药物安全性评价局部给药毒性试验

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1、药物安全性评价中局部给药毒性试验药物安全性评价中局部给药毒性试验被被”反应停反应停”夺去胳膊的孩子们夺去胳膊的孩子们 “反应停反应停”的两种手性结构分子的两种手性结构分子 “反应停反应停” 事件事件-50年代年代.德国德国“海豹畸形婴儿海豹畸形婴儿 ”“海豹畸形人海豹畸形人 ”龙胆泻肝丸事件龙胆泻肝丸事件 -90年代年代.中国中国马兜铃酸 肾病肾病肾衰肾衰毒尿症毒尿症案例案例 痤疮痤疮 是一种毛囊皮脂炎症，多发于青年男女面部、胸部等皮脂分泌旺盛的区域，持续时间长，且易反复发作。 克林霉素克林霉素-过氧苯甲酰凝胶过氧苯甲酰凝胶 是由克林霉素磷酸脂与过氧苯甲酰制成的复方制剂，临床用于痤疮治疗。要求

2、观察其对皮肤的刺激性与过敏反应。 药物安全性评价中局部给药毒性试验药物安全性评价中局部给药毒性试验 局部给药毒性试验概念： 是指局部用药后所引起的毒性反应。 最常用制剂 : 有皮肤用药制剂（涂剂、擦剂、膏药剂、透皮吸收制剂等）、滴眼剂、滴鼻剂和喷雾剂、肌内注射剂、直肠和阴道用药制剂等等。 第一节第一节 皮肤用药的毒性评价皮肤用药的毒性评价一. 皮肤组织结构 皮肤覆盖于整个体 表，由表皮、真皮和皮下组织组成。 二二.化学物质对皮肤毒性作用的类型化学物质对皮肤毒性作用的类型 根据性质不同，由药物引起的皮肤损害包括原发性刺激炎症反应和致敏反应，偶然也可引起皮肤癌。三、皮肤给药毒性评价包括三、皮肤给药

3、毒性评价包括: 1、急性毒性试验 2、长期毒性试验 3、皮肤刺激性试验 4、过敏试验 5、光敏试验等。（一）皮肤用药急性毒性实验 1. 定义： 指动物完整或破损皮肤一次性接触受试物后在短期内出现的毒性反应实验。 2.受试物： 使用临床制剂，如临床制剂浓度无法满足剂量要求，受试物为粉末状的用适宜基质（如凡士林、羊毛脂等）溶解混匀。 3.实验动物及实验条件实验动物及实验条件 每组动物数：每组动物数： 一般选白色家兔、小型猪4-6只，大鼠或豚鼠10只，雌雄各半； 动物体重：动物体重： 家兔2-3kg，豚鼠200-300g，大鼠200-250g，小型猪30- 40kg。 饮食、摄水：饮食、摄水： 自由

4、饮食、摄水。 动物房温湿度：动物房温湿度： 家兔、豚鼠及小型猪控制在18-26；大鼠控制在20-25，相对湿度均为40%-70%；换气次数为10-20次/min；12h明暗交替光照。 4.剂量设计剂量设计 至少应设三个剂量组，另设赋形剂对照组，必要时设空白对照组。 如受试物在拟用临床给药时有可能与破损皮肤接触，则应另设破损皮肤组。 5.实验操作实验操作 给药前24h对给药区（通常在背部）进行脱毛处理，给药时将受试物均匀涂于动物脱毛区，液体制剂，应将受试物涂于敷料上，再贴于脱毛或破损皮肤区，用半封闭的外罩固定敷料。 涂敷24h后，除去敷料，用温水或适宜的溶剂除去残留的受试物和赋形剂。 观察期：观

5、察期： 连续观察14d，观察1-2次/天。也可根据出现毒性反应的情况适当延长。观察指标：观察指标： 给药前后7d、14d称体重，观察给药后动物的全身反应：皮毛、眼睛、黏膜、呼吸、行为、自主活动、肌张力等，有无颤抖、震颤、抽搐、流涎、腹泻、少动、精神萎靡不振、昏迷等毒性反应症状。若有动物死亡应立即进行尸检，有明显异常时，应进一步进行病理组织学检查。6.观察指标观察指标7.结果评价结果评价 对观察到的阳性症状结合大体解剖或病理组织学结果进行综合分析，与对照组比较，对动物的毒性反应及死亡原因作出明确判断。 病理组病理组对照组对照组（二）皮肤给药长期毒性实验（二）皮肤给药长期毒性实验1.定义 指动物完

6、整或破损皮肤长期反复接触受试物后出现的毒性反应及其可逆程度实验。2.受试物 与“皮肤给药急性毒性试验”基本相同。3.实验动物及条件 与“皮肤给药急性毒性试验”一致。 4.剂量设计剂量设计 至少应设三个剂量组. (可设赋形剂对照组，必要时设空白对照组。) 高剂量：原则上应使动物产生明显的毒性反应，甚至出现个别动物死亡； 低剂量：原则上应高于动物药效学实验的等效剂量，并不使动物出现毒性反应； 中剂量：动物可出现轻度毒性反应。5.给药期限给药期限药物临床疗程药物临床疗程皮肤给药长期毒性实皮肤给药长期毒性实验给药期限验给药期限可以支持的临床研究阶段可以支持的临床研究阶段单次给药2周期，期（及生产）2周

7、1个月期，期（及生产）2周1个月1个月期3个月期（及生产）3个月3个月期6个月期（及生产）6个月6个月期，期（及生产）6个月6个月期，期（及生产） 6.给药频率给药频率 给药期限3个月，原则上应每天给药； 给药期限3个月，每周至少应给药6d； 也可根据临床给药频率给药。 7.恢复期限恢复期限 给药结束后保留部分动物，继续观察其可能出现的延迟性毒性反应，并了解毒性反应的可逆程度。 根据受试物的药代动力学特点、靶器官或靶组织的毒性反应和实际恢复情况确定恢复期的长短。 8.8.实验操作实验操作 首次给药前24h对给药区在背部进行脱毛处理。每天给药1次，每次至少接触6h。保证受试物与给药部位具有良好接

8、触并避免动物食入药物。可用纱布等无刺激性辅料包裹或给动物穿上特制的通透性好的外套。 9.观察指标观察指标 除增加给药部位皮肤及其周围组织乃至全身皮肤变化和皮肤病理学检查外，其余指标与长期毒性实验要求一样。 10.结果评价 全身毒性反应的结果评价与长毒实验要求一样，应根据各检测指标及病理组织学检查结果综合分析。除此以外还应注意评价给药局部及其周围组织的毒性反应。（三）皮肤刺激性实验（三）皮肤刺激性实验1.1.定义：定义： 皮肤刺激性：皮肤刺激性：指经皮肤给药后，在皮肤上产生的可逆性炎性病变。 （若给药部位产生了不可逆性的组织损伤则称为腐蚀性。若给药部位产生了不可逆性的组织损伤则称为腐蚀性。） 皮

9、肤刺激性实验：皮肤刺激性实验：是观察动物的皮肤接触受试物后是否引起红肿、充血、渗出等局部反应。 2.受试物 应采用与临床应用制剂一致，符合临床用质量标准规定的受试物进行实验，同时注明其名称、来源、批号、含量（或规格）、赋形剂、保存条件及配制方法等，其中赋形剂和杂质等的名称和量应尽可能明确，并附有研制单位的自检报告。所用赋形剂应该标明批号、规格和生产厂家，并符合实验要求。 3.实验动物 多种哺乳动物可以选择，一般首选白色家兔，每组动物数48只，雌、雄各半。也可以选用其他种属的动物 (如小型猪等) ,选择家兔和小型猪以外的动物应阐明合理性。 4.实验操作实验操作 设赋形剂对照，采用同体左右侧自身对

10、比法。 试验前24h对给药区进行脱毛处理。去毛范围各3cm3cm。(给药前应检查去毛皮肤是否因去毛而受损伤，有损伤的皮肤不宜进行实验。) 进行破损皮肤的刺激性研究时，在用药部位用砂纸磨或划“井”字并以渗血为度。 4.实验操作 受试物药量一般是固体或半固体0.5g，液体0.5ml，直接涂布于一侧已去毛的皮肤上，然后用两层纱布(2.5cm 2.5cm)和一层玻璃纸或类似物覆盖，再用无刺激性胶布和绷带加以固定； 另一侧涂布赋形剂做对照。贴敷时间至少4h。贴敷结束后，除去受试物并用温水或无刺激性溶剂清洁给药部位。 注：多次给药皮肤刺激性实验应连续在同一部位给药，每次给药时间相同，贴敷期限一般不超过4周

11、。 刺激反应 分值 刺激反应 分值红斑 无红斑 0 轻度红斑（勉强可见） 1 中度红斑（明显可见） 2 重度红斑 3 紫红色红斑到轻度焦痂形成 4水肿 无水肿 0 轻度水肿（勉强可见） 1 中度水肿（明显隆起） 2 重度水肿（皮肤隆起1mm，轮廓清楚） 3 严重水肿（皮肤隆起1mm以上并有扩大）4 总分值 85.观察指标观察指标 在自然光线或全光谱灯光下观察皮肤反应。按表给出的评分标准对皮肤红斑和水肿进行评分。 6.结果评价结果评价 单次给药实验： 计算每一观察时间点各组受试物及赋形剂皮肤反应积分的平均分值，按表进行刺激强度评价。 多次给药实验： 首先计算每一观察时间点各组积分均值，然后计算观

12、察期限内每天每只动物积分均值，按表进行刺激强度评价。 分 值 评 价 分 值 评 价00.49 无刺激性0.52.99 轻度刺激性3.05.99 中度刺激性6.08.0 强刺激性（四）皮肤过敏性实验（四）皮肤过敏性实验 1、概念： 皮肤过敏性试验：是观察动物皮肤初始接触受试物后，再进行受试物激发接触，观察是否产生全身或局部过敏反应。2、过敏性常用试验方法BuehlerBuehler试验：试验： 在第0，6-8和13-15天有封闭片局部给药诱导，在第27-28天未给药肋腹部贴6h局部激发。除去封闭片24和48h读取结果。GMPTGMPT试验：试验： 皮内注射进行诱导，5-8天后再次诱导，第20-

13、22天给激发剂量24h，去除激发剂量24和48h读取结果。（1）光过敏性实验（光变态反应）（2）光毒性实验（光刺激性）3、皮肤光过敏性实验、皮肤光过敏性实验第二节 腔道给药的毒性实验一、腔道给药的急性毒性实验一、腔道给药的急性毒性实验1.定义定义 指通过动物腔道（包括眼、耳、鼻腔、直肠、阴道）一次性接触受试物后在短期内出现的毒性反应实验。 2.受试物受试物 应使用临床制剂，如临床制剂浓度无法满足毒性实验的剂量要求，应根据临床制剂的制备标准制备高浓度制剂用于本研究。如为滴鼻剂或吸人剂，则受试物多为液体或粉剂；如为直肠、阴道用药，受试物多为栓剂、液体或膏剂，若受试物为粉末状，则应用适宜的基质 （如

14、凡士林、羊毛脂等）溶解混匀。 3.实验动物及实验条件实验动物及实验条件 滴剂或吸入剂急毒实验一般选择大鼠或豚鼠、家兔；需直肠、阴道用药时应选择大鼠或家兔。其中大鼠应选择SPF级动物。如选择其他动物应充分说明其理由。每组动物：家兔46只，大鼠或豚鼠10只，雌雄各半。动物体重：家兔23kg，大鼠、豚鼠250300g。4.实验步骤：实验步骤：（1）剂量设计）剂量设计（2）实验操作）实验操作（3）观察指标）观察指标（4）结果评价）结果评价 对经直肠、阴道给药的受试物，应根据其药效作用特点及临床用药方案，选用家兔、大鼠或beagle犬进行长期毒性实验，给药途径应尽量模拟临床给药途径，每次药后保留时间尽量

15、与临床一致，确保药物与给药局部的接触时间。给药剂量、给药期限、恢复期限及观察指标可参考长期毒性常规要求。应特别注意观察给药局部及可能累及的周围组织的反应和病理改变。 二、二、腔道给药的长期毒性实验腔道给药的长期毒性实验 第三节第三节 刺激性实验刺激性实验1.定义定义 刺激性：刺激性：是指非口服给药制剂给药后对给药部位产生的可逆性炎症反应，若给药部位产生了不可逆性的组织损伤则称为腐蚀性。 刺激性实验：刺激性实验：是观察动物的血管、肌肉、皮肤、黏膜等部位接触受试物后是否引起红肿、充血、渗出、变性或坏死等局部反应。 分类：分类：眼刺激性实验、血管刺激实验、肌肉刺激实验、直肠刺激实验、阴道刺激实验、滴

16、鼻剂和吸入剂刺激性实验 、口腔用药和滴耳剂刺激性实验等。2.眼刺激性毒性实验案例例：氯霉素滴眼液 氯霉素是一种广谱抗生素，是目前眼用制剂中用量最多的抗生素。其水溶液稳定性较差，典型反应为水解反应，还会发生氧化还原反应。将氯霉素滴眼液高温加速破坏，用HLPC法检测到降解产物主要为二醇物；强光照射，其降解产物主要为对硝基苯甲醛。因此，要考查其降解产物对眼的刺激作用。1.1.实验动物的选择实验动物的选择 依据拟采用的实验模型和观察指标选择实验动物，一般每个实验选择一种动物进行评价。2.2.给药的频率与期限给药的频率与期限 给药的频率与期限应依据拟定临床应用的情况来决定。重复给药的制剂，一般每天给药一

17、次，给药期限最长不超过4周。单次给药的制剂可用单次给药的方法进行实验。3.3.可逆性观察可逆性观察 为明确毒性反应的性质，建议进行停药后恢复期的观察。局部毒性反应的可逆性评价应包括局部及相关部位的反应。小结：注意问题小结：注意问题4.受试物 受试物应与临床应用制剂一致。5.对照组 以溶媒和是（或）赋形剂作阴性对照，必要时用已上市制剂作对照。6.剂量 剂量设计主要应该考虑受试物浓度和总剂量。一般采用与临床制剂相同浓度，设一个剂量组，可以通过改变给药频率进行剂量的调整，必要时应该进行不同浓度的刺激性实验。对于皮肤刺激性实验，在给药面积不变的情况下，不应通过增加厚度来满足增加给药量的目的。注意问题7.给药方案 给药方案原则上应与临床用药方案一致，但设计给药容积、速率和频率时，应考虑所选用动物模型给药部位的解剖和生理特点。可在同一动物身上进行不同给药途径的刺激性实验，并可在对侧进行对照实验。条件是耐受性许可和无相互影响。8.统计处理 根据实验模型和实验方法选择合适的统计方法。注意问题思考题思考题1、局部给药毒性试验，最常用的制剂有哪些？、局部给药毒性试验，最常用的制剂有哪些？2、皮肤给药毒性评价包括哪些内容？、皮肤给药毒性评价包括哪些内容？3、局部给药安全评价应注意哪些问题？、局部给药安全评价应注意哪些问题？Thank you ！