药物体内代谢产物的研究方法

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1、药物体内代谢产物的研究方法药物体内代谢产物的研究方法周婷药物体内代谢产物的研究方法药物体内代谢产物的研究方法药物代谢的基本概念药物代谢转化的研究方法 生物样品的前处理 药物及其代谢物的分析和鉴定技术小结药物代谢(drug metabolism)药物的代谢又称药物的生物转化(biotransformation)，是指药物经过体内吸收、分布之后，在药酶的作用下经历化学结构变化的过程。多数药物经过代谢转化,失去活性或降低了活性。但是,也有的药物经代谢转化提高了活性,生成药理活性更强或者毒性更大的代谢物。 普鲁卡因 氯丙嗪硝酸异山梨酯5-单硝酸异山梨酯药物代谢过程 I相代谢反应 (phase I re

2、actions) 氧化、还原和水解 相代谢反应 (phasereactions) 与葡萄糖醛酸、 硫酸、氨基酸的结合反应 (conjugation)药物生物转化的过程药物代谢转化的研究方法 In vivo 体内代谢法是在给药动物服药后经过一定时间收集动物的尿样、血样或胆汁，分离检测样品中药物及其代谢物。该法最早在50年代已被采用，迄今仍然广泛应用。实验时应注意动物和人在代谢方面异同点。In vitro 由于药物在生物体内分布极广，其代谢转化的脏器和酶系统多样化，使药物及其代谢产物在体内的浓度较低，尤其是一些毒副作用较大的药物如抗癌药等，服用剂量有限，代谢物的浓度更低，直接从血浆、胆汁等生物体液

3、中分离检测代谢物进行体内代谢转化研究具有一定的困难。于是利用体外代谢法研究代谢转化尤其在确定代谢物的结构受到普遍重视。药物的体内代谢研究法体内生物转化方法是通过人或动物直接服用药物，然后收集尿样、胆汁、血样、粪便等进行代谢产物分析。药物的主要代谢部位是肝脏，药物在肝脏被代谢后，代谢产物的一部分通过胆汁排入肠道，另一部分进入血液向身体其他部位分布，最终代谢物从粪便、尿液中排出。口服吸收的药物的另一代谢部位是肠道，药物经肠内菌及其酶代谢后代谢产物，一部分通过“肝肠循环”吸收入血液，分布至其他部位，最终代谢产物从尿液、粪便中排出体外。 生物样品的预处理技术(pretreatment of biolo

4、gical matrices) 脱蛋白(deproteinization)液-液萃取(liquid-liquid extraction,LLE)固相萃取 (solid phase extraction，SPE) 脱蛋白 (deproteinization)表1 常用蛋白沉淀剂(protein precipitation ) 蛋白沉淀剂类型 常用蛋白沉淀剂 水溶性有机溶剂 乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃等 中性盐 饱和硫酸氨、硫酸钠、镁盐、磷酸盐、枸橼酸盐等 强酸 10%三氯醋酸、6%高氯酸、硫酸-钨酸混合液、5%偏磷酸等 锌盐和铜盐沉淀剂 硫酸铜-钨酸钠混合液、硫酸锌-氢氧化钠混合液等

5、 微孔滤膜法 仅用于测定样品中的游离代谢产物，与蛋白结合的代谢物不能被滤过液-液萃取法 (liquid-liquid extraction,LLE)原理 多数药物是亲酯性的，而血样或尿样中含有的大多数内源性杂质是强极性的水溶性物质。因而用有机溶剂提取可以除去大部分杂质。 挥去溶剂法生物样品加入提取溶剂混匀离心吸出上层溶剂挥去溶剂(通入氮气流吹干)例子钟皎等3以甲巯咪唑为内标，用乙醚提取Na2C03碱化后的大鼠尿液，测定了其中的盐酸雷诺嗪及其代谢物。 LLE的缺点但是液-液萃取法可能产生的乳化现象会引起药物的损失。通常在提取前加入适量的固体氯化钠，可减轻乳化程度。 离子对萃取法 (ion-pai

6、rextraction method)许多药物的代谢产物在一定的pH条件下以离子状态存在。因此，可以控制样品溶液的pH，并向其中加入反离子以形成离子对，再用有机溶剂提取。 ion-pairextraction methodQ+aq + X-aq QX被测药物 反离子 离子对 碱性药物:烷基磺酸类 RSO3H 酸性药物: 烷基季氨R4H+X-固相萃取 (solid phase extraction，SPE) SPE的基本原理是基于样品在固相和液相之间的分配差异。有两种洗脱模式:1.一种是药物比杂质与固相之间的亲和力更强，因而被保留，然后用一种对药物亲和力更强的溶剂洗脱；2.另一种是杂质较药物与固

7、相之间亲和力更强，则药物被直接洗脱。 通常使用的为前一种模式 Principle of solid-phase extraction 固相萃取柱现代SPE方法采用长约23cm的聚丙烯小柱，内装各种填料。SPE的填料种类繁多，可分为:1.亲脂型（大孔吸附树脂、亲脂性键合相硅胶）2.亲水型（硅胶、硅藻土、棉纤维）3.离子交换型实验步骤如下 第一步，使用甲醇润湿小柱，活化填料，以使固相表面易于和被分析物发生分子间相互作用，同时，可以除去填料中可能存在的杂质。C18柱在甲醇含量大于8的水溶液中才能保持湿润而有利于药物的吸附，否则，将导致回收率的降低；第二步，用水或适当的缓冲液冲洗小柱，转移过多的甲醇，

8、以便样本与固相表面发生作用。但清洗不宜过分，否则会使甲醇含量过低，从而导致湿润度不足，回收率降低；第三步，加样，使样本经过小柱，弃去废液；第四步，用水或适当的缓冲液冲洗小柱，转移样本中的内源性杂质和其他相关杂质；第五步，选择适当的洗脱溶剂洗脱被分析物，收集洗脱液，挥干溶剂以备后用，或直接进行在线分析。Solid-phase extraction procedure 冰冻干燥法一些水溶性大、不易以液-液萃取法提取的药物代谢产物，也可用冰冻干燥法来处理样品，即先将样品冰冻干燥，再用甲醇等极性溶剂将代谢产物从干燥的残渣中提取出来 分析和鉴定技术高效液相色谱法 气相色谱法 高效毛细管电泳 核磁共振技术

9、 质谱技术 色谱-光谱联用技术 高效液相色谱法 NP-HPLC(包括吸附色谱及键合相色谱)及RP-HPLC均可用于I相代谢产物及甲基化和乙酰化代谢产物的分离分析。RP-HPLC(包括离子对色谱及离子抑制色谱)适合于分离分析极性较大的、水溶性的结合型相代谢产物。如果要制备供结构鉴定用代谢产物纯品，应采用制备型HPLC。制备用HPLC技术 要制备供结构鉴定用代谢产物纯品，应采用制备型HPLC。 气相色谱法 由于代谢产物极性比较大，因此在进行GC分析前一般需要进行衍生化，以改善色谱行为，增加稳定性，提高定量测定的准确度。代谢产物结构中常见的活性基团有羟基、羧基及氨基，三甲基硅烷化(TMS)可适用于多

10、数中性及碱性代谢产物的衍生化。对于同时含有羟基及羧基的酸性代谢产物往往可以先甲酯化(ME)，再硅烷化，这样可使所有的羧基全部转化为甲酯，而所有的羟基均被TMS衍生化。上述反应是快速且定量地进行的。甲酯化最方便的试剂是重氮甲烷，该试剂可使羧基变成甲酯，但不与羟基发生反应。高效毛细管电泳高效毛细管电泳 80年代末发展起来的高效毛细管电泳，近年来在药物代谢研究中得到广泛应用，如Tomlinson等69应用电喷雾接口的CE-MS研究麻醉剂氟哌啶醇在肝微粒体中的代谢，分离鉴定了6种代谢物，并阐明其代谢特征。Kobayashi等70应用胶束毛细管电泳分离分析游离型和结合型甾体的代谢物。Li等71应用毛细管

11、电泳结合改进的环糊精手性试剂研究Oxprenolol对映异构体代谢，确定其代谢立体选择性。毛细管电泳因柱效高，每米塔板数可达100万，结合手性试剂能够有效分离手性化合物，有望成为研究手性药物代谢立体选择性及药代动力学强有力的工具。核磁共振技术核磁共振技术 NMR技术可以直接提供代谢物分子结构信息，样品用量少，一维谱的测定仅需5min，是一种快速、简便的方法。2D-COSY，2D-NOE谱的应用为分子结构提供了更多信息，使分子结构鉴定工作更为容易10。人及大鼠尿液的1HNMR谱中0.41.7的区域是内源性物质信号相对简单的区域，可用于观察代谢物的CH3、CH2、CH信号。另外，6.08.5的芳香

12、氢区域质子信号也可以方便地用于研究代谢产物的分子结构。质谱技术质谱技术 质谱技术由于其检测灵敏度高，分析的分子质量范围宽，提供分子结构信息量多等特点，已成为研究药物代谢产物的重要手段。药物在体内发生代谢转化后，一般仅在母体药物的基础上进行部分结构修饰，药物母体结构一般不会有太大变化，因此代谢物与母体药物常有相似的质谱特征离子，据此可对代谢物进行识别，并结合其他碎片特征，对其结构作出合理推断，但需将代谢物的电子轰击(EI)MS谱与合成品MS谱相对照，化学结构最终还要借助核磁共振图谱来确定。亦可用多级质谱分析技术(MSn)直接获得母体分子和代谢物分子结构信息，此时毋需制备纯代谢产物，生物样品只需经

13、过简单的预处理。色谱色谱-光谱联用技术光谱联用技术 LC/DAD联用 GC/MS联用 HPLC/MS联用 HPLC/NMR联用 HPLC/NMR/MS联用 LC/DAD联用反相HPLC结合二极管阵列检测器(DAD)，即LC/ DAD联用可在生物样品众多的色谱峰中搜寻可能的代谢产物峰。该分析技术的出发点主要有两个：(l)药物的代谢转化多数是对母体药物的结构加以修饰，并未改变母体药物的结构骨架，因此多数代谢物的结构类型一般与母体药物一样或相似，故其紫外光谱特性也与母体药物一样或相似。(2)在一般情况下，药物代谢转化成代谢物后，极性增大，所以在反相HPLC色谱图中，代谢物峰一般出现在原型药物峰之前。

14、LC/ DAD联用技术仅用于HPLC色谱图中代谢物峰的初步搜寻与判断，起到“眼睛”的作用。有关代谢产物的结构还需通过进一步的试验确证。彭莹等11用梯度洗脱(RP) HPLC/DAD法初步鉴别了异靛甲的10个代谢产物。GC/MS联用GC法对样品的极性和热稳定性有一定的要求，而代谢产物一般具有一定的极性基团，故其熔点高、挥发性差，因此需要进行衍生化后用GC/MS分析。对于相代谢产物，由于其与葡萄糖醛酸、硫酸、谷胱甘肽、半胱氨酸等结合后不易完全衍生化或制成衍生物后结构太大仍不易气化，故其一般需先经水解后，再进行衍生化才能用GC/MS分析。如沙美特罗在小鼠尿中的4个代谢产物是通过尿样经葡萄糖醛酸苷酶酶

15、解，再用N-甲基-三甲基硅烷基三氟乙酰胺(MSTFA)衍生化后，用GC/MS分析得以鉴定12。HPLC/MS联用HPLC/MS联用技术集HPLC的高分离能力与MS的高灵敏度、极强的定性专属性于一体，并且有如下特点13：获得复杂混合物中单一成分的质谱图，大大有利于药物、药物代谢物和内源性化合物的分离与鉴定；可分别定量测定生物体液中药物及其代谢物。与GC/ MS联用技术相比较，HPLC/ MS的样品前处理简单，一般不要求水解或者衍生化处理，可以直接用于药物及其相、相等极性较大的代谢物的同时分离和鉴定。由于DAD为非破坏性检测器，故通常在HPLC与MS之间插入DAD检测器形成HPLC/DAD/ MS

16、，这样HPLC色谱图中各峰先由DAD采集紫外光谱图，检测代谢产物及其纯度，再由MS采集质谱图，即色谱图中各峰经过DAD及MS的双重鉴别，因此提高了代谢产物峰辩识的准确性。丁黎等采用LC/DAD/MSD技术，从大鼠服药胆汁中鉴定了6种盐酸非洛普I相代谢产物14 ；在研究相代谢产物时，以 HPLC法制备 II相代谢产物馏分并以-葡糖醛酸酶水解 ,再进行分析，最后得出3种盐酸非洛普相代谢产物15。LC/MS联用的关键是接口技术16。大气压电离(API)接口是目前应用最广泛的接口技术，它包括三种操作模式:大气压化学电离(APCI)，电喷雾(ESP)和离子喷雾(ISP)。ESP和ISP主要用以分析碱性或

17、酸性化合物，加入适当溶剂以正离子或负离子形式检测，而对中性化合物，可加入醋酸钠(或钾)等进行阳离子化，或加入乙睛等进行电荷交换，或采用APCI。 API为软离子化技术，缺乏碎片离子的结构信息，但可以通过串联质谱(MS/MS)技术获得更多的结构信息。LC/ MS/ MS在定性定量方面都显示出无与伦比的优越性，其特点为高分辨、低噪音、分析时间短，可以直接分析多组分混合物。目前以发展不同质量分析器和飞行时间(time of flight，TOF)质谱的联用为主，包括四极杆-TOF(Q-TOF)、TOF-TOF等。TOF采用了离子延迟引出和离子反射镜等技术，使得其分辨率大幅度提高，因此Q-TOF、TO

18、F-TOF等串联质谱可以在很高的质量范围内实现精确质量测定，可广泛用于药物代谢产物的结构研究。Donggeng Wang等17用负离子模式及碰撞诱导解离的电喷雾离子化的HPLC/MS/MS法，鉴定了大鼠尿液中resveratrol的4个主要代谢产物。 HPLC/NMR联用NMR谱可测出的信息量大,而且NMR谱中的化学位移、峰面积、偶合常数、驰豫时间均是解析化合物结构的依据，这使得NMR测定法在目前的药物代谢物研究工作中倍受关注18。HPLC/NMR方法与常规代谢物分离纯品进行鉴定相比除省时间外，对于不稳定化合物则更为有用，有些代谢产物在冗长的分离过程中可能会分解，而HPLC/NMR不仅可避免这

19、一问题，而且可以提供高质量的图谱。LC/NMR联用技术在研究药物代谢产物，特别是相代谢产物方面表现出了非常诱人的前景，有关研究报告相继发表19, 20。 HPLC/ NMR联机主要有3种模式：连续流动模式(Continuous-flow)，即用毛细管将LC的检测器出口直接连到NMR液槽，样品经检测器连续不断进入NMR流动液槽，按溶剂峰的共振频率对溶剂峰进行抑制，同时获得NMR谱图，这样得到的是假2D等高线图，即一个坐标是NMR的化学位移，另一坐标则为液相色谱保留时间；停止流动模式(stop-flow)，该模式只是在流动停止时才进行NMR测定，即当色谱峰的最高点到达NMR检测液槽的中心位置时停止

20、流动，进行1D和2D NMR采样，直到取得良好的NMR谱图为止，然后泵又启动，恢复原有条件，继续进行下一峰的NMR测定，最后得到各个色谱峰的NMR谱图；峰存储模式(peak-parking)，将LC检测器流出的峰存储于毛细管回路中，进行离线的NMR测定，这种方式并不中断色谱过程，回路体积则按所用探头的流动液槽体积、峰强度等进行调节。最早的报道是Spraul等21将服用了布洛芬的受试者的尿液冷冻干燥后，分别使用HPLC/NMR的连续流动和驻流模式进行分析，并在驻流操作时做了二维谱，得到了代谢产物的明确结构。后来又有人用同样的方法做了动物尿样中布洛芬相代谢产物的分析22。Wilson等23使用驻流

21、模式进行了安替比林的药物代谢研究，除了冷冻干燥外未对样品做任何其它预处理，整个过程迅速简便，并得到了药物代谢主产物的明确结构。HPLC/NMR/MS联用虽然核磁共振谱是化合物结构鉴定的有效方法，然而用它确定新化合物的结构时，常常需要其他方法进一步证实。如当代谢物基团中不含有质子或者质子极易与溶剂进行质子交换，使得NMR信号变宽而不能被检测时，NMR谱就很难提供代谢物的结构信息。对于那些杂原子，如氧、氮、卤素等原子，NMR图谱中也不能显示。MS谱可提供化合物的分子量、碎片峰也包含大量的结构信息。因此，最新的技术是把色谱仪、核磁共振仪和质谱仪三种仪器联合使用，形成HPLC/NMR/MS系统进行药物

22、代谢的研究24。这实际上是两种检测手段(NMR和MS)的相互补充。从该系统的色谱流出液中可直接得到UV、NMR和MS信息，为解析复杂的药物代谢产物的结构提供了全面的信息。如Sunil Bajada等25用HPLC/NMR/MS鉴定了一种新的苯哌丙烷在大鼠尿液中的代谢物，并阐明了它的代谢机制。小结 生物样品的预处理是色谱分折中必不可少的步骤，预处理时应考虑到下列问题：1.被测组分的理化性质;2.样品的化学组成;3.药物的蛋白结合率;4.基质干扰的类型;5.样品组分处理过程中的稳定性。小结不断发展成熟的色谱-光谱联用技术使色谱分离与光谱鉴定成为一个连续的过程，它集色谱的高分离效能与光谱的强鉴定能力于一体，分析快速且方便，具有其它药物代谢物结构分析方法所不能比拟的优点。相信随着新技术和新仪器的问世，药物体内代谢产物的研究一定会取得突飞猛进的发展。