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1、体外核酸诊断试剂盒引物探针研发的基本体外核酸诊断试剂盒引物探针研发的基本流程流程体外核酸诊断试剂盒研发引物和探针的设计检测病原体流行病学调查病原体代表株系的全基因组序列比较检测靶序列的确定基于靶序列设计引物和探针引物探针整体评分靶序列数据库内特异性验证（NCBI&clustal）Primer Premier 5评分（发夹，二聚体）Oligo6评价(基因组错配，二聚体验证)靶序列空间结构预测（DNA fold）引物探针是否合格引物探针是否特异Pick Primer评价种间交叉反应评价种内保守性评价引物探针序列的确定检测范围的确定在我国内地主要流行在我国内地主要流行A、B、C、D 4 种种HBV
2、基因型基因型, 所占比例所占比例分别为分别为1. 2 %、39. 3 %、50. 2 %、8. 1 % ,并且各地区流行的并且各地区流行的基因型也存在较大差异基因型也存在较大差异,北方地区以北方地区以C 型为主型为主,约占约占81. 6 %;南南方地区则以方地区则以B 型为主型为主,C 型也占相当比例型也占相当比例（冯琴,杨桂英,朱善军等.乙型肝炎病毒基因分型的研究进展J.医学检验与临床,2011,22(2):77,56.HBVHBV流行病学调查：确定需要检测的分型以及靶序列流行病学调查：确定需要检测的分型以及靶序列地区分型特点分子生物学特征Genes S, C, and P,region X
3、, the precore region, and the pre-S2/pre-Sl regions were ranked in order of increasing variability.（Lauder I J, Lin H J, Lau J Y, et al. The variability of the hepatitis B virus genome: statistical analysis and biological implicationsJ. Molecular biology and evolution, 1993, 10(2): 457-470.临床病理学B 基因
4、型的治疗反应、耐药发生率均优于基因型的治疗反应、耐药发生率均优于C 型型,HBV YMDD 突变株突变株( YIDD/ YVDD) 多发生于基因型多发生于基因型C和和D（谢南,朱小诚.90例 HBV基因型与拉米夫定疗效的研究J.实用临床医学,2003,4(4):5-8.）地区分型特点地区分型特点 文献资料的检索文献资料的检索分子生物学特征文献资料的检索分子生物学特征文献资料的检索临床病理学文献检索临床病理学文献检索病原体代表株系的全基因组序列比较病原体代表株系的全基因组序列比较HBVHBV（A,B,C,DA,B,C,D）分型代表株系的全基因组序列比较）分型代表株系的全基因组序列比较F FP P
5、R RPrimerPremier5评分（发夹，二聚体）Oligo6评价 上游引物vs下游引物 探针VS下游引物HBV基因组错配评价空间结构DNAfoldingform|mfold.rit.albany.eduhttp:/mfold.rna.albany.edu/?q=mfold/dna-folding-formHBV引物在种内中间（针对中国地区以及其他地区ABCD代表分型）特异性评价 FPRFPR FPRFPR NCBIPickprimer程序对引物2在种内交叉反应评价.HepatitisBvirusNCBIPickprimer程序对引物以及探针在种间特异性的评价HBV-E,F,G,HHBV-
6、E,F,G,H基因组检测特异性评价基因组检测特异性评价 FPR引物整体评价引物整体评价 优点：优点： 1 1序列上特异较高序列上特异较高 2 2探针引物总体评分较高探针引物总体评分较高 3 3在自身基因组中不存在错配，在临床类似病原体中不存在在自身基因组中不存在错配，在临床类似病原体中不存在 显著的交叉反应显著的交叉反应 缺点：缺点： 11探针自身二聚体较严重探针自身二聚体较严重 22对于对于C C型耐药突变株，重组型型耐药突变株，重组型HBVHBV样本的检测能力差样本的检测能力差 33不具有检测不具有检测HBVABCDHBVABCD外基因型（外基因型（F,G,HF,G,H）的潜力）的潜力 4PCR4PCR产物长度可能不适合（产物长度可能不适合（86bp86bp）
