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1、第一节食品中菌落总数的测定第一节食品中菌落总数的测定一、一、菌落总数菌落总数 是指食品检样经过处理，在一定条是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后件下培养后,所得所得1mL(g)1mL(g)或或1cm1cm2 2面积检面积检样中所含菌落的总数。样中所含菌落的总数。 二、菌落总数测定的意义二、菌落总数测定的意义1 1、判定食品被细菌污染的程度及卫生质量、判定食品被细菌污染的程度及卫生质量。2 2、预测食品存用的期限长短。、预测食品存用的期限长短。3 3、了解细菌在食品中的繁殖动态。、了解细菌在食品中的繁殖动态。三、菌落总数测定的方法三、菌落总数测定的方法 平板倾注法平板倾注法平板表面涂布法平板
2、表面涂布法平板表面点滴法平板表面点滴法四、平板倾注法测定菌落总数四、平板倾注法测定菌落总数检验步骤检验步骤(程序程序)： 检样检样稀释处理稀释处理做平板做平板培养培养菌落菌落计数计数报告结果报告结果（一）、样品稀释及做平板（一）、样品稀释及做平板1ml1ml1ml1ml1:101:10001:1001:100001ml1ml1ml加入加入46营养琼脂营养琼脂1215ml25g/ml样品生理盐水 检样从开始稀释到倾注最后一个平皿检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过所用时间不宜超过20min，以防止细菌有，以防止细菌有所死亡或繁殖。所死亡或繁殖。 （二）培养（二）培养普通食品普通食品:
3、37 48h 倒放平板倒放平板清凉饮料、调味品、糕点、酒类：清凉饮料、调味品、糕点、酒类： 37 24h 水产品水产品: : 30 48h（三）计数和报告（三）计数和报告 到达规定培养时间，应立即计到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板数。如果不能立即计数，应将平板放置于放置于0 044，但不得超过，但不得超过24h24h。1、菌落的选择（1 1）、单个菌做一个菌落计）、单个菌做一个菌落计（2 2）、呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，作）、呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按
4、一个菌落计算。条链均应按一个菌落计算。（3 3）、如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布）、如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘均匀，则可以半个平板的菌落数乘2 2代表全平板的代表全平板的菌落数。菌落数。2、平板菌落计数的选择 （1 1）、选取菌落数在）、选取菌落数在30300之间的平板之间的平板（SN标准要求为标准要求为25250个菌落）个菌落），若有二若有二个稀释度均在个稀释度均在30300之间时，比值小于或之间时，比值小于或等于等于2取平均数，比值大于取平均数，比值大于2则其较小数字。则其较小数字。（2 2）、如均大于）、如均大于300300，则取最高稀释
5、度的平均菌落数，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告乘以稀释倍数报告（3 3）、如均小于）、如均小于3030，则以最低稀释度的平均菌落数乘，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告稀释倍数报告（4 4）、如菌落数有的大于）、如菌落数有的大于300300，有的又小于，有的又小于3030，不在，不在3030300300之间，以最接近之间，以最接近300300或或3030的平均菌落数乘以的平均菌落数乘以稀释倍数报告稀释倍数报告（5 5）、如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于）、如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1 1乘乘以最低稀释倍数报告。以最低稀释倍数报告。 3、菌落数的报告菌落数在菌落数
6、在1100时，按实有数字报告，时，按实有数字报告，1)1)如大于如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。位数按四舍五入计算。2)2)固体检样以克（固体检样以克（g)为单位报告，为单位报告，3)3)液体检样以毫升（液体检样以毫升（ml）为单位报告，）为单位报告，4)4)表面涂擦则以平方厘米（表面涂擦则以平方厘米（cm2）报告。）报告。 (四四)、检验注意事项、检验注意事项1、对照平板出现几个菌落时，要追加对照平板；、对照平板出现几个菌落时，要追加对照平板；2、吸管进出瓶子或试管时，吸管口不得触及瓶口、吸管进出瓶子或试管时，吸管口不得触及瓶口
7、、管口的外围部分；管口的外围部分；3、吸管插入试样液内的深度不得小于、吸管插入试样液内的深度不得小于2.5cm,调整调整时要使管尖与容器内壁紧贴时要使管尖与容器内壁紧贴;4、进行稀释时、进行稀释时,吸管口不得与稀释液接触吸管口不得与稀释液接触;5 5、检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时、检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过间不宜超过20min.6 6、稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌、稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，不可作为检样落数愈多。如出现逆反现象，不可作为检样计数报告的依据。计数报告的依据。复习题1、什么是菌落总数菌落总数？2、测定食
8、品、饮料等产品的菌落总菌落总数有什么意义？3、画出平板倾注法测定菌落总数的示意图。平板倾注法测定菌落总数的示意图。4、在测定菌落总数时，如何、在测定菌落总数时，如何选择菌落进行计数？5、在菌落总数菌落总数的检验中，要注意哪些事项？6、在菌落总数菌落总数的检验中，如何根据样品的特性选择培养温度和时间？第二节第二节 食品中大肠菌群的检验食品中大肠菌群的检验一、大肠菌群一、大肠菌群 1、 什么是大肠菌群？什么是大肠菌群？指一群需氧及兼性厌氧，在指一群需氧及兼性厌氧，在37能分解乳糖产酸、能分解乳糖产酸、产气的革兰氏染色阴性无芽胞杆菌。产气的革兰氏染色阴性无芽胞杆菌。2 2、大肠菌群的组成、大肠菌群的
9、组成: :大肠埃希氏菌发属、柠檬酸杆菌属、产气克雷伯氏大肠埃希氏菌发属、柠檬酸杆菌属、产气克雷伯氏菌属和阴沟肠杆菌。菌属和阴沟肠杆菌。属代表种致病性埃希氏菌属 （Escherichia） 大肠埃希氏菌 (E.coli) 肠道外感染， 急性腹泻 志贺氏菌属 （Shigella） 痢疾志贺氏菌 (Sh.dysenteriae) 细菌性痢疾爱德华氏菌属 （Edwardsiella） 迟纯爱德华氏菌 (E.tarda) 蛇类等血动物的正常肠道寄居菌，偶见于健康人或腹泻者粪便内沙门氏菌属 （Salmonella） 伤寒沙门氏菌 (S.typhi) 肠热症、急性肠炎、败血症枸橼酸杆菌属 (Citrobac
10、ter) 弗劳地氏枸橼酸杆菌 (C.freundii) 条件致病菌，引起继发性感染克雷伯氏菌属 (Klebsiella) 肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae) 肺炎，泌尿系、创伤感染 败血症等 阴沟肠杆菌(Enterobacter) 产气杆菌 (E.aerogenes) 很少引起原发性感染哈夫尼亚菌属 (Hafnia) 蜂窝啥夫尼亚菌 (H.alvei) 对人无致病性沙雷氏菌属 (Serrati) 粘质沙雷氏菌 (S.marcescens) 条件致病菌，引起泌尿系， 呼吸道及创伤感染 变形杆菌属 (Proteus) 普通变形杆菌 (P.vulgaris) 食物中毒，泌尿系、呼吸道感染 等
11、耶尔森氏菌属 (Yersinia) 鼠疫耶尔森氏菌 (Y.pestis) 鼠疫欧文氏菌属 (Erwinia) 草原居民欧文氏菌 (E.herbicola) 植物寄生菌，曾从人体肠道及化脓扁桃体中分离到1 1、粪便污染的指标菌：、粪便污染的指标菌：大肠菌群或大肠杆菌大肠菌群或大肠杆菌二、二、大肠菌群的测定意义大肠菌群的测定意义2、以大肠菌群作为粪便指标菌原因、以大肠菌群作为粪便指标菌原因1)在粪便中数量最大；在粪便中数量最大；2)在外环境中存活的时间与致病菌大体相在外环境中存活的时间与致病菌大体相同；同；3)检测方法简便容易。检测方法简便容易。3、大肠菌群的测定意义大肠菌群的测定意义（1）、判断
12、食品中否受到）、判断食品中否受到粪便污染。粪便污染。（2）、）、有利于控制肠道传染病的发生和流行。有利于控制肠道传染病的发生和流行。（3）、）、有利于控制食品在生产加工、运输、有利于控制食品在生产加工、运输、保存等过程中的卫生状况。保存等过程中的卫生状况。三、三、大肠菌群的生物学特性大肠菌群的生物学特性1.1.形态与染色：革兰氏染色阴性，无芽胞杆菌。形态与染色：革兰氏染色阴性，无芽胞杆菌。2.发酵乳糖产酸产气发酵乳糖产酸产气 3.培养特性：在琼脂上的典型菌落培养特性：在琼脂上的典型菌落:呈深紫黑色呈深紫黑色或中心深紫色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光或中心深紫色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光
13、滑，常有金属光泽；滑，常有金属光泽；在麦康凯琼脂上的典型菌落在麦康凯琼脂上的典型菌落:呈桃红色或中心桃红、呈桃红色或中心桃红、圆形，扁平，光滑湿润。圆形，扁平，光滑湿润。EMB平板照片及原理平板照片及原理麦康凯琼脂平板麦康凯琼脂平板Ageofcultureis24h大肠杆菌、大肠菌群选择性显色培养基大肠杆菌、大肠菌群选择性显色培养基-COLI ID用于在37下对食品中大肠菌群和大肠杆菌进行检测、计数及大肠杆菌的鉴定本培养基含有两种显色物质，可以直接识别大肠菌群（coliforms）和鉴定大肠杆菌（Escherichiacoli）,而不需附加任何试剂。菌落颜色玫瑰红蓝色透明.-葡萄糖苷酶+-.-
14、半乳糖苷酶+-.大肠杆菌其它大肠菌群其它革兰氏阴性菌.-半乳糖苷酶（+）大肠菌群存在-半乳糖苷酶（+）大肠菌群存在-葡萄糖苷酶（+）大肠杆菌存在-葡萄糖苷酶（-）无大肠菌群存在大肠杆菌平板菌落照片大肠杆菌平板菌落照片肠杆菌扫描电镜照片肠杆菌扫描电镜照片.四、四、大肠菌群大肠菌群检验方法及操作方法检验方法及操作方法国家标准：国家标准：三步法：乳糖胆盐发酵试验三步法：乳糖胆盐发酵试验分离培养分离培养证实试验证实试验( (乳糖发酵试验乳糖发酵试验) ) 行业标准：行业标准：两步法：推测试验两步法：推测试验证实试验证实试验检样稀释处理EMB等革兰氏染色乳糖发酵管革兰氏阴性无芽胞产气革兰氏阳性大肠杆菌阴
15、性大肠杆菌阴性报告不产气乳糖胆盐发酵管产气不产气大肠杆菌阴性报告报告报告大肠杆菌阳性1:1001:10各加入1ml各加入10ml各加入1ml单料乳糖胆盐发酵管单料乳糖胆盐发酵管双料乳糖胆盐发酵管初发酵检样稀释检样量1g/ml检样量0.1g/ml检样量0.01g/mlEMB分离培养证实试验乳糖发酵管镜检查MPN表报告结果表表1 1 粪大肠菌群在几种常用分离培养上的菌落特征粪大肠菌群在几种常用分离培养上的菌落特征培养基菌落特征伊红兰培养基(EMB)紫黑色、有金属光泽，紫黑色、不带或略带光泽，淡紫红色、中心紫黑色、黑红或深紫红色品红亚硫酸纳(远藤氏平板)紫红色、有金属光泽，深红色、不带或略带金属光泽
16、，淡红色、中心较深中国兰平板深蓝色，浅蓝色、中心深蓝色麦康凯平板(Mac C)桃红色，粉红色、中心桃红色MPN法简介法简介The Most Probable Number Method1g/ml检样中最近似值检样中最近似值(MPN)表表以1、0.1、0.01、各用3管。阳性管数MPN个个/100 g/ml1g/ml30.1g/ml30.01g/ml300030001300026000390010300116001290013120020600219002212002315003090031130032160033190五、粪大肠菌群的检验五、粪大肠菌群的检验粪大肠菌群粪大肠菌群：系一群需氧及兼
17、性厌氧，在系一群需氧及兼性厌氧，在44.5培养培养24h内能发酵乳糖产酸产气和分内能发酵乳糖产酸产气和分解色氨酸产生靛基质的革兰氏阴性无芽胞解色氨酸产生靛基质的革兰氏阴性无芽胞杆菌。杆菌。检验方法检验方法检样检样产酸产气查查MPN表表报告报告EMB 分离分离靛质基试验靛质基试验阳性反应方法一：方法一：45 EC肉汤发酵肉汤发酵稀释稀释44乳糖乳糖胆盐发酵胆盐发酵方法二：方法二：检样检样稀释稀释36乳糖乳糖胆盐发酵胆盐发酵产酸产气产酸产气EMB 分离分离查查MPN表表报告报告1、从制备样品匀液至稀释完毕、从制备样品匀液至稀释完毕,全过程不得超过全过程不得超过15min。2 2、对产酸但未看到气泡
18、的乳糖发酵，用手轻打动试、对产酸但未看到气泡的乳糖发酵，用手轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，应考虑可能有气体产管，如有气泡沿管壁上浮，应考虑可能有气体产生，应作进一步试验。生，应作进一步试验。 3 3、挑选菌落进行证实试验时，最少要挑、挑选菌落进行证实试验时，最少要挑2 2个以上的典个以上的典型菌落或非典型菌落进行接种。型菌落或非典型菌落进行接种。4 4、不可用其他胆盐代替指定的胆盐。、不可用其他胆盐代替指定的胆盐。六、检验注意事项六、检验注意事项EMB平板照片及原理平板照片及原理靛基质试验原理及照片靛基质试验原理及照片七、七、大肠菌群快速检验大肠菌群快速检验食品大肠菌群快速检验方法：大肠菌群
19、快速检验方法：TTC显色法；显色法；DC试管法；试管法；纸片法。纸片法。（一）食品饮料大肠菌群快速检验纸片（一）食品饮料大肠菌群快速检验纸片使用方法：1.1.样品稀释同国标法样品稀释同国标法2.2.接种：接种： 饮料和饮用水采用原液、饮料和饮用水采用原液、1:101:10、 1:1001:100三个稀三个稀释度，固体食品采用释度，固体食品采用1:1 1:1 、1:101:10和和1:1001:100三个稀三个稀释度。用释度。用1 1亳升灭菌吸管吸取亳升灭菌吸管吸取1 1亳升同一稀释度亳升同一稀释度的稀释液均匀涂布到袋中的纸片上，做三个重的稀释液均匀涂布到袋中的纸片上，做三个重复。复。3.3.培
20、养：培养：将接种好的纸片轻轻压平（可叠放），在将接种好的纸片轻轻压平（可叠放），在3636下下培养培养151524h24h观察结果。观察结果。4.4.结果判定结果判定: :1)1)纸片上出现紫红色斑点纸片上出现紫红色斑点, ,其周围有黄圈者其周围有黄圈者, ,为阳性为阳性. .2)2)纸片为一种着色纸片为一种着色, ,无菌落生长者为阴性无菌落生长者为阴性. .3)3)纸片呈紫兰色纸片呈紫兰色, ,有紫红色斑点，其周围地黄圈者有紫红色斑点，其周围地黄圈者阴性阴性. .4)4)酸性食品接种后酸性食品接种后, ,纸片变黄纸片变黄, ,经培养后无紫红色斑经培养后无紫红色斑点为阴性点为阴性（二）餐具大肠
21、菌群快速检验（二）餐具大肠菌群快速检验(纸片法纸片法)使使 用用 方方 法法 ：1.1. 采样采样6 61010份。份。碗、盘、杯等每份贴纸片两张碗、盘、杯等每份贴纸片两张，用无菌生理盐水湿用无菌生理盐水湿润纸片后，立即贴于食具内侧表面，润纸片后，立即贴于食具内侧表面，3030秒后取下，秒后取下，置于原塑料袋内。筷子以置于原塑料袋内。筷子以5 5只为一份样品，用吸管只为一份样品，用吸管吸取生理盐水湿润纸片后，立即将筷子进口端（约吸取生理盐水湿润纸片后，立即将筷子进口端（约5cm5cm）抹拭两张，放入原塑料袋内）抹拭两张，放入原塑料袋内。2.2.将已采样的纸样置于将已采样的纸样置于37C37C培
22、养培养1515小时小时. .纸片在黄色背景上出现红色斑点为阳性，纸片在紫纸片在黄色背景上出现红色斑点为阳性，纸片在紫兰色背景上呈现红色斑点，但周围没有黄晕均为兰色背景上呈现红色斑点，但周围没有黄晕均为大肠菌群阴性。同一份样品两张纸片均是阴性为大肠菌群阴性。同一份样品两张纸片均是阴性为合格。合格。食品冷饮大肠菌群检验纸片冷饮、乳制品和调味品等大肠菌群的测定食品食品饮饮料大料大肠肠菌群快速菌群快速检验纸检验纸片片饮饮料、食用料、食用纯纯水和糕点的大水和糕点的大肠肠菌群菌群测测定定餐具大肠菌快速检验纸片餐具卫生消毒效果检测大肠菌群测试片适用于需要对大肠菌群准确计数的样品，如消毒牛乳、冷饮和调味品等。
23、 八、水的大肠菌群检验八、水的大肠菌群检验大肠菌群大肠菌群MPN/100mL细菌总数细菌总数 CFU/mL 生活饮用水生活饮用水 3 /L100 瓶装饮用纯净水瓶装饮用纯净水 3 20 饮用天然矿泉水罐装产品饮用天然矿泉水罐装产品 050地面水质量标准地面水质量标准 10000个个/L 准备加氯消毒后供饮用的水准备加氯消毒后供饮用的水 1000准备加氯消毒后供饮用的水准备加氯消毒后供饮用的水 10000游泳池水游泳池水 1001000（一）、水样的采集（一）、水样的采集 1 1、自来水（未含氯）：龙头火烧灭菌，畅流、自来水（未含氯）：龙头火烧灭菌，畅流510510后取样。后取样。2 2、地地面
24、面水水源源水水：江江湖湖河河，水水库库，水水池池等等。浸浸入入水水下下20cm20cm下下取取样。水井样。水井50cm50cm下取样。下取样。3 3、漂漂白白粉粉处处理理的的水水样样：自自来来水水，游游泳泳池池水水，应应在在瓶瓶内内加加入入0.03g0.03g硫硫代代硫硫酸酸钠钠/500ml/500ml，或或2ml 2ml 1.5%1.5%硫硫代代硫硫酸酸钠钠液液/500ml/500ml，除氯。，除氯。4 4、运送：、运送：2 2小时内送到检验室。小时内送到检验室。610610，6h,6h,立即检验立即检验. .5 5、检验前：将水样振摇、检验前：将水样振摇510510分钟。分钟。（二）、生活
25、饮用水或食品生产（二）、生活饮用水或食品生产用水的检验（用水的检验（大大肠肠菌群菌群 ） 各加10ml各加100ml水样初发酵三料乳糖胆盐50毫升装三料乳糖胆盐5毫升装EMB分离36培养24h复发酵乳糖发酵镜检36培养24h大大肠肠菌群菌群检索表（饮用水）检索表（饮用水） 100ml阳性管数10ml阳性管数012每L水中大大肠肠菌群菌群数数03411138182713273111838414245251830706223692727431208315116193660230104069230（三）、瓶装矿泉水的检验（大大肠肠菌群菌群 ） 原水样双料乳糖胆盐发酵管10毫升装37培养24h产酸产气
26、者亮绿乳糖胆盐发酵管37培养48h产酸产气者查表报告各加入10ml水样矿泉水的检验检索表阳性管数MPN/100mL0012.225.139.24165 16(四四)、水源水的检验、水源水的检验 接种量接种量严重污染水：严重污染水：1、0.1、 0.01、 0. 001ml各各1份份 总量：总量：1.111ml中度污染水：中度污染水：10、 1、0.1、 0.01ml各各1份份 总量：总量：11.11ml轻度污染水：轻度污染水：100、 10、 1、0.1ml各各1份份 总量：总量：111.1ml原水样接种量接种量100ml用用三料乳糖胆盐三料乳糖胆盐接种量接种量10ml用双用双料乳糖胆盐料乳糖胆盐接种量接种量1ml用单用单料乳糖胆盐料乳糖胆盐EMB分离乳糖发酵复发酵36培养24h36培养24h查表报告查表报告镜检复习题1、什么是大肠菌群？大肠菌群由哪些微生物组成？2、测定食品、饮料等产品的大肠菌群数有什么意义？3、大肠菌群具有哪些生物学特性？4、在大肠菌群数的检验中，要注意哪些事项？5、在水的大肠菌群数检验中，如何进行水样的采集 ？
