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1、实验五实验五DNADNA限制性限制性酶切酶切和和琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶电泳电泳 1限制性内切酶限制性内切酶2EcoR I Restriction Enzyme识别序列：识别序列： -GAATT C - - C TTAAG -3BamH I Restriction Enzyme识别序列：识别序列： - GGATC C - - C CTAGG -4Hind III Restriction Enzyme识别序列：识别序列： - AAGCT T - - T TCGAA - 5每一种限制性内切酶都有特定的反应条件：每一种限制性内切酶都有特定的反应条件： pH范围：范围： 7.58.0 缓冲液组份缓冲液组份
2、: Tris(三羟甲基氨基甲烷）、三羟甲基氨基甲烷）、 NaCl、 MgCl2、 巯基试剂（巯基乙醇、二硫苏糖醇）巯基试剂（巯基乙醇、二硫苏糖醇） 温育温度：温育温度：376反应体系：反应体系： DNA (1ug或更少或更少) 5ul 10 x Buffer 2ul Restriction Enzyme 3ul H2O 10ul Total 20ul混匀，混匀，37度保温度保温30分钟分钟7琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是一种简便、快速、最是一种简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法。常用的分离纯化和鉴定核酸的方法。8电电 泳泳 在一个电场的作用下，在某种支持在
3、一个电场的作用下，在某种支持介质上，能将一个混合物分离成若干条介质上，能将一个混合物分离成若干条区带（若干个组分）的过程。区带（若干个组分）的过程。9电泳法的优点电泳法的优点凡是能带电的物质，都可以用电泳法分离。凡是能带电的物质，都可以用电泳法分离。凡是能带电的物质，都可以用电泳法分离。凡是能带电的物质，都可以用电泳法分离。样品用量少。样品用量少。样品用量少。样品用量少。设备简单。设备简单。设备简单。设备简单。可在室温进行。可在室温进行。可在室温进行。可在室温进行。操作简便，费时不多操作简便，费时不多操作简便，费时不多操作简便，费时不多不同类型的电泳，有不同的用途。不同类型的电泳，有不同的用途
4、。不同类型的电泳，有不同的用途。不同类型的电泳，有不同的用途。改改改改进进进进或或或或找找找找到到到到更更更更好好好好的的的的支支支支持持持持介介介介质质质质，就就就就有有有有可可可可能能能能大大大大大大大大地地地地提高分辩率。提高分辩率。提高分辩率。提高分辩率。101112 琼脂糖是一种线性多糖聚合物。将琼脂糖粉末加热到熔点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质。琼脂糖13琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围琼脂糖浓度(%)线型DNA分子的分离范围(Kb)0.35600.61200.70.8100.90.571.20.961.50.2312.00.1214试剂试剂TBE电泳缓冲液电泳缓冲液45mmol
5、/L Tris-硼酸，1mmol/L EDTA，pH 8.0加样缓冲液加样缓冲液 0.25%溴酚蓝，40%蔗糖EB（溴化乙锭）染色液（有毒）（溴化乙锭）染色液（有毒） 1ug /ml，用1TBE配制15Blue / Orange 6 x Loading Dye组成组成10% Ficoll 4000.25% bromophenol blue（深蓝色）（深蓝色）0.25% xylene cyanlo FF （天蓝色）（天蓝色）0.4% orange G （黄色）（黄色）10mol/L Tirs-HCl (pH7.5), 50mol/L EDTA使用量使用量 5份份DNA溶液加溶液加1份份Blue
6、/ Orange 6xLoading Dye16溴化乙锭(ethidium bromide，EB)EB是一种荧光染料，其扁平分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。在电泳后，将凝胶浸入浓度为 0.5ug/ml的EB溶液中染色1015min。琼脂糖凝胶经EB染色后，在紫外光照射下，可见核酸电泳带，DNA量一般5ng。17操作步骤操作步骤18酶切反应酶切反应反应体系：反应体系： DNA 5ul 10 x Buffer 2ul Hind III 3ul H2O 10ul Total 20ul混匀，混匀，37度保温度保温30分钟分钟19电泳前的准备工作电泳前的准备工作 准备内容准
7、备内容作用作用1.刷干净电泳制胶的梳子，板子，槽子，用蒸馏水洗净晾干防止不必要的重复污染，减少外来的污染。梳子干净有利于梳孔的形成。2.检查电泳槽，根据情况决定是否更换buffer。排除电泳槽的电极接触不良，确保buffer的缓冲能力，减少污染。3.根据DNA的分离范围选择合适的胶浓度并记录达到较好的分离效果4.计算agarose的用量和制胶 buffer的用量记录。实验记录备查20制胶制胶步骤步骤步骤步骤注意事项注意事项注意事项注意事项1.称量agarose和加入bufferBuffer不要用成蒸馏水，称量相对准确2.融胶。加热到胶产生大量的气泡时，拿出摇匀，继续加热到完全溶解，拿出摇匀。小
8、心烫手，注意不要加热过度使胶冲出瓶子。保证胶混匀和完全溶解，减少可能因此引起的胶中孔径不均匀影响分离效果。3.封边和倒胶。使胶冷却到60度左右，即手可以握住瓶子的温度，先用少量的凝胶封边，再沿着制胶板的一侧，缓缓地将凝胶一次性倒入。制胶的桌面相对水平。4.室温凝胶30分钟过程中不要碰到梳子，尽量保持胶的位置不移动。时间不宜过久，导致胶干燥变形；不宜过短，影响胶内部孔径形成。5.拔梳子，放入电泳槽。缓缓地将梳子垂直从梳孔拔出，尽可能使梳子是同时从各个胶孔拔出的。暂时不用的胶最好放入电泳槽电泳液中浸泡。电泳液要浸没胶至少1mm。21上样和电泳步骤步骤注意事项注意事项1.样品中加入loading b
9、uffer使其终浓度为1 X，混匀Loading buffer浓度不宜过低，点样时样品不能很好的沉在胶孔里；不宜过高，电泳时容易形成带形的变形。注意混匀。2.点样匀速加入。避免碰坏胶孔。枪头不要吸气泡，拔起时不要猛带出样品。每点一个样完，吸取buffer洗枪头，避免样品混杂。加样的速度在保证质量的前提下越快越好。点样的量不要太大，点样量过大不仅容易溢出污染邻位样品，而且容易导致DNA条带脱尾和模糊不清。3.接通电源，选择合适的电压和时间电泳。胶孔与电极成水平状态，防止样品跑歪。经常检查，防止样品跑出胶等意外发生。22染色和成像染色和成像步骤步骤注意事项注意事项1.染色用0.5ug/ml的EB溶
10、液浸染1015分钟。2.调整镜头的拍摄范围和焦距，成像3.保存或打印照片做分析记录23点点 样样在在DNA样品中加入样品中加入 Loading Dye混匀。混匀。 Sample 1：取自提DNA 5ul +2ul Loading Dye Sample 2: -DNA / Hind III 20ul +4ul Loading Dye 用加样器吸取样品点入点样孔：用加样器吸取样品点入点样孔： Sample 1：7ul Sample 2: 15ul24 9 8 7 6 5 4 3 2 1 9 8 7 6 5 4 3 2 1 点样前先点样前先安排好各点样安排好各点样孔的样品，做孔的样品，做好纪录，然后
11、好纪录，然后依次从依次从右下角右下角开始按顺序点开始按顺序点样。样。提提 示示25电电 泳泳接通电源，200v恒压电泳1小时。26染色和观察染色和观察切断电源，取出胶模，切断电源，取出胶模，将凝胶置入将凝胶置入EB染色液中染色液中染色染色10-15分钟。分钟。取出凝胶，置于紫外灯取出凝胶，置于紫外灯下观察下观察DNA电泳带型。电泳带型。27警告警告胶染色和观察时一定要带手胶染色和观察时一定要带手套！套！28EB（溴化乙锭）（溴化乙锭）诱变！诱变！29 1 2 3 4 RNA提提 示示 将凝胶旋将凝胶旋转转180o，置于，置于紫外灯下观察紫外灯下观察DNA电泳带型。电泳带型。1 自提自提DNA2
12、-DNA / Hind III 3-DNA 30结果记录与分析结果记录与分析绘制电泳图谱绘制电泳图谱31-DNA / Hind III Markers-DNA / Hind III Markers 是利用是利用EcoR I 彻底降解彻底降解-DNA 后再进行内切酶的灭活后再进行内切酶的灭活处理和乙醇沉淀制备的。处理和乙醇沉淀制备的。贮藏缓冲液：贮藏缓冲液： 10mmol/L Tris-HCl (pH7.5), 10mol/L NaCl, 1mol/L EDTA32-DNA / Hind III Markers片段大小（片段大小（ bp）和电泳带型示意图）和电泳带型示意图点样孔点样孔231309416655743612322202733
