ATP生物发光检测方法

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1、ATP生物发光检测方法 ATP生物发光技术以生物体内的ATP作为检测对象，不仅包括细菌（大肠杆菌，沙门氏菌，志贺氏菌等），也包括体细胞在内的食品残渣等食品污染物，因此适合在食品卫生检测领域对卫生状况进行快速检测。 ATP生物发光检测方法具有检测速度快、成本低、易于操作等特点 检测原理ATPATP即即三磷酸腺苷三磷酸腺苷，是广泛存在于生物体内的一种能量物，是广泛存在于生物体内的一种能量物质质 检测检测ATPATP含量的一种方法是用含量的一种方法是用荧光光度计法荧光光度计法，生物发光是，生物发光是活细胞在活细胞在荧光素酶荧光素酶催化下发出的荧光，目前使用的荧光素催化下发出的荧光，目前使用的荧光素酶

2、来源于北美的萤火虫，相对分子质量为酶来源于北美的萤火虫，相对分子质量为6200062000的蛋白质的蛋白质萤火虫荧光素酶简称萤火虫荧光素酶简称虫光素酶虫光素酶，是一种能将化学能转变为，是一种能将化学能转变为光能的活性蛋白质，即生物催化剂。光能的活性蛋白质，即生物催化剂。ATPATP在虫光素酶的催在虫光素酶的催化作用下，与荧光素在有氧环境及二价镁离子作用下，反化作用下，与荧光素在有氧环境及二价镁离子作用下，反应释放出荧光。当荧光素及虫光素酶过量情况下，释放的应释放出荧光。当荧光素及虫光素酶过量情况下，释放的荧光与荧光与ATPATP在一定范围内成线性关系，因此可以通过测量在一定范围内成线性关系，因

3、此可以通过测量荧光光强荧光光强检测样品中的检测样品中的ATPATP，进而检测其中的细菌总数。，进而检测其中的细菌总数。优点目前生物荧光反应法被广泛用于食品加工条件的快速评价和食品中微生物的快速检测，同时在HACCP管理中也被广泛用于关键控制点检测，与传统检测方法不同之处在于几分钟内可获得结果，而且荧光光度计是便携式的，使用方便，适合现场检测，不仅可以检测微小的污染物水平，还能检测食品加工设备及其表面的清洁程度。 检测仪器结构原理主要有三部分：自动进样单元、光电转换单元和信号采集处理及控制单元 其中，自动进样单元包括三套其中，自动进样单元包括三套蠕动泵蠕动泵 。根据测试需要，。根据测试需要，蠕动

4、泵在控制单元控制下，向光电转换单元中的蠕动泵在控制单元控制下，向光电转换单元中的样品池样品池加加入对应反应试剂。光电转换单元包括入对应反应试剂。光电转换单元包括检测样品池检测样品池和和光电转光电转换器件换器件。为消除外界光的干扰，整个光电转换单元被密封。为消除外界光的干扰，整个光电转换单元被密封在暗盒中。光电转换器件将反应释放荧光转化为电信号，在暗盒中。光电转换器件将反应释放荧光转化为电信号，由信号采集处理单元采集并处理，并对测试结果进行实时由信号采集处理单元采集并处理，并对测试结果进行实时显示和存储。显示和存储。 实验选择标准ATP样品作为检测对象，浓度范围为10-610-14molL，实验

5、中所用荧光素及荧光素酶购自美国普洛麦格公司。实验采用联机测量方式，将本检测仪与计算机通过。RS232接口相连接，仪表信号采集单元采集荧光信号后直接上传至计算机并将测试结果实时显示。测量结果如图4所示。图中各响应曲线图中各响应曲线400 s400 s内的测量值进行积分，作为各浓度内的测量值进行积分，作为各浓度样品的输出信号。输出信号与浓度的关系如图样品的输出信号。输出信号与浓度的关系如图5 5所示。由所示。由图可以看出，输出信号随浓度增加而增加，且有明显梯度，图可以看出，输出信号随浓度增加而增加，且有明显梯度，两者的线性相关系数达到两者的线性相关系数达到0.9860.986。这一结果说明本检测系

6、。这一结果说明本检测系统可以对统可以对ATPATP浓度进行快速检测。由于细菌细胞中所含浓度进行快速检测。由于细菌细胞中所含ATPATP含量基本一致，因此，本检测仪可实现对细菌总数的含量基本一致，因此，本检测仪可实现对细菌总数的现场快速检测。现场快速检测。在反应中，加入发光反应试剂时，体系中样品浓在反应中，加入发光反应试剂时，体系中样品浓度相对较高，因此在短时间内即迅速反应释放大度相对较高，因此在短时间内即迅速反应释放大量荧光，此时荧光光强较强，因此测量结果可能量荧光，此时荧光光强较强，因此测量结果可能会超出系统的测试量程。由于本仪表的最大输出会超出系统的测试量程。由于本仪表的最大输出电压为电压

7、为2500 mV2500 mV，反应初期释放的荧光可能会超，反应初期释放的荧光可能会超出该范围，在图中表现为前端的水平直线。随着出该范围，在图中表现为前端的水平直线。随着反应进行，体系中样品和试剂的浓度逐渐降低，反应进行，体系中样品和试剂的浓度逐渐降低，所释放荧光随之逐渐衰减。由图可见，不同样品所释放荧光随之逐渐衰减。由图可见，不同样品浓度的浓度的ATPATP随反应进行，进入测量量程的时间不随反应进行，进入测量量程的时间不同，同，浓度越高，衰减越慢，进入测量量程的时间浓度越高，衰减越慢，进入测量量程的时间越长，反之越短。越长，反之越短。该检测仪在对现有产品进行分析的基础上，选。该检测仪在对现有

8、产品进行分析的基础上，选择择H5773-02H5773-02光电倍增管光电倍增管作为光电转换器件，其检作为光电转换器件，其检测波长与生物发光反应所释放荧光波长一致，可测波长与生物发光反应所释放荧光波长一致，可有效有效提高检测灵敏度提高检测灵敏度。采用采用自动加样自动加样技术，在暗室内加入发光反应试剂，技术，在暗室内加入发光反应试剂，消除了外界光的干扰，且获得了反应最初的信号。消除了外界光的干扰，且获得了反应最初的信号。将检将检测仪与计算机连接测量测仪与计算机连接测量，获得了各反应所释，获得了各反应所释放荧光强度的时间响应曲线。放荧光强度的时间响应曲线。本设计的针对细菌总数的检测仪具有本设计的针对细菌总数的检测仪具有检测速度快、检测速度快、自动化程度高、操作简单、小型便携自动化程度高、操作简单、小型便携等特点，在等特点，在口岸、卫生监管部门、食品生产部门等对产品、口岸、卫生监管部门、食品生产部门等对产品、环境等的卫生状况进行现场快速检测领域具有很环境等的卫生状况进行现场快速检测领域具有很好的应用前景。好的应用前景。