液相色谱技术及应用

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1、高效液相色谱技术及应用高效液相色谱技术及应用液相色谱高级培训班液相色谱高级培训班林子俺林子俺博士博士福州大学化学化工学院福州大学化学化工学院食品安全分析与检测教育部重点实验室食品安全分析与检测教育部重点实验室福建省食品安全分析与检测技术重点实验室福建省食品安全分析与检测技术重点实验室2011-9-15目前已发表目前已发表SCISCI论文二十余篇，代表性论文：论文二十余篇，代表性论文：(1)Anal.Chem,2006,78,5322-5328(IF=5.9);(2)J.Chromatogr.A,2007,1170,118-121.(IF=4.2)(3)J.Chromatogr.A,2009,1

2、216,8612-8622.(IF=4.2);(4)J.Mater.Chem.,2011,21,518-524.(IF=5.1)(5)J.Chromatogr.A,2010,1217,4507-4510.(IF=4.2);(6)Chem.Commun.,2011,47,9675-9677.(IF=5.8);林林子子俺俺，1977年年出出生生，博博士士，副副教教授授，硕硕导导，师师从从色色谱谱专专家家张张玉玉奎奎院院士士，药药物物分分析硕士学位点负责人。析硕士学位点负责人。研究方向：研究方向：（1）新新型型色色谱谱整整体体材材料料/磁磁性性纳纳米米材材料料/生生物物大大分分子子印印迹迹材材料料的

3、的制制备备及及其其在在蛋蛋白白组组学学中的应用研究中的应用研究;（2）面面向向蛋蛋白白质质组组学学的的液液相相色色谱谱/毛毛细细管管电泳电泳/电色谱联用技术研究；电色谱联用技术研究；长长 期期 担担 任任Journal of Chromatography A, Analyst, Talanta, Journal of Separation Science, Recent Patents on Nanotechnology,Separation Science & Technology, Current Pharmaceutical Analysis,环环境境化化学学等等国国内内外外知知名名刊刊

4、物物评评审审人人。目目前前，已已在在国国际际权权威威刊刊物物上上发发表表SCI论文论文20多篇，申请国家发明多篇，申请国家发明2项。项。主持科研项目：主持科研项目：1.1.国家自然科学基金国家自然科学基金2.2.教育部博士点（新教师类）基金教育部博士点（新教师类）基金3.3.中国博士后基金中国博士后基金4.4.福建省自然科学基金福建省自然科学基金5.5.福建省教育厅基金福建省教育厅基金6.6.校科技发展基金校科技发展基金内容简介内容简介1 1 液相色谱基本概念液相色谱基本概念色谱发展概况色谱分离原理色谱基本理论2 2 液相色谱仪器系统及应用液相色谱仪器系统及应用输液系统进样系统分离系统检测系统

5、数据输出系统3 3 液相色谱方法开发和优化液相色谱方法开发和优化色谱方法的选择色谱条件的优化案例分析4 4 液相色谱常见问题及其解决方法液相色谱常见问题及其解决方法化学因素机械因素 色谱起源色谱起源M. S. Tswett 1906年，俄国植物学家年，俄国植物学家M.S.Tswett命命名这种应用吸附原理分离物质的新方法名这种应用吸附原理分离物质的新方法为为色谱色谱(Chromatography)；60年代末，高效液相色谱（年代末，高效液相色谱（HPLC）崛起；崛起；21世纪，超高压色谱、多维色谱等出现，世纪，超高压色谱、多维色谱等出现，使得色谱技术进入了飞速发展阶段；使得色谱技术进入了飞速发

6、展阶段；1952年，年，James和和Matrin发明了气发明了气相色谱法；相色谱法；p 色谱法色谱法：利用组分在两相间分：利用组分在两相间分配系数不同而进行分离的技术；配系数不同而进行分离的技术；p 流动相流动相：携带样品流过整个系：携带样品流过整个系统地流体；统地流体；p 固定相固定相：静止不动的一相，即：静止不动的一相，即色谱柱；色谱柱；液相色谱分离原理液相色谱分离原理色谱法的分离原理：溶于流动相色谱法的分离原理：溶于流动相(mobilephase)中的中的各组分经过固定相时，由于与固定相各组分经过固定相时，由于与固定相(stationaryphase)发生作用（发生作用（吸附、分配、离

7、子交换、排阻、亲吸附、分配、离子交换、排阻、亲和）和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。吸附：物质在两相界面上浓集的现象吸附：物质在两相界面上浓集的现象色谱分类色谱分类 分配色谱：是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离分配色谱：是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。过程是一个分配平衡过程。 吸附色谱：分离过程是一个吸附解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或吸附色谱：分离过程是一个吸附解吸附的平

8、衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝。氧化铝。 定义不同定义不同色谱分类色谱分类色谱研究方向色谱研究方向高效液相色谱高效液相色谱HighPerformanceLiquidChromatography(HPLC)气相色谱Gas Chromatography (GC)薄层色谱Thin-Layer Chromatography (TLC) 凝胶电泳Gel Electrophoresis(GE)毛细管电泳Capillary Electrophoresis(CE)毛细管电色谱lCapillary Electrochromatography(CEC)t0tRDetector ResponseTimeABWW

9、ABInjectt0tR(A)tR(B)影响因素：柱效、选择性、容量因子影响因素：柱效、选择性、容量因子容量因子容量因子A：涡流扩散：涡流扩散;B：分子扩散：分子扩散;C：传质阻力：传质阻力;分离选择性分离选择性t 0 = 1 =kkBAAB23AB12AB12=2.642.58=1.02=2.151.85=1.16=1.951.63=1.20kkBA改变流动相的组成改变不同流动相改变流动相pH值改变柱温应用特殊的化学效应改变固定相Greater Than 1.2()Need Not BetW=R =1/4Nx- 1xk1 + k容量因子选择性柱效不同分离度比较不同分离度比较Poor effi

10、ciencyModerate selectivityPoor efficiencyGood selectivityExcellent efficiencyPoor selectivityExcellent efficiencyModerate selectivityR = 1R = 1.5R = 0.5R = 4 （1 1）分配系数分配系数 kkk（2 2）容量因子）容量因子“k k”： 或： “k”是是比比“tR”还还常常用用的的保保留留值值，它它与与柱子的大小及流速无关，只只与与溶溶质质在在固固定定相相和和流流动动相相的的分分配配性性质质、柱柱温温以以及及相相空空间间比比（即即固固定定相相

11、和和流流动动相相之之体体积积比比）有有关关。“k”又又定定义义为为在在分分配配平平衡衡时时某某溶溶质质在在两两相相中中绝绝对对量量之之比比，消消除除了了保保留留值值的的波波动动因因素素，而而分分配配系系数数“K”是是平平衡衡时时物物质质在在两两相相中中的浓度比。的浓度比。k值的范围：值的范围：0.4k2030；k25为佳，过大则耗时太长。为佳，过大则耗时太长。思考：为什么要优思考：为什么要优化流动相比例？化流动相比例？KAKB 或或kAkB 是色谱是色谱分离的前提分离的前提!柱效柱效Detector ResponseInjectTime高柱效低柱效柱效率（热力学）：柱效率（热力学）：定义： 理

12、论塔板数 ( 每米柱效 ) ：标准偏差，曲线拐点处峰宽的一半，即峰高0.607处峰宽的一半。为便于测量，改用半峰宽半峰宽： W1/2( 或2t1/2 ) 最常用的计算式： 另一计算式：（Wb不如W1/2容易测量，因而此式用的较少。)21/2 h1/2hW1/2HL范氏方程范氏方程(动力学动力学)： 1 1、柱内展宽、柱内展宽： H=A+B/+C (A(A：涡流扩散：涡流扩散 B B：纵向扩散：纵向扩散 C C：传质阻抗：传质阻抗) ) 气相GC中B=2rDm中Dm比HPLC中大105倍 在HPLC中第二项可忽略，故高效液相色谱的范氏方程为：H = A + H = A + CC2.6 m2.6

13、mw1/2tRSub-2 m particles初始带宽最终带宽AA = 涡流扩散多径扩散涡流扩散多径扩散仔细填充柱子仔细填充柱子使用粒径均一的载体使用粒径均一的载体线 速 度HETP扩散扩散w1/2tR3 m and 5 m particlesDispersion due to eddy diffusion or multi-path effect扩散扩散BB = 自由分子扩散纵向扩散自由分子扩散纵向扩散在液相中影响小在液相中影响小在低流速中影响大在低流速中影响大线速度HETPw1/2tRw1/2tRVery low linear velocityAt or above optimum li

14、near velocityZero linear velocity扩散扩散滞流的流动相流动相固定相C.uC = C = 传质阻力传质阻力在低流速下可以降低传质阻力在低流速下可以降低传质阻力使用小颗粒载体可以降低传质阻力使用小颗粒载体可以降低传质阻力HETP线速度w1/2w1/2w1/25 m3 mSub-2 m扩散h = A + C uBu.HETP BuC.uA线速度线速度A = 涡流扩散多径扩散B = 自由分子扩散C = 传质阻力The Van Deemter Equation+ 总原则：总原则： 固定相填料要均一，颗粒细，装填均匀。固定相填料要均一，颗粒细，装填均匀。 流动相粘度低。流动

15、相粘度低。 低流速。低流速。 HPLC分离模式 近年来新的HPLC法应运而生 我们仅讲其中部分内容： HPLC 高效液相 LSC 液固LLC液液IEC离子交换SEC空间排阻AC亲和色谱CE毛细管电泳BPC化学键合相NPBC正RBPC反PIC离子对ISC离子抑制液相色谱仪器系统及应用液相色谱仪器系统及应用HPLCHPLC硬件基础知识硬件基础知识 日常应用注意事项日常应用注意事项 液相系统维护流程图吸滤头吸滤头单向阀单向阀柱塞密封圈柱塞密封圈线路过滤器线路过滤器手动进样器手动进样器检测器检测器色谱柱色谱柱5 5大系统：大系统：（1 1）输液系统；）输液系统； （4 4）检测系统；）检测系统；（2

16、2）进样系统；）进样系统； （5 5）数据处理系统；）数据处理系统；（3 3）分离系统；）分离系统；接头不锈钢接头 / 垫圈 主要用于输液泵、进样器的连接能承受 400 kgf/cm2压力一旦固定，垫圈不可再动PEEK接头 主要用于色谱柱、检测器的连接易于安装能承受 250 kgf/cm2压力容易产生死体积不锈钢接头垫圈PEEK接头输液系统死体积死体积可能会引起分离度变差和重现性变差等问题.管线公螺母死体积死体积好的连接差的连接选择原则采用 “HPLC” 级溶剂避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂对试样有适宜的溶解度溶剂粘度要小与检测器相匹配流动相溶剂的等级溶剂的等级HPLC级级优级纯优

17、级纯分析纯分析纯都都经过蒸馏和经过蒸馏和0.45u的过滤的过滤(除纤维毛除纤维毛,未溶解的机械颗粒）未溶解的机械颗粒）优级纯的纯度比分析纯大优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂但里面含有防腐剂和抗氧化剂HPLC级经过级经过0.2u的过滤的过滤,且除去有紫外吸收的杂质且除去有紫外吸收的杂质微量分析、梯度洗脱微量分析、梯度洗脱微量分析、梯度洗脱微量分析、梯度洗脱流动相 有机溶剂的等级分析纯级和 HPLC 级溶剂的吸光度比较图分析纯分析纯色谱纯色谱纯水的等级水的等级纯化水纯化水蒸馏水蒸馏水去离子水去离子水波长波长 (nm)(nm)纯化水纯化水去离子水去离子水因为不纯物的存在，去离子的吸

18、光率较高因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高纯化水中去除了无机和有机的污染物纯化水中去除了无机和有机的污染物吸吸吸吸光光光光率率率率流动相水的等级 未注入样品时空白梯度的色谱图水中的不纯物保留在柱中，随之被乙腈洗脱.选择缓冲液的步骤选择缓冲液的步骤 1 .1 .确定最佳分离状态时的流动相确定最佳分离状态时的流动相pHpH 2 .2 .选择具有与流动相的选择具有与流动相的pHpH相近的相近的pKapKa 的缓冲液（即的缓冲液（即使浓度稀也具有较强能力的缓冲液）使浓度稀也具有较强能力的缓冲液） 3 3 . .确认检测波长下缓冲液是否有大的吸收确认检测波长下缓冲液是否有大的吸收 （在波长（在波长21

19、0nm210nm附近进行检测时，不能用醋酸和附近进行检测时，不能用醋酸和 柠檬酸的缓冲液）柠檬酸的缓冲液）流动相缓冲盐 pK1pK2pK3醋酸4.87柠檬酸3.134.766.40磷酸2.167.2112.32常用代表性的弱酸的pKa值缓冲液的使用 使用前必须过滤 使用后一定要进行清洗 ，以免造成腐蚀、磨损、阻塞: 用含5%甲醇的水溶液冲洗30min（1ml/min），再用甲醇 冲洗30min 用纯水冲洗泵头清洗管路 易受到细菌和霉菌的影响不能直接用有机溶剂冲洗缓冲盐溶液缓冲液流动相的更换不互溶的流动相不能直接更换缓冲盐不能直接用有机溶剂更换水正己烷异丙醇缓冲盐有机溶剂水过滤：过滤：0.45u

20、m或更小孔径滤膜或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液时。滤膜类型：滤膜类型： 聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐。 醋酸纤维滤膜： 不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶剂。 尼龙66滤膜： 适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可以用于强酸， 不适用于二甲基甲酰胺。 再生纤维素滤膜：蛋白吸收低，同样适用于水溶性样品和有机溶剂溶剂前处理吸滤头材料：不锈钢(或陶瓷)烧结，孔径10um故障：堵塞表现：管路中不断有气泡生成措施：用异丙醇（或5稀硝酸），超声波清洗，再用蒸馏水清洗溶剂前处理-脱气 脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 气泡对测定的影响

21、： 1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积 2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形 3）检测器中的气泡产生基线波动 溶剂前处理-脱气常用脱气方法超声脱气 减压脱气 在线脱气岛津液相输液泵柱塞泵的基本结构LC-10ATvp LC-20AT串联式柱塞往复泵 LC-10ADvp LC-20AD 并联式微体积柱塞往复泵 LC-20AT LC-20AD LC-20AB 柱塞往复泵结构示意图 Gold SealSapphireInsertRuby BallSpringInsert单向阀工作原理 单向阀结构请不要分解阀心A和阀心B重新组装后性能不被保证，输液可能不稳定注意：单向阀清洗故障：宝石球或球座受污导

22、致密封不好表现：系统压力波动大措施：打开排液阀，以异丙醇为流动相输液拆下单向阀，放入异丙醇中，超声波清洗注意：超声清洗时开口端向上放置。注意：超声清洗时开口端向上放置。故障：宝石球粘附于垫片表现：泵无法吸液或排液，流路不通措施：1）用针筒抽出口单向阀以产生负压，使宝石球 与垫片分开 2）拆下单向阀，放入异丙醇或水中，用超声波清洗单向阀清洗等度洗脱梯度洗脱 高压/低压梯度系统梯度洗脱装置： u高压（外）梯度：用两台高压输液泵将两种溶剂输入 u低压（内）梯度：在常压下将两种溶剂（或多元溶剂）混合，然后用高压输液泵将流动相输入到色谱柱中。 使用梯度洗脱的原因 使用梯度洗脱的原因样品前处理 1. 使用

23、流动相溶解样品 减少溶剂峰，尤其是组分峰靠近溶剂峰时尤为重要 保证样品在流动相中的溶解度，避免样品在系统中 尤其在柱中产生沉淀 2. 进样前最好使用0.45um 的滤膜进行过滤 如果样品很脏，要使用0.22um的滤膜进行过滤 3. 对于含有复杂基质的样品，最好前处理后再进样。 进样器 l自动进样器 l手动进样器 原理：（六通阀） 注入方式： 1）全量注入 2）部分注入 7725i手动进样阀手动进样器的原理图 7725/7725i手动进样器结构图定子密封部件号：228-32211-31转子密封(Vespel)部件号：670-12098-51(Tefzel)部件号：670-12098-56转子密封

24、适用范围手动进样器的进样体积 部分注入和全量注入 部分注入：一般要求进样量最多为定量环体积的一半，如20l的定量环最多进样10l的样品，并且要求每次进样体积准确、相同全量注入：进样量最少为定量环体积的3至5倍，即20l的定量环最少进样60至100l的样品，这样才能完全置换样品定量环内残留的溶液，达到所要求的精密度及重现性。交叉污染的原因 红色表示残留样品 进样口清洗（1）将附件进样口清洗器连接在针管上， 不应使用微型注射器清洗。（2）清洗液（试样溶剂或不含盐的流动相 等）用注射器吸入（3）在进样状态下，将针孔清洗器压接在 针导管上，流入清洗液1ml左右（4）使用缓冲盐后，用水清洗流路和针孔（5

25、）清洗液可能反喷，因此注射器应慢慢 地推压进样口清洗器手柄组件针导管针管 手动进样器手动进样器定子定子转子转子针头密封垫针头密封垫弹簧弹簧不锈钢套不锈钢套操作注意点：1）进样时，进样针应插到底2）不使用时将针头留在进样器内3）进样应使用液相色谱专用平头进样针4）样品溶液pH小于10, 常用密封垫的Vespel材质，适用pH2.0) 相应较高的柱效；b) 第一个峰的保留值最好至少等于1；c) 分离时间在20分钟内 更短；案例案例 1 1在最开始时如何制定方法开发方案在最开始时如何制定方法开发方案?使用两个重要参数改变选择性以提高分离度使用两个重要参数改变选择性以提高分离度 流动相和键合相流动相和

26、键合相键合相键合相(提供多种最优化方法的可能提供多种最优化方法的可能) 很多种选择C18 C8, Phenyl, CN等 C18-aq 柱可以用于100%水相的流动相体系 选择新的色谱柱得到更好的峰形流动相流动相(改变的第一选择，因为最易行改变的第一选择，因为最易行) 流动相 有机相(乙腈, 甲醇等) 流动相 pH 在一个更宽的pH范围 有时会是pH 1-12好的液相色谱柱所应具备的性能好的液相色谱柱所应具备的性能p好的峰形好的峰形尤其对于碱性化合物,可以不加额外的流动相添加剂 减小拖尾因子以提高分离度和定量准确性p高的柱效高的柱效 1.8um, 3.5um和5um，不同的颗粒粒径可以满足任何

27、分离的柱效要求柱效N 采用柱效进一步优化分离度p好的选择性好的选择性 C18是最受欢迎的键合相，且适用于大部分化合物的分离 C8 是在C18之后的受欢迎的键合相在较宽的流动相范围内均可使用p简化方法开发简化方法开发p适于更多的应用适于更多的应用出色的重现性 不同批次的色谱柱都有很好的重现性好的使用寿命 至少能分析1000 个样品案例案例 2 2ZORBAXEclipsePlus色谱柱色谱柱改进所带来的好处改进所带来的好处:更好的峰形 对于大部分的碱性化合物 对于大部分的流动相无需额外的添加剂 与其它色谱柱相比对于除了碱性化合物之外的样品同样也有更好的峰形和更好的柱效 酸碱混合物 中性化合物案例

28、案例 3 3案例案例 4 4流动相的调整流动相的调整“秘诀秘诀”秘诀秘诀2 2秘诀秘诀3 3秘诀秘诀1 1由强到弱由强到弱一般先用一般先用90%的的乙腈乙腈(或甲醇或甲醇)/水水(或缓冲溶液或缓冲溶液)进进行试验，这样可行试验，这样可以很快地得到分以很快地得到分离结果，然后根离结果，然后根据出峰情况调整据出峰情况调整有机溶剂有机溶剂(乙腈或乙腈或甲醇甲醇)的比例。的比例。三倍规则三倍规则每减少每减少10%的有的有机溶剂机溶剂(甲醇或乙甲醇或乙腈腈)的量，保留因的量，保留因子约增加子约增加3倍，此倍，此为三倍规则。这为三倍规则。这是一个聪明而又是一个聪明而又省力的办法。调省力的办法。调整的过程中

29、，注整的过程中，注意观察各个峰的意观察各个峰的分离情况。分离情况。粗调转微调粗调转微调分离达到一定程分离达到一定程度，应将有机溶度，应将有机溶剂剂10%的改变量的改变量调整为调整为5%，并据，并据此规则逐渐降低此规则逐渐降低调整率，直至各调整率，直至各组分的分离情况组分的分离情况不再改变。不再改变。秘诀秘诀4 4更换流动相的组更换流动相的组成成在第三步，基本上在第三步，基本上可得到了一个合适可得到了一个合适的保留因子，如果的保留因子，如果还有一些组分的分还有一些组分的分离情况不好，则应离情况不好，则应考虑更换流动相的考虑更换流动相的组成组成(如有机溶剂类如有机溶剂类型、型、pH值的改变或值的改

30、变或加入离子对试剂等加入离子对试剂等)Propranolol心得安心得安-阻滞剂阻滞剂(-blocker)Pindolol心得静心得静案例案例 5 5Dipyridamole双嘧达莫双嘧达莫 血管扩张药物血管扩张药物(Vasodilator)Disopyramide达舒平达舒平抗心律不齐药物抗心律不齐药物(Anti-arrhythmic)Diltiazem合心爽合心爽钙通道阻滞剂钙通道阻滞剂(Ca+channelblocker)总原则：总原则： 中性化合物无需调整流动相的中性化合物无需调整流动相的pHpH值；而对于含有带值；而对于含有带电基团的化合物，则需要用缓冲溶液调整流动相的电基团的化合物

31、，则需要用缓冲溶液调整流动相的pHpH值；值；有时需要采用离子对反相色谱有时需要采用离子对反相色谱！案例案例 6 6案例案例 7 7案例案例 8 8出峰出峰顺序顺序不同不同液相色谱常见问题及其解决方法液相色谱常见问题及其解决方法色谱问题的可能根源色谱问题的可能根源流动相进样器在线过滤器色谱柱检测器样品泵保护柱连接管线及接头软件其它偶然因素学会逻辑判断学会逻辑判断-将会节省解决问题的时间！将会节省解决问题的时间！解决色谱问题的策略解决色谱问题的策略色谱柱保护柱流动相样品/样品瓶问题泵进样器检测器数据采集谱带展宽/连接最易发生故障最易发生故障！判断故障与故障排除的原则判断故障与故障排除的原则n规则

32、一规则一: : 确认问题至少发生两次以上。如果问题不重确认问题至少发生两次以上。如果问题不重复出现，很难证实其确实是问题复出现，很难证实其确实是问题n规则二：规则二：从最简单的因素入手从最简单的因素入手n规则三：规则三：一次只变化一个因素，以使你能够确认所变一次只变化一个因素，以使你能够确认所变因素与问题之间的关联因素与问题之间的关联n规则四规则四: : 恢复原状。如果使用更换组件方法来查找问恢复原状。如果使用更换组件方法来查找问题之所在，完毕后应将原有完好组件安装回原处。否则，题之所在，完毕后应将原有完好组件安装回原处。否则，换下的组件将来很难再利用，会造成浪费换下的组件将来很难再利用，会造

33、成浪费n规则五规则五: :养成记录的好习惯。一个完整的好记录是成功养成记录的好习惯。一个完整的好记录是成功地进行故障排除的关键地进行故障排除的关键HPLC中常见问题分类中常见问题分类H P LC系统压力问题 压力高 压力低或没有压力 压力不稳流路基线噪音问题 基线不稳定(不重复) 长、短程振荡 基线漂移 噪音脉冲尖刺关于色谱系统的反压关于色谱系统的反压什么是反压(back pressure) 流动相流经管路及色谱柱时会有阻力，即所谓的反压，又称系统反压或系统压力 常用单位有:Psi,Bar,Mpa(1Bar=0.1Mpa=14.5Psi)影响系统反压的主要因素: 流动相的溶剂组成 温度 流速反

34、压与溶剂组成的关系反压与溶剂组成的关系流动相的粘度是产生反压的主要原因有机溶剂一水的粘度随组成而改变其压力随组成变化如下图所示反压与流速的关系反压与流速的关系流速对反压的影响是线性关系流速增加，反压亦增大下图的实验条件:2 .1 x 30mm Symmetry C18柱，20 反压与温度的关系反压与温度的关系温度对反压的影响是反比关系温度升高，反压降低，对某些流动相的影响更大一些影响系统反压的其他因素影响系统反压的其他因素反压与色谱柱长度成正比反压与填料颗粒度的平方成反比2.5m填料比3.5m填料反压高反压与管路直径的四次方成反比(1/D4)反压与管路的长度成正比HPLC系统压力问题分析（系统

35、压力问题分析（1）问题:系统压力高可能的原因:温度太低流速太高流动相粘度大管路堵塞仪器或色谱柱堵塞压力传感器问题HPLC系统压力问题分析（系统压力问题分析（2）问题:压力低或没有压力可能原因:温度太高;流速太低泵关闭或保险丝断了泵未输送流动相系统内有渗漏处所用溶剂不正确自动进样器在Purge时卡住储液瓶中无溶剂低压限设置不当泵未正确排气溶剂入口过滤头堵入口管路中有空气泵失效压力传感器问题问题:压力不稳可能原因:泵排气不充分泵失效流动相未正确脱气所用溶剂不混溶或易挥发HPLC系统压力问题分析（系统压力问题分析（3）HPLC流路基线噪音问题流路基线噪音问题基线不稳定(不重复)p检测池中有大的气泡p

36、流路中有小气泡流过p系统未稳定或未达到化学平衡p流动相被污染p检测器流动池漏p色谱柱污染Time (min.)HPLC流路基线噪音问题流路基线噪音问题基线漂移u系统不稳或未化学平衡u温度波动u流动相未正确脱气u流动相被污染;流动相中有稳定剂或稳定剂变化u检测器流动池漏;系统中有渗漏u色谱柱污染;固定相渗漏u选用不正确的检测波长(相对于溶剂)u有迟流出的组分Time (min.)HPLC流路基线噪音问题流路基线噪音问题短程振荡 泵压不稳 泵入口管松，弯或堵塞 溶剂混合不充分 检测池中有大气泡 泵入口阀脏或失效 泵柱塞杆密封垫磨损 检测器出口溶液成滴状流入废液瓶HPLC流路基线噪音问题流路基线噪音

37、问题长程振荡 温度波动 溶剂被循环通过系统噪音脉冲尖刺 流路中有小气泡 泵头有气泡空腔 入口阀脏或失效 检测池中有小颗粒物 泵或检测器未正确接地无规律基线噪音无规律基线噪音n气泡-流动相脱气n气体滞留在检测器中 流动相脱气 对检测池加一定的反压n泄漏-修复泄漏，更换接头n混合问题-增加系统体积n管线阻塞 疏通管线，冲洗系统n电问题 改变电路，去除根源有规律基线噪音有规律基线噪音几乎都由色谱泵引起泵头中有气泡-做泵排气并重做溶剂脱气单向阀脏或失效-清洗或更换之柱塞杆密封垫漏液-更换柱塞杆损坏-更换混合问题-增加系统体积电噪音-改变电路，去除根源色谱图常见问题分类色谱图常见问题分类色谱图常见问题主

38、要有三类色谱峰峰形异常问题 例如负峰，宽峰，肩峰，双峰，峰形不对称等色谱图中多峰少峰问题 色谱图末出峰，出峰比预想的多等色谱峰保留时间问题 保留时间不稳定等色谱图峰形问题色谱图峰形问题HPLC最常见的问题表明目前状况并未得到最佳的色谱柱性能变形的色谱峰会导致:积分不准分离度不佳灵敏度下降色谱图峰形问题示例色谱图峰形问题示例色谱峰形问题的来源色谱峰形问题的来源色谱柱毁坏溶解样品的溶剂不当第二种相互作用色谱柱过载u质量过载u体积过载其它柱外效应u管路连接u采样速率u时间常数色谱柱状态色谱柱状态机械因素机械因素良好填装的色谱柱良好的色谱结果良好的色谱结果表明:系统、色谱柱、连接状况皆良好填装良好的色

39、谱柱峰形问题：色谱柱坍塌峰形问题：色谱柱坍塌色谱柱填料坍塌（产生死体积）色谱柱填料坍塌（产生死体积）可能的原因: 振动使柱床破坏 高pH流动相使填料颗粒溶解所有的峰都变形!正常双峰色谱峰形欠佳的其他原因色谱峰形欠佳的其他原因色谱峰形问题:展宽且拖尾的色谱峰p色谱柱进口过滤器色谱柱进口过滤器( (筛板筛板) )部分阻塞部分阻塞解决办法：卸下接头解决办法：卸下接头p在线过滤器污染在线过滤器污染解决办法：更换筛板解决办法：更换筛板p保护柱污染保护柱污染解决办法：更换保护柱或柱芯解决办法：更换保护柱或柱芯所有色谱峰都变形所有色谱峰都变形化学问题：溶解样品的溶剂不当化学问题：溶解样品的溶剂不当部分色谱峰

40、形不正常部分色谱峰形不正常由于第二种相互作用的发生，使碱性物质峰形拖尾酸性及中性物质峰形对称碱性物质峰形拖尾碱性物质峰拖尾碱性物质峰拖尾不同品牌色谱柱的硅醇基活性的差异pH因素拖尾是由什么引起的？拖尾是由什么引起的？混合型保留机理-第二种相互作用p与键合相的疏水作用与键合相的疏水作用p与硅胶带电点的离子交换作用与硅胶带电点的离子交换作用缓冲液的缓冲液的pH与拖尾与拖尾色谱峰形异常问题分析（色谱峰形异常问题分析（1）所有的峰均为负峰信号电缆接反或检测器输出极设置颠倒光学装置尚未达到平衡一个或几个峰是负峰流动相吸收本底高进样过程中进了空气离子对分离中的系统峰样品组分的吸收(RI或UV)低于流动相负

41、峰色谱峰形异常问题分析（色谱峰形异常问题分析（2）所有的峰都是宽峰系统未平衡或未达到化学平衡溶样的溶剂比流动相强很多色谱柱类型或尺寸不正确色谱柱或保护柱被污染或降级温度变化对色谱柱的影响色谱峰形异常问题分析（色谱峰形异常问题分析（3）较早洗脱的峰呈宽峰进样体积过大或样品浓度太高进样器有问题;定量环(Loop)大小不合适在线过滤器，保护柱，色谱柱或管路堵塞管路问题:内径不对或切管不正确管路连接问题:接头或锥箍不正确检测器时间常数不正确峰展宽峰展宽/浓度（质量）过载浓度（质量）过载当上样量超过一定限度时发生-注意峰起点提前峰展宽峰展宽/体积过载体积过载进样体积对色谱峰形的影响峰展宽峰展宽/体积过载

42、体积过载峰展宽峰展宽/体积过载体积过载连接管线内径对系统谱带展宽的影响过长的管线亦会造成较大的谱带展宽峰展宽峰展宽/柱外谱带展宽柱外谱带展宽柱外扩展增加柱外死体积峰展宽实例：管线内径对柱效的影响峰展宽实例：管线内径对柱效的影响色谱峰形异常问题分析（色谱峰形异常问题分析（4）n色谱峰峰形异常问题:峰比预想的小样品粘度过大进样器有问题或进样体积有误检测器设置不正确，定量环(Loop)体积不正确检测器输出末置零用了不正确的检测器输出信号检测池被污染检测器的灯可能有问题色谱峰峰形异常问题:双峰或肩峰进样量或样品浓度过大保护柱或色谱柱进口堵塞保护柱或色谱柱污染或失效前伸峰进样量或样品浓度过大溶样的溶剂相

43、对于流动相太强保护柱或色谱柱污染或失效色谱峰形异常问题分析（色谱峰形异常问题分析（5）双峰前伸色谱峰形异常问题分析（色谱峰形异常问题分析（6）色谱峰峰形异常问题:平头峰检测器设置不正确进样体积太大或样品浓度太高拖尾峰保护柱或色谱柱问题:污染或失效进样问题检测器时间常数不正确色谱图多峰少峰问题分析（色谱图多峰少峰问题分析（1）色谱图中未出峰进样问题:未进样或样品分解流动相问题:泵未输液或流动相不正确检测器设置不正确，或检测器有问题色谱图中出峰比预想的少样品分解色谱柱柱效丧失用错流动相梯度洗脱时平衡不足(例如;过早将手动进样器扳至Load位置)色谱图多峰少峰问题分析（色谱图多峰少峰问题分析（2）色

44、谱图中出峰比预想的多(鬼峰)样品分解或制样时导入了杂质流动相被污染，或用错流动相流动相中含有稳定剂或稳定剂发生变化前次进样的后流出物(某些Rt值特别大的组分)进样器被污染，洗针系统出问题或注射器脏未充分平衡进样器Loop管保护柱脏，色谱柱被污染，分辨率下降20% - 100% MeOH梯度洗脱没有进样鬼峰没有进样就有色谱峰出现。原因流动相脏601530150371517额外的色谱峰额外的色谱峰污染物来源:样品，样品瓶，瓶垫等额外的色谱峰额外的色谱峰额外的色谱峰额外的色谱峰色谱峰保留时间问题分析（色谱峰保留时间问题分析（1）保留时间飘忽不定(各次运行之间)系统不稳定或未达化学平衡泵压力不稳(泵头

45、里有气泡)进样体积过大或样品浓度过大温度波动流动相混合不均匀色谱柱被污染色谱峰保留时间问题分析（色谱峰保留时间问题分析（2）保留时间增加或减少(各次运行之间)系统不稳定或化学平衡不足泵流速变化温度变化色谱柱污染，柱效下降流动相被污染溶剂入口过滤器堵或管路堵塞系统渗漏色谱峰保留时间问题分析（色谱峰保留时间问题分析（3）保留时间改变到一个新的恒定值流动相不正确或其组成不正确泵流速变化实际输液的流速不正确(泵失灵或故障)环境温度变化;柱温不正确色谱柱尺寸或类型不正确色谱柱被污染流动相含有稳定剂或稳定剂发生变化输液系统的梯度滞后体积不正确反相色谱：保留时间与反相色谱：保留时间与pH的关系的关系非离子化状态会造成更多的保留，中性物质的保留与pH无关保留时间的重现性：保留时间的重现性：pH的影响的影响化学因素化学因素中性物质:无影响酸性物质:pH增加，保留降低碱性物质:pH增加，保留增加0.1 pH的变化会导致高达10%的保留时间变化。(pH在pKa1之内保留时间变化最大)pH稳定区域：方法稳定性更好稳定区域：方法稳定性更好