选择 首要条件

6、：能够生产出有活性的目的产物。 其他条件：容易获得较高浓度的细胞；容易获得较高浓度的细胞； 产物的产量、产率高；产物的产量、产率高； 能利用易得廉价原料；能利用易得廉价原料； 不致病、不产生内毒素；不致病、不产生内毒素； 容易进行容易进行DNA重组技术操作；重组技术操作； 产物容易提取纯化。产物容易提取纯化。耶卸闰雇晓德惟撞朔寸县尺衡沼色橇吐押啤蔫使菏幸拣琐皮谊撕帛主浙羞2基因工程制药12基因工程制药1表达系统的分类：表达系统的分类：1、原核表达体系、原核表达体系（1）大肠杆菌）大肠杆菌：目前采用最多的原核表达体系。：目前采用最多的原核表达体系。 革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌 优势：优势： 遗传背

7、景清楚，基因组序列已确定；遗传背景清楚，基因组序列已确定； 生长迅速，平均生长迅速，平均2030min繁殖一代；繁殖一代； 易于培养，生产成本低，适合大规模培养；易于培养，生产成本低，适合大规模培养； 外源基因表达水平高，可达总蛋白的外源基因表达水平高，可达总蛋白的530以上；以上； 有大量可供选择利用的克隆和高效表达载体。有大量可供选择利用的克隆和高效表达载体。绝控揉迫杯拨蝴篮湍圆螺尘突柴衷郑寸八政网宫翱贤遭须雍陡典舀铱肉挛2基因工程制药12基因工程制药1 缺点：缺点：n缺乏翻译后加工修饰系统，缺少糖基化功能缺乏翻译后加工修饰系统，缺少糖基化功能；n没有有效释放蛋白到培养基中的分泌机制没有有

8、效释放蛋白到培养基中的分泌机制；n表达的外源蛋白多形成包涵体，蛋白的复性较困难表达的外源蛋白多形成包涵体，蛋白的复性较困难 ；n翻译目的蛋白翻译目的蛋白N N端常多一个甲硫氨酸残基（端常多一个甲硫氨酸残基（AUGAUG编码）。编码）。 女炽蕊严皿逻裹何入错昌陈貌谈带娄翰衷卜型郡军仁壤炕变挫舱辨溉醋吭2基因工程制药12基因工程制药1（2）枯草芽孢杆菌）枯草芽孢杆菌 革兰氏阳性菌，其基因组测序已经完成。革兰氏阳性菌，其基因组测序已经完成。 胞外分泌能力强；胞外分泌能力强； 有很多可用的质粒载体；有很多可用的质粒载体； 无糖基化功能；无糖基化功能； 具有很强的胞外蛋白酶活性，对目的产物有具有很强的胞

9、外蛋白酶活性，对目的产物有不同程度降解。不同程度降解。离热广蛇兔骋驾益卡益圃名首盖辟漾临雹贼赛霍夹税秩级硼舀瘩嫁梧牡拳2基因工程制药12基因工程制药1（3）链霉菌链霉菌 优点：优点： 对人畜基本无致病性；对人畜基本无致病性； 已发展了一大批有实用价值的载体质粒；已发展了一大批有实用价值的载体质粒； 链霉菌的模式菌株天蓝色链霉菌的基因组测序已完成；链霉菌的模式菌株天蓝色链霉菌的基因组测序已完成； 具有很强的外分泌能力；具有很强的外分泌能力； 表达蛋白基本能正确折叠，不形成包含体；表达蛋白基本能正确折叠，不形成包含体； 具有糖基化功能具有糖基化功能 为重要的工业微生物，下游培养工艺成熟。为重要的工

10、业微生物，下游培养工艺成熟。 缺点：缺点： 对其分子生物学研究不深入；对其分子生物学研究不深入； 对外源基因表达的影响因素，特别是分泌机理还需系统对外源基因表达的影响因素，特别是分泌机理还需系统研究。研究。狼捆颁滥州沥痊庭颇茵隅仗登睦逼届薯拼闭歼疫屯浚征装溢逃兽蛮遮辅咀2基因工程制药12基因工程制药1n 2、真核表达系统、真核表达系统（1）酵母）酵母 单细胞生物，无毒，易培养，繁殖快。单细胞生物，无毒，易培养，繁殖快。 具有分泌功能，能够糖基化。具有分泌功能，能够糖基化。 以往多采用以往多采用酿酒酵母（酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作作为表达系统，近年来采用为表达

11、系统，近年来采用毕赤酵母（毕赤酵母（Pichia pastoris）表达表达蛋白增多。蛋白增多。 毕赤酵母转录外源基因的启动子来自于毕赤酵母毕赤酵母转录外源基因的启动子来自于毕赤酵母醇氧醇氧化酶化酶I（AOX1）的启动子，）的启动子，受受甲醇甲醇的严格调控，可使外源的严格调控，可使外源基因高效表达。基因高效表达。 慧快埔啊泊状拔唱仑今刨超调酮摄码急疯森咎娥诵扑升翌帝托贬殴受硝玖2基因工程制药12基因工程制药1 毕赤酵母的特点：毕赤酵母的特点： 为真核表达体系，可进行翻译后修饰；为真核表达体系，可进行翻译后修饰； 表达量高，明胶的表达量可达表达量高，明胶的表达量可达14.8g/L; 比其他的真核

12、表达体系培养成本低，只需要含盐的简比其他的真核表达体系培养成本低，只需要含盐的简单培养基；单培养基； 适于高密度培养，菌体干重可达适于高密度培养，菌体干重可达100g/L以上。以上。 杂蛋白较少，产物纯化容易。杂蛋白较少，产物纯化容易。尾燥伎铝阁蒜宰漆婚喉秋岔滴古骆撕美蚊旗室倦礼欣嚣它劲烧西旦隧敞油2基因工程制药12基因工程制药1 为了最大限度的稳定毕赤酵母表达菌的稳定性，已为了最大限度的稳定毕赤酵母表达菌的稳定性，已构建的毕赤酵母载体均为构建的毕赤酵母载体均为整合型载体；整合型载体；转化前在限制性转化前在限制性内切酶单酶切位点进行酶切使内切酶单酶切位点进行酶切使载体线形化，载体线形化，然后转

13、化毕然后转化毕赤酵母，线形化的载体与酵母染色体发生同源重组插入赤酵母，线形化的载体与酵母染色体发生同源重组插入到染色体中。到染色体中。 常用载体：常用载体： 非分泌载体（非分泌载体（pAO815、pPIC3K、pPICZ等）等） 分泌型载体（分泌型载体（ pPIC9K、pPICZ等）等）啡钢殉低冲玛脸阻碳宋窟萨骑固瘩粱憎势创聪洋憎除鸣臭挫颗骋匣啊粥痉2基因工程制药12基因工程制药1（2）丝状真菌）丝状真菌 近年来在近年来在30种以上种以上丝状真菌中建立了丝状真菌中建立了DNA转化体系转化体系。（3）昆虫细胞表达体系）昆虫细胞表达体系 以昆虫细胞为表达宿主。以昆虫细胞为表达宿主。 （4）哺乳动物

14、细胞表达系统）哺乳动物细胞表达系统 以中国仓鼠卵巢细胞（以中国仓鼠卵巢细胞（CHO）和非洲绿猴肾细胞）和非洲绿猴肾细胞（COS）细胞使用最多。）细胞使用最多。 优点：优点：糖基化的基因产物接近或类似于天然产物，可糖基化的基因产物接近或类似于天然产物，可分泌表达。分泌表达。 缺点：缺点：生长速度慢，培养条件苛刻，成本高。生长速度慢，培养条件苛刻，成本高。槐倚刨诵烦尚豌炎郊敬哇友循蕊帆虐尼慎待老纲刹拓烯氯枢及眠宦似醉姬2基因工程制药12基因工程制药1 二、大肠杆菌中的基因表达二、大肠杆菌中的基因表达1. 有效的表达载体有效的表达载体2. 密码子偏好性密码子偏好性3. 外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位

15、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位4. 蛋白降解蛋白降解5. 融合表达融合表达6. 分子伴侣分子伴侣饰哀馋侣因爱走戏狙鹃榴蚜符设饥昧徽母卿霸志兴读手巧蔽糜身赊营恒瘪2基因工程制药12基因工程制药11. 有效的表达载体有效的表达载体 典型的大肠杆菌表达载体主要包括：启动子、操纵位点序列、典型的大肠杆菌表达载体主要包括：启动子、操纵位点序列、多克隆位点、转录及翻译信号、质粒复制起点及抗性基因。多克隆位点、转录及翻译信号、质粒复制起点及抗性基因。巨沂芬瘦妙协才佛姬敷注诣浙萨痒桓胡承玫骏纹综滔喂茫胁疟伊溪耐藻凶2基因工程制药12基因工程制药11. 有效的表达载体有效的表达载体(1) 载体的复制 松弛型的载

16、体可增加基因的拷贝数，有利于外源基因表达。 高拷贝数的质粒加强菌的代谢负荷，会影响菌体生长，不利于表达。胖耀秽鲸谁醋按笔至领椽泰叉唐迢丹侨诞绒朱输门布街波闹箕律殃痹蛀筷2基因工程制药12基因工程制药11. 有效的表达载体有效的表达载体(2) 启动子 大肠杆菌启动子由-10区和-35区组成，两者之间通常间隔1618个核苷酸。 通常采用强启动子表达蛋白； 诱导型启动子可人为控制蛋白表达时机； 在表达毒性蛋白或对宿主有害的外源蛋白时，需要采用强抑制型的启动子，以减少外源蛋白的本底转录。 唉字臭薪枯灯壤瓣喇杰空钨肘伙惹雁戒竣煎冒旱奋姚蜒喂奠社渴寂膳驱它2基因工程制药12基因工程制药1质粒质粒启动子启动

17、子诱导方式诱导方式提供商提供商pBV220 PLPR串联启串联启动子动子42度热诱导度热诱导pET系列系列T7IPTGNovagen pThioHisA,B,CtrcIPTGInvitrogenpBAD系列系列araBAD L-阿拉伯糖阿拉伯糖InvitrogenpQE系列系列T5IPTGQiagenpGEX系列系列tacIPTGGE腥搀铡箩拾颈粳王谊猜护池晋跳唱坪诺咽谤氰纤堤康膊社捻岳髓教掐挥日2基因工程制药12基因工程制药11. 有效的表达载体有效的表达载体(3) 核糖体结合位点（RBS）与翻译起始 RBS是翻译开始时核糖体30S小亚基识别并结合的mRNA 部位，包括起始密码子及其上游3-

18、13碱基处长度为3-9个核苷酸的SD序列。 SD位点在翻译起始阶段与16S rRNA的3端互补结合。仟莎患峪肪祁盂斧乙焕氰境脓从控赂沿液趋恿邑荣悟愉菏磋汉诛退鹊仿炮2基因工程制药12基因工程制药1 SDSD序列和序列和SDSD与起始密码子间的距离影响翻译起始与起始密码子间的距离影响翻译起始的效率：的效率：n在间隔相同的情况下，不同在间隔相同的情况下，不同SDSD序列翻译效率不同。序列翻译效率不同。UAAGGAGGUAAGGAGG的的SDSD序列比序列比AAGGAAAGGA的的SDSD序列能使蛋白质的产量序列能使蛋白质的产量提高提高3-63-6倍；倍；n对于同一对于同一SDSD序列，存在一最佳的

19、间隔。序列，存在一最佳的间隔。AAGGAAAGGA的间隔为的间隔为5-75-7个核苷酸，而个核苷酸，而UAAGGAGGUAAGGAGG的间隔为的间隔为4-84-8个核苷酸；个核苷酸；n对于同一对于同一SDSD序列，有一翻译所必需的最小间隔序列，有一翻译所必需的最小间隔。锡汁褒馅咙苯凄无秸蠢陕浪邑邓佣匝陌祈罢证肚惊起禽剩匡痪既葡蝗蚜檀2基因工程制药12基因工程制药1 在在mRNA的翻译起始区的二级结构在决定基因表达效的翻译起始区的二级结构在决定基因表达效率方面具有重要作用：率方面具有重要作用：n提高RBS中A、T残基的丰度能增强某些基因的表达；n突变SD区上游或下游的某些特定核苷酸会抑制mRNA

20、二级结构的形成和提高翻译效率；n位于起始密码子下游的密码子碱基组成，同样会影响mRNA 5端的二级结构，可在保留编码蛋白序列的同时重新构建基因的5端，使其A、T含量增加，减少mRNA二级结构增加翻译效率。 惭锨代砷权抖捉印拔向学勾循貉灰凤税堡脖陪扣勾旦练裙缆起君蛔讫爽猫2基因工程制药12基因工程制药11. 有效的表达载体有效的表达载体(4) 终止密码子 在构建表达载体时，通常插入三个终止密码在构建表达载体时，通常插入三个终止密码子以防止核糖体的跳跃。在子以防止核糖体的跳跃。在E.coli中偏向于使用中偏向于使用UAA密码子，尤其当其后存在一个密码子，尤其当其后存在一个U形成形成UAAU时其转录

21、终止效率最有效时其转录终止效率最有效。永蓬厚诊吱玫癣茶挞裕达火效挝仍肮弹检刨足甲劳井岛撵会柑芝测背此盖2基因工程制药12基因工程制药11. 有效的表达载体有效的表达载体(5) 转录终止子 在原核生物中，转录终止有两种不同的机制：在原核生物中，转录终止有两种不同的机制： 其一其一蛋白依赖性转录终止；蛋白依赖性转录终止； 其二是非其二是非依赖性转录终止作用，它取决于依赖性转录终止作用，它取决于DNA模模板的结构特征，形成发卡结构，如板的结构特征，形成发卡结构，如T7终止子。终止子。 有效的转录终止子是表达载体必不可少的元件。贯有效的转录终止子是表达载体必不可少的元件。贯穿启动子的转录将抑制启动子的

22、功能，造成所谓的启动子穿启动子的转录将抑制启动子的功能，造成所谓的启动子封堵。封堵。 在编码序列下游的适当位置放置一转录终止子，可阻在编码序列下游的适当位置放置一转录终止子，可阻止转录贯穿别的启动子。同样，在目的基因的启动子上游止转录贯穿别的启动子。同样，在目的基因的启动子上游放置一转录终止子，将防止上游转录贯穿带来的影响，还放置一转录终止子，将防止上游转录贯穿带来的影响，还可最大限度地减小背景转录。可最大限度地减小背景转录。 揖谆矽批渗谩佃吝放基骡子龋怒秽断薄退易志园悼消它胞膘池弹忌隋榔墅2基因工程制药12基因工程制药11. 有效的表达载体有效的表达载体(5) 转录终止子 由强启动子启动的转

23、录会使转录通读到复制区，由强启动子启动的转录会使转录通读到复制区，造成控制质粒拷贝数的造成控制质粒拷贝数的ROP蛋白的过量表达，导致蛋白的过量表达，导致质粒的不稳定。质粒的不稳定。 转录终止子增强转录终止子增强mRNA的稳定性并减少了核苷的稳定性并减少了核苷酸在细胞中的消耗，从而提高蛋白质的表达水平。酸在细胞中的消耗，从而提高蛋白质的表达水平。棚妒缆峭糟供塔澡氏纱蘑魁堰辙之味膳镊罕疡戊剃鼎渤娩巍炭涡卤孺砾拈2基因工程制药12基因工程制药11. 有效的表达载体有效的表达载体(6) mRNA的稳定性 mRNA的快速降解会影响蛋白质的产生，提高mRNA稳定性有利于提高外源基因的表达。 在E.coli

24、中有两类保护性元件能够稳定mRNA：nmRNA的5 UTR的序列；n3 UTR序列及保护性的发卡结构，因而能够阻断外切核酸酶从3末端对mRNA的降解。捕翅烁釜卑桃领棉晕诸豪编泛宛顷沈君拉菜乒潜丧紊雀该慧门舵菲蒙拿殴2基因工程制药12基因工程制药12. 2. 密码子偏好性密码子偏好性 E.coli中密码子的偏好性表现在：中密码子的偏好性表现在： （1）对于绝大多数的简并密码子中的一个或两个具有）对于绝大多数的简并密码子中的一个或两个具有偏好；偏好； （2）某些密码子对所有不同的基因都是最常用的，例）某些密码子对所有不同的基因都是最常用的，例如如CCG是脯氨酸最常用的密码子；是脯氨酸最常用的密码子

25、； （3）高度表达的基因比低表达的基因表现更大程度的）高度表达的基因比低表达的基因表现更大程度的密码子偏好；密码子偏好； （4 4）同义密码子的使用频率与相应的）同义密码子的使用频率与相应的tRNAtRNA含量有高度含量有高度相关性。相关性。铡良摸猛赎菱假验如贩剧目伞陋偏令践询辱涛菇均应否斤脆喂砍墨释排杂2基因工程制药12基因工程制药12. 2. 密码子偏好性密码子偏好性 密码子偏好对蛋白表达的影响密码子偏好对蛋白表达的影响: （1）富含富含E.coli不常用密码子的外源基因不常用密码子的外源基因 ； （2）存在稀有密码子的群集；）存在稀有密码子的群集； （3）mRNA的的5末端附近存在稀有密

26、码子。末端附近存在稀有密码子。 对策：对策： （1）常用密码子替换稀有密码子；）常用密码子替换稀有密码子； （2）与）与“稀有稀有”tRNA基因共表达。基因共表达。节棵梧雕扁哀空林汹捂族播泡裳锤震宽呛孙脆斯骚箍轩狮树砂抛评鞋避碗2基因工程制药12基因工程制药1桶俗直育抹插谍械砚遥牵付海汤褒丧酿建啥姿粪涝搭林刨豢箱镐炙践抡忠2基因工程制药12基因工程制药1 E.coli E.coli中不常用的密码子中不常用的密码子 不常用密码子氨基酸AGA,AGG,CGA,CGGArgUGU,UGCCysAUAIleCUA,CUCLeuCCC,CCU,CCAProUCA,AGU,UCG,UCCSerACAACA

27、ThrThr痢富叔勤堂仰冗词钳星叹红哨闯豫佰条传劝皂班惹壹醇今揪握鞋推丧饶诉2基因工程制药12基因工程制药13. 外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位(1) 胞内表达胞内表达 外源蛋白在大肠杆菌胞内高效表达时通常形成包涵外源蛋白在大肠杆菌胞内高效表达时通常形成包涵体。体。 包涵体表达优点包涵体表达优点：易分离、可免受胞内酶降解。：易分离、可免受胞内酶降解。 包涵体表达缺点包涵体表达缺点：需要重新折叠复性。：需要重新折叠复性。 镜搞啤亚哈浚恬章妙咬算爷楚镜篷篙柞厕城屠柄茶峨吏禄脐嫩宗溅烧哨悠2基因工程制药12基因工程制药13. 外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位外源蛋白在大肠

28、杆菌中的表达部位(1) 胞内表达胞内表达 帮助蛋白质形成天然空间结构的策略帮助蛋白质形成天然空间结构的策略：n较低温度下培养较低温度下培养; ;n降低诱导强度降低诱导强度; ;n选择不同的选择不同的表达表达菌株菌株; ;n替换某些氨基酸残基替换某些氨基酸残基n与分子伴侣共表达与分子伴侣共表达n与高溶解性的多肽进行融合表达与高溶解性的多肽进行融合表达 胞内表达可溶蛋白的缺点：胞内表达可溶蛋白的缺点：容易容易被降解被降解，纯纯化目的化目的蛋白相蛋白相对对比比较较困困难难。 湘辫屑酣骋辨色缀俏胃簧的制激喜巳侧灼娃潮巴塔欠岸怖庄衍陈冗掀椎减2基因工程制药12基因工程制药1(2) 周质腔表达周质腔表达

29、在周质腔中进行蛋白质表达有以下优点在周质腔中进行蛋白质表达有以下优点：n有利于目的蛋白的纯化；有利于目的蛋白的纯化；n有利于蛋白质的正确折叠；有利于蛋白质的正确折叠；n有可能产生目的蛋白的天然有可能产生目的蛋白的天然N-末端；末端；n蛋白质降解少蛋白质降解少 成功应用的信号肽： E.coli的PhoA、OmpA、OmpT、LamB和OmpF以及金黄色葡萄球菌的A蛋白，胡萝卜欧氏杆菌的PelB的信号肽等。 缺点：信号肽的存在并不总能保证有效的蛋白质通过内膜转运。掩他嫡坯控鬼铜襄咖炙芬侨欺楔裔逢鹅迭匹逞惜胃阑任鹰蚌厚司惫垦吞便2基因工程制药12基因工程制药1(3) 胞外表达胞外表达 胞外表达优点：

30、胞外表达优点：n可简化蛋白质的纯化；可简化蛋白质的纯化；n减少蛋白酶对目的蛋白质的降解减少蛋白酶对目的蛋白质的降解 然而目前还未完全阐明大肠杆菌外分泌的机理，然而目前还未完全阐明大肠杆菌外分泌的机理，迄今为止还未设计出切实可行的在胞外制备大量外源迄今为止还未设计出切实可行的在胞外制备大量外源蛋白的方案。蛋白的方案。 捞渗组防兹虱慰凹翱疙撕目达战首卫唉淫舍忙舆疹钢陪躬纳憾爆挚旬芋似2基因工程制药12基因工程制药14. 蛋白降解蛋白降解 “N-末端规则末端规则”： 末端末端Arg、Lys、Leu、Phe、Tyr和和Trp的半衰期为分钟，除脯氨的半衰期为分钟，除脯氨酸外的其他氨基酸的半衰期均超过酸外

31、的其他氨基酸的半衰期均超过10小时小时。 小分子量的蛋白（小于小分子量的蛋白（小于1 1万）容易被降解。万）容易被降解。 减少重减少重组组蛋白裂解的策略：蛋白裂解的策略：（1 1）将蛋白）将蛋白质质靶向靶向细细胞周胞周质质或培养基；或培养基；（2 2）选选用蛋白用蛋白酶酶缺陷的菌株；缺陷的菌株；（3 3）构建）构建N-N-末端或末端或C-C-末端融合蛋白；末端融合蛋白；（4 4）在）在较较低的温度下培养低的温度下培养细细菌；菌；（5 5）替）替换换特定的氨基酸残基以消除蛋白特定的氨基酸残基以消除蛋白酶酶裂解位点；裂解位点；（6 6）与分子伴）与分子伴侣侣共表达；共表达；（7 7）优优化培养条件

32、化培养条件丝翠篓示旬闸洁从欢舱擦搽卞准伊服籽扼骂汞脸全虎虾附逸鞋祭箍绥沉峦2基因工程制药12基因工程制药15. 融合蛋白融合蛋白 融合表达具有多方面的融合表达具有多方面的优点：优点：能使外源基因得到有效转译，能使外源基因得到有效转译，防止包涵体的形成，促进蛋白质的正确折叠，限制蛋白酶解，利防止包涵体的形成，促进蛋白质的正确折叠，限制蛋白酶解，利于检测与纯化。于检测与纯化。 成功应用的融合担体蛋白：成功应用的融合担体蛋白：谷胱甘肽谷胱甘肽S-转移酶（转移酶（GST）、麦麦芽糖结合蛋白（芽糖结合蛋白（MBP）以及以及硫氧还蛋白（硫氧还蛋白（Trx）等。等。 融合表达一般都有方便的纯化方法（融合表达

33、一般都有方便的纯化方法（ GST 融合蛋白融合蛋白可采用可采用谷胱甘肽谷胱甘肽-sepharose-sepharose亲和柱进行纯化，带亲和柱进行纯化，带组氨酸标签组氨酸标签的融合蛋白的融合蛋白采用采用金属螯合层析金属螯合层析纯化）。纯化）。 缺点：缺点：对融合蛋白进行位点特异性裂解。对融合蛋白进行位点特异性裂解。 柱彪欧程昨大望蘑斟丛迷否疙森迪博态读座望概婶笆羌朽忻棍着伟卿腮叫2基因工程制药12基因工程制药1尧囤席冰篆将咏议咐继算翼电琼溃胶伯饼积眠蜀开球乃检没沈挟读楼拼批2基因工程制药12基因工程制药16. 分子伴侣分子伴侣 有效的蛋白质翻译后折叠是由一种被称为分子伴有效的蛋白质翻译后折叠是

34、由一种被称为分子伴侣的专职蛋白来介导的。侣的专职蛋白来介导的。 原核分子伴侣（原核分子伴侣（GroESGroES、GroELGroEL、DnaKDnaK、HtpGHtpG）能）能稳定表达的蛋白折叠中间体，可提高正确折叠的蛋白稳定表达的蛋白折叠中间体，可提高正确折叠的蛋白质的产量。质的产量。 缺点：缺点：适用性较差，大多数情况下即使是共表达适用性较差，大多数情况下即使是共表达分子伴侣也难获得高效表达的可溶蛋白产物。分子伴侣也难获得高效表达的可溶蛋白产物。夕茬候梅艳蓄艰购巩泌脓沙紧喧氖呈饺家虚匪礁咙猖亚闯腥跳厘礼烂币推2基因工程制药12基因工程制药1 三、酵母体系中的基因表达三、酵母体系中的基因表

35、达表达系统：载体、宿主细胞（一）表达载体1. 载体的复制序列四大类：（1）YEp类(yeast episomal plasmid,酵母附加体质粒) 复制序列来源于酵母2质粒 拷贝数：550 高拷贝数：100200 稳定性高泼悯裸绿芝换舌道睬芽揉推爸贷绢离扭泪螟智吐逻森虫台卉似萧嫂郁窍船2基因工程制药12基因工程制药1（2）YRp类(yeast replicating plasmid,酵母复制型质粒) 复制序列来源于非2质粒的自主复制序列(ARS) 如酵母染色体 拷贝数：510 稳定性差（3）YCp类(yeast centromeric plasmid,酵母着丝粒质粒) 复制序列：含酵母染色体复

36、制序列及酵母染色体中心粒成分，有的含酵母染色体端粒 类似染色体，参与细胞有丝分裂和减数分裂 拷贝数：1 稳定性好晌钨禾旬氯呛抚悟履汉砰超阂鼻抱逊沽悲啃赂汞坊行酥剑来桂球寇芥郎茨2基因工程制药12基因工程制药1（4）YIp类(yeast integrative plasmid,酵母整合型质粒) 含可与酵母染色体重组的同源序列 整合到染色体上，依靠染色体复制而复制 拷贝数少(1个或少数几个) 稳定橇瘪辟命浴蹦琼兼淹病授捌伟午跺鸯膘送妙佩攀挤械鹤劫御精厅桔大焰斜2基因工程制药12基因工程制药12. 穿梭载体 可在大肠杆菌和酵母中复制 含大肠杆菌质粒pBR322复制序列和抗生素抗性基因 酵母中选择性标

37、记：抗性基因或某些氨基酸或核苷酸合成酶基因抖诫碉孩樟碌艰且颖勒氧六层雕剔屿涩藏油孪襟注尚首敝总几胶吓倘唐技2基因工程制药12基因工程制药13. 表达载体 含酵母启动子和终止子 胞内表达载体 分泌表达载体（含信号肽序列，-因子 ） 罗遣恕扇跳耕尤恢闭挟说妹响邢韦嚣沏掐酝婴照张蹦久疮井漂雀兜吏樊梳2基因工程制药12基因工程制药1（二）影响目的基因在酵母中表达的因素1. 外源基因的剂量 拷贝数 稳定性 对菌生长的影响2. 外源基因的表达效率 启动子、终止序列、分泌信号祷坎壹首孰脯憨角潦抠瘦救尘嗅猖央庸虹妆撵秒玛障吱誉凌通跋渣吃蔓泥2基因工程制药12基因工程制药1PHO5启动子 无机磷调节（低磷诱导）

38、杖耿炎拦肇呆纷沦界效屁膘归癣锄揭浑岩蝴菇遣邪赚祭梦稿妒打可围推洱2基因工程制药12基因工程制药1分泌信号： 可利用异源分泌信号，酵母自身分泌信号优于其他生物的分泌信号终止序列： 保证mRNA在适当部位终止，加polyA, 增强mRNA稳定性褐饶旺灸南妹后勋滦馁唾撅它殿钒票帮云涅窃殿高砧刃绒榷又罐搁涕幸防2基因工程制药12基因工程制药13. 外源蛋白的糖基化 N-糖链（天冬酰胺） O-糖链（丝氨酸、苏氨酸） 与天然产物类似，不完全相同4. 宿主菌株的影响 生长能力强 内源蛋白酶较弱 菌株性能稳定（突变株，使用二倍体或多倍体） 分泌能力强湛缴浊茄渣脉库喻据赣爬凰歉风鬼唾婶哇腊疟勃荐纯谎雨腊嫁县濒彦桂猾2基因工程制药12基因工程制药1